裂葉蕁麻醇提物體外抗氧化及α-葡萄糖苷酶抑制作用的研究

楊文娟，何亞娟，毛跟年，胡媛，侯景龍，馬養(yǎng)民，龔頻

（1.陜西科技大學食品與生物工程學院，陜西西安710021；2.陜西科技大學化學與化工學院，教育部輕工助劑化學與技術重點實驗室，陜西西安710021）

裂葉蕁麻（Urtica fissa Pritz.）為被子植物門蕁麻科（Urticaceae）蕁麻屬（Urtica Linn.）植物，該屬植物在國內(nèi)外廣泛分布[1]，研究發(fā)現(xiàn)蕁麻植株含有α 亞麻酸、亞油酸、葉黃素、β-胡蘿卜素、蛋白質(zhì)、維生素C、鈣、硒及多種人體必需氨基酸，因此，其嫩莖葉常作為野生蔬菜用來涼拌、炒蛋、做湯等，具有極高的營養(yǎng)價值[2]。此外，蕁麻屬植物含有黃酮、木脂素、萜類、甾醇、多酚[3]等多種次生代謝產(chǎn)物，藥理研究表明，其具有抗炎抗風濕、鎮(zhèn)痛、抗氧化、降糖降脂、抗前列腺增生、抗腫瘤等活性[4]。

氧化損傷由生物體內(nèi)自由基過量堆積引發(fā)，是導致生物衰老及誘發(fā)Ⅱ型糖尿病等相關代謝性疾病的重要原因[5-6]。具有抗氧化活性的物質(zhì)可有效清除體內(nèi)多余自由基，減少由活性物質(zhì)引起的細胞氧化損傷，防止多種疾病的發(fā)生[7]。α-葡萄糖苷酶是位于小腸黏膜細胞刷狀緣內(nèi)的一組水解酶，其主要作用是促進腸道食物中碳水化合物如淀粉、蔗糖、麥芽糖等分解成單糖，從而引起餐后血糖升高。抑制α-葡萄糖苷酶的活性可以減少單糖的生成，從而降低餐后血糖[8]，通過對α-葡萄糖苷酶抑制活性的檢測，可以初步判斷藥物有無降糖活性。

目前，已有文獻報道蕁麻屬狹葉蕁麻（Urtica angustifolia L.）、異株蕁麻（Urtica dioica L.）的體外抗氧化[9]和降糖作用[10-11]，而裂葉蕁麻的研究主要集中于化學成分[12]，體外抗氧化及α-葡萄糖苷酶抑制活性研究鮮有報道。本研究通過測定裂葉蕁麻醇提物對DPPH 自由基、羥基自由基的清除率及總還原力來評價其體外抗氧化能力，通過α-葡萄糖苷酶抑制作用的研究評價其對血糖的調(diào)節(jié)能力，以期為裂葉蕁麻的進一步開發(fā)利用提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

裂葉蕁麻原植物于2018 年8 月采自陜西省旬陽縣，經(jīng)陜西中醫(yī)藥大學顏永剛教授鑒定為蕁麻科裂葉蕁麻（Urtica fissa.Pritz.），植物標本保存于陜西科技大學藥物制劑實驗室。將裂葉蕁麻全株陰干，置陰涼通風處存放。

無水乙醇、磷酸二氫鈉（NaH2PO4）、抗壞血酸（VC）、硫酸亞鐵（FeSO4）、水楊酸、30 %過氧化氫（H2O2）、鐵氰化鉀（K3[Fe（CN）6]）、無水碳酸鈉（Na2CO3）、硝酸鋁（Al（NO3）3）、氫氧化鈉（NaOH）：分析純，天津市天力化學試劑有限公司；亞硝酸鈉（NaNO2）：分析純，天津市東麗區(qū)天大化學試劑廠；對硝基苯-α-D 葡萄糖吡喃苷（純度為 90%，4-Nitrophenyl α-D-glucopyranoside，PNPG）、α-葡萄糖苷酶（23.5 U/mg）：上海源葉生物科技有限公司；二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）、磷酸氫二鈉（Na2HPO4）、三氯化鐵（FeCl3）：分析純，天津市科密歐化學試劑有限公司；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（純度為 99.6 %，1，1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl radical 2，2-Diphenyl-1-（2，4，6-trinitrophenyl）hydrazyl，DPPH）：上海笛醫(yī)生物科技有限公司；三氯乙酸（trichloroacetic acid，TCA）：分析純，上海山浦化工有限公司；蘆丁標準品：純度98.5 %，蘇州天可貿(mào)易有限公司。

1.2 儀器與設備

HH-4 數(shù)顯恒溫水浴鍋：金壇市江南儀器廠；JA26038 電子天平：上海天美天平儀器有限公司；TG16-WS 臺式高速離心機：湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司；XW-80A 渦旋混合儀：海門市其林貝爾儀器制造有限公司；varioskan flash 全波長掃描式多功能讀數(shù)儀：賽默飛世爾科技有限公司（芬蘭）。

1.3 試驗方法

1.3.1 裂葉蕁麻醇提物的制備

參照文獻[13]及預試驗，取裂葉蕁麻干燥莖適量，粉碎，過60 目篩，稱取70 g 粉末，加入1 400 mL70%乙醇，70 ℃回流提取1 h，抽濾，濾渣重復上述步驟2次，合并2 次提取液，濾液于旋轉蒸發(fā)儀減壓濃縮至80 mL，濃縮液60 ℃水浴蒸干，4 ℃冷藏，臨用前配制成所需濃度。

1.3.2 裂葉蕁麻醇提物黃酮含量的測定

1.3.2.1 蘆丁標準曲線的繪制

參照柴鄭[14]的方法進行試驗，分別取配制好的200 μg/mL 的蘆丁標準液 0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL 于10 mL 試管中，用甲醇補足5 mL 后分別加入質(zhì)量分數(shù)為5%的NaNO2溶液0.5 mL，搖勻放置6 min，然后再分別加入質(zhì)量分數(shù)為10%的Al（NO3）3溶液0.5 mL，搖勻放置6 min，最后加入質(zhì)量分數(shù)為4%的NaOH 溶液4 mL，搖勻放置20 min，在500 nm 波長處測定其吸光度。同時分別設立5 支對照管，用于消除測定吸光度時藥物本身背景顏色的影響。以濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標繪制標準曲線。

1.3.2.2 裂葉蕁麻醇提物中黃酮含量的測定

取裂葉蕁麻醇提物0.015 g 于燒杯中加入少量甲醇超聲溶解，溶解后轉移至10 mL 容量瓶中定容，配成1.5 mg/mL 的溶液。采用與制定標準曲線中相同的顯色方法進行顯色，平行測3 次，在500 nm 波長處測定其吸光度值，同樣設置對照管，消除藥物本身顏色的影響。將測得的吸光度帶入回歸方程，計算裂葉蕁麻醇提物中黃酮的含量。

1.3.3 體外抗氧化能力的測定

1.3.3.1 DPPH 自由基清除活性

取DPPH 適量，加無水乙醇溶解配制成50 μg/mL的溶液。通過預試驗確定VC及裂葉蕁麻醇提物濃度均分別為 2、20、60、200、400、800 μg/mL。按范金波等[15]的方法在517nm 處測吸光度，全程嚴格避光操作，每個樣品平行測3 次，按式1 計算DPPH 自由基清除率，并計算IC50。

式中：A對為對照組（100 μLDPPH+100 μL 無水乙醇）吸光度；A樣為樣品（100 μLDPPH+樣品溶液）吸光度；A空為空白組（100 μL 樣品+100 μL 無水乙醇）吸光度。

1.3.3.2 羥基自由基清除率的測定

采用水楊酸比色法測定，參照文獻[16-17]稍作修改進行試驗。

在 96 孔板中依次加入 50 μL 9mmoL/L FeSO4，50 μL 9 mmoL/L 水楊酸-乙醇溶液，50 μL 蒸餾水，50 μL 不同濃度的裂葉蕁麻醇提物溶液，50 μL 8.8 mmoL/L H2O2，在510 nm 處測吸光度，每個樣品平行測3 次。對照管用蒸餾水代替樣品溶液，空白管用蒸餾水H2O2。按式2 計算·OH 自由基清除率，并計算IC50。

式中：A對為對照孔的吸光度；A樣為樣品孔的吸光度；A空為空白孔的吸光度。

1.3.3.3 總還原力的測定

參照許女等[18]的方法，取1 mL 樣品溶液，加入2.5 mL 的 0.2 mol/L 磷酸緩沖液（pH6.6）和 2.5 mL1 %K3[Fe（CN）6]于試管中混勻，50 ℃水浴中反應 20 min，迅速冷卻并加入2.5 mL10%TCA，混勻后3 500 r/min離心10 min，取3 mL 上清液加入0.6 mL0.1%FeCl3混勻，再加3 mL 蒸餾水搖勻，以蒸餾水為空白對照，在波長700 nm 測定吸光度值。吸光度越大，總還原力越強。按式3 計算總還原力。

式中：A樣為樣品組的吸光度；A空為空白組的吸光度。

1.3.4 α-葡萄糖苷酶抑制試驗

分為樣品組、樣品背景組、空白對照組、空白對照背景組，加入的試劑按表1 操作。加入樣品與α-葡萄糖苷酶后37 ℃反應10 min，再加入PNPG（1 mmoL/L）37 ℃反應30 min，最后加入100 μL Na2CO3（1 moL/L）終止液終止反應[19]，在405 nm 波長處測定吸光度。按式4 計算α-葡萄糖苷酶的抑制率，并計算IC50。

表1 裂葉蕁麻醇提物對α-葡萄糖苷酶抑制活性測定的加樣表Table 1 A sample of the determination of α-glucosidase inhibitory activity by the extract of Urtica

式中：A1為樣品背景組吸光度；A2為樣品組的吸光度；A3為空白對照組吸光度；A4為空白對照背景組吸光度。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用origin 8.0 及SPSS 24.0 對數(shù)據(jù)進行分析，結果以均數(shù)±標準誤差表示。

2 結果與分析

2.1 裂葉蕁麻醇提物中總黃酮含量測定結果

以蘆丁的質(zhì)量濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標繪制標準曲線，如圖1 所示。

圖1 蘆丁標準曲線Fig.1 Standrad curve of rutin

由圖1 可知，標準曲線方程為y=10.61x-0.008 6，R2=0.995 5，說明蘆丁在 100 μg/mL～500 μg/mL 質(zhì)量濃度范圍內(nèi)與吸光度具有良好的線性關系。試驗測得裂葉蕁麻醇提物中黃酮的含量為12.09 mg/g。

2.2 裂葉蕁麻醇提物體外抗氧化測定結果

2.2.1 裂葉蕁麻醇提物對DPPH 自由基的清除能力

裂葉蕁麻醇提物對DPPH·的清除率如圖2 所示。

圖2 DPPH 自由基清除能力Fig.2 DPPH·free radical scavenging capacity

由圖2 可知，裂葉蕁麻醇提物（IC50=9.960 μg/mL）對 DPPH 自由基的清除率與 VC（IC50=1.870 μg/mL）的趨勢基本一致。在0～100 μg/mL 范圍內(nèi)裂葉蕁麻醇提物對DPPH 自由基的清除率隨濃度增加的趨勢較快，在100 μg/mL～800 μg/mL 范圍內(nèi)隨濃度增加的趨勢較為緩慢，達到最大值后趨于穩(wěn)定，最大值可達92.76%，VC對DPPH 自由基的最大清除率為98.61%。由此可以看出，裂葉蕁麻醇提物對DPPH 自由基的最大清除率與VC相近，但達到最大清除率時所需濃度是VC的8 倍左右。

2.2.2 裂葉蕁麻醇提物對羥基自由基的清除能力

裂葉蕁麻醇提物對·OH 的清除率如圖3 所示。

圖3 羥基自由基（·OH）清除能力Fig.3 Hydroxyl radical scavenging capacity

由圖3 可知，裂葉蕁麻醇提物（IC50=1.123 mg/mL）對·OH 的清除率與VC（IC50=10.302 μg/mL）的趨勢基本一致。在0～4 mg/mL 范圍內(nèi)對·OH 的清除率隨濃度的增加基本上呈線性關系，在4 mg/mL～10 mg/mL 范圍內(nèi)，對·OH 的清除率隨濃度增加的趨勢較為平緩，最大值可達98.05%，VC對·OH 的最大清除率為97.39%，裂葉蕁麻醇提物對·OH 的最大清除率與VC基本一致，說明裂葉蕁麻醇提物具有較強的·OH 清除能力。

2.2.3 裂葉蕁麻醇提物總還原力測定結果

裂葉蕁麻醇提物的總還原能力測定結果如圖4所示。

圖4 總還原能力Fig.4 The total reducing power

裂葉蕁麻醇提物與VC對Fe3+的還原力結果由圖4可知，在一定范圍內(nèi)裂葉蕁麻醇提物與VC的還原力都是隨著濃度的增加而增加，有一定的量效關系，但是在與VC濃度相同時的還原力為VC的5%左右，可能是由于VC是純凈物，而裂葉蕁麻提取物中所含化學成分較多，除黃酮外的其他成分影響了總還原力。

2.3 裂葉蕁麻醇提物α-葡萄糖苷酶抑制活性測定結果

α-葡萄糖苷酶抑制劑能減少淀粉類分解為單糖的速度，從而降低餐后血糖。裂葉蕁麻醇提物對α-葡萄糖苷酶的抑制作用如圖5 所示。

圖5 裂葉蕁麻醇提取物對α-葡萄糖苷酶的抑制率Fig.5 Inhibitiory effect of extract of Urtica on α-glucosidase

α-葡萄糖苷酶能將淀粉分解為葡萄糖，競爭性抑制其活性可以減少葡萄糖的生成，從而降低血糖值。由圖5 可知，裂葉蕁麻醇提物對α-葡萄糖苷酶的抑制率在0～40 mg/mL 范圍內(nèi)隨濃度的增大而升高，大于40 mg/mL 后抑制率隨濃度上升的較為緩慢。在試驗所選濃度范圍內(nèi)，裂葉蕁麻醇提物對α-葡萄糖苷酶的最大抑制率為59.06%，表明裂葉蕁麻醇提物對α-葡萄糖苷酶有一定的抑制作用，提示裂葉蕁麻醇提物可能有降糖作用。

3 結論

本文測定了裂葉蕁麻醇提物中總黃酮的含量，并對其體外抗氧化作用及對α-糖苷酶的抑制作用進行了研究。經(jīng)測定，裂葉蕁麻醇提物中總黃酮含量為12.09 mg/g，表明醇提物含有一定量黃酮，而已有文獻報導黃酮類化合物具有清除自由基的作用[20-21]。體外抗氧化結果表明，裂葉蕁麻醇提物對DPPH 自由基的最大清除率為 92.76 %，IC50值為 1.123 mg/mL，VC對DPPH·的最大清除率為 98.61%，IC50值為 1.870 μg/mL；裂葉蕁麻醇提物對羥基自由基的最大清除率為98.05%，IC50值為 1.123 mg/mL，VC對·OH 的最大清除率為97.39%，IC50值為 10.302 μg/mL，裂葉蕁麻醇提物與VC的總還原力均隨醇提物濃度的增加而增強。由試驗數(shù)據(jù)可以看出當裂葉蕁麻醇提物濃度升高到一定程度時，對DPPH 自由基及羥基自由基的最大清除率能達到與VC相同的效果，但在相同濃度下，清除率低于VC，總還原力隨著濃度的增加而增加，相同濃度時的還原力為VC的5%左右。α-糖苷酶的抑制作用能夠影響糖代謝，在本研究所選濃度范圍內(nèi)裂葉蕁麻醇提物對α-糖苷酶的最大抑制活性為59.06%，IC50值為31.598 mg/mL。說明裂葉蕁麻有一定的抑制α-糖苷酶的能力。本課題組經(jīng)前期研究表明，裂葉蕁麻對糖尿病小鼠的肝臟及腎臟損傷具有保護作用，對血糖指標也有改善[22-23]，結合體外α-糖苷酶抑制測定結果，說明裂葉蕁麻醇提物具有降糖活性，可能與抑制糖苷酶有關。由此可以看出，裂葉蕁麻醇提物具有一定的抗氧化能力及抑制α-糖苷酶活性的能力，藥效物質(zhì)基礎可能與黃酮類化合物有關，本研究為體內(nèi)的抗氧化及降糖研究提供了理論依據(jù)，為裂葉蕁麻的進一步加工應用提供了新途徑。