結核感染T 細胞檢測在赴美國移民體檢結核感染篩查中的應用

栗召輝 梁武毅 黃永欣 朱云楓 明宏艷 梁少軍 何洪濤 張建明 廣州國際旅行衛(wèi)生保健中心（廣東，廣州，510623）

結核?。╰uberculosis，TB）是一個重要的全球公共衛(wèi)生問題，全球約有20 億人感染結核分枝桿菌，而兒童結核分枝桿菌感染率達到9%［1］。盡管世界各國對結核病采取了有效措施，但兒童結核病多無典型臨床癥狀， 臨床表現(xiàn)與普通感染性疾病不易區(qū)別，導致診斷困難，這也為全球到2035 年消除結核病的戰(zhàn)略目標提出了挑戰(zhàn)［2］。 結核菌素皮試（tuberculin skin test，TST） 是長期以來用以快速診斷結核感染的唯一手段。 然而TST 存在諸多缺陷：在易受結核感染的免疫力低下人群中，其敏感性反而大大降低；在普遍接種卡介苗（BCG）的地區(qū)造成非常高的“假陽性”率［3-4］。 此外，皮試的操作和結果的解釋存在主觀依賴性，降低了檢查的準確性。T-SPOT.TB則是以特異性抗原為刺激源，應用酶聯(lián)免疫斑點技術（enzyme linked immunospot assay，ELISPOT）診斷結核感染的新方法。 使用結核分枝桿菌特異性抗原刺激外周血單個核細胞 （peripheral blood mononuclear cells，PBMC），通過細胞因子γ 干擾素（IFNγ）的分泌檢測抗原特異性T 淋巴細胞的應答反應情況，進而對患者的結核感染狀態(tài)進行判斷。 本研究通過對TST 和T-SPOT.TB 進行比較分析， 旨在探討赴美移民體檢結核病感染篩查中兩種方法的應用價值。

1 對象與方法

1.1 研究對象

按照美國CDC 有關移民人群結核病篩查的技術指導， 對2012 年1 月-2013 年10 月來我中心體檢的2～14 歲移民申請人進行結核篩查。 其中2012年1-12 月共5 388 例申請人采用結構菌素試驗（PPD） 試驗；2018 年1-12 月共3 486 例采用TSPOT.TB 試驗。

1.2 研究方法

1.2.1 PPD 組：在申請人左上肢前臂掌側皮下注射0.1ml PPD 試劑（成都生物制品研究所），于48～72h內測量注射處硬結直徑。 所有結果均由同一組檢測人員判讀。

1.2.2 T-SPOT.TB 組：肝素抗凝管采取5mL 外周靜脈血；分離外周血單個核細胞（PBMCs）；收集外周血單個核細胞（PBMCs）并計數(shù)，配制每100μL 含有25萬個細胞的標準溶液500μL；采用IGRA 試劑盒（上海復星長征醫(yī)學科學有限公司）進行IGRA 檢測；每個測定樣本需4 個檢測孔（空白對照、測試孔A 和測試孔B、陽性質控對照）；加入50μL 細胞培養(yǎng)液至每個空白對照孔內； 加入50μL 抗原A 溶液至每個必要的檢測孔內； 加入50μL 抗原B 溶液至每個必要的檢測孔內； 加入50μL 陽性質控至每個細胞功能控制孔內。 每個樣本使用4 個檢測孔，每個檢測孔加入100μL 細胞終溶液 （含有25 萬個活細胞）；然后在37℃，保持濕潤的含有5%CO2的培養(yǎng)箱中孵育16～20h。 從培養(yǎng)箱中取出培養(yǎng)板，棄去細胞培養(yǎng)液；每個反應孔加入200μL PBS 緩沖液；棄去PBS 緩沖液； 用新鮮的PBS 緩沖液重復洗滌至少3遍； 用PBS 緩沖液200 倍稀釋濃縮標記抗體試劑。每個反應孔加入50μL 標記抗體工作液，2～8℃孵育1h；棄去標記抗體工作液，按上述的步驟洗滌。 每個反應孔加入50μL 底物顯色溶液，室溫孵育7min。用蒸餾水徹底洗滌培養(yǎng)板終止反應； 把培養(yǎng)板放在37℃溫箱干燥4h； 記數(shù)每個反應孔內深藍色清晰的斑點。

1.2.3 PPD 或T-SPOT.TB 陽性的申請人需進一步拍攝胸部后前位數(shù)字X 線片，設備為日本島津公司生產(chǎn)的數(shù)字化X 線攝影系統(tǒng)。

1.3 結果判定

PPD 組：皮下硬結橫徑＜10mm 為陰性；皮下硬結橫徑≥10mm 為陽性。

T-SPOT.TB 組：①當陰性對照孔斑點數(shù)≤5 時，抗原A 孔和/或抗原B 孔斑點數(shù)－陰性對照孔斑點數(shù)≥6 為陽性； 抗原A 孔和抗原B 孔斑點數(shù)－陰性對照孔斑點數(shù)＜6 為陰性。②當陰性對照孔斑點數(shù)≥6 時，抗原A 孔和/或抗原B 孔斑點數(shù)≥2×陰性對照孔斑點數(shù)為陽性； 抗原A 孔和抗原B 孔斑點數(shù)＜2×陰性對照孔斑點數(shù)為陰性。

1.4 統(tǒng)計學處理

應用SPSS16.0 統(tǒng)計軟件，采用卡方檢驗（Chi-Square test）進行統(tǒng)計學分析。 P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 兩組試驗結果比較

5 388 例采用PPD 試驗的2～14 歲移民申請人，陽性530 例， 陽性率為9.84%；3 486 例采用TSPOT.TB 試驗的2～14 歲移民申請人，陽性61 例，陽性率為1.75%， 兩種方法陽性率差異有統(tǒng)計學意義（χ2＝222.666，P＜0.01）。

2.2 X 線結果比較

PPD 試驗陽性的移民申請人中X 光異常者6例，X 光異常發(fā)現(xiàn)率為1.13%（6/530）；T-SPOT.TB試驗陽性的移民申請人中X 光異常者11 例，X 光異常發(fā)現(xiàn)率為18.03%（11/61）， 兩種方法X 光異常發(fā)現(xiàn)率差異有統(tǒng)計學意義 （χ2＝55.930，P＜0.01）（見表1）。

表1 T-SPOT.TB 試驗和PPD 試驗的檢出率（例）

3 討論

我國是全球22 個結核病高負擔國家之一，活動性肺結核的患病率為459/10 萬［5］，其中兒童結核病約占全部結核病的10%［6-7］。 2000 年我國兒童活動性肺結核患病率為91.8/10 萬， 其中痰細菌學檢查陽性的兒童肺結核患病率為12.3/10 萬［8］。 而2016 年我國0～14 歲兒童的結核病患者達到10 萬人左右［9］。 美國CDC 制定的赴美移民體檢指導指出，赴美移民2～14 歲的申請人必需進行（tuberculin skin test，TST） 或γ 干擾素釋放分析結核菌素皮試實驗（interferon-γ release assay，IGRA）試驗來篩查肺結核。 TST 作為長期以來快速診斷結核感染的唯一手段，受卡介苗（Bacillus Calmette-Guerin，BCG）影響較大，在普遍接種BCG 的地區(qū)造成非常高的“假陽性”率，降低了檢查的準確性。自從Lalvani 等［10］首先將ELISPOT（T-SPOT.TB 即為ELISPOT 診斷方法的商品化）用于活動性肺結核的診斷以來，T-SPOT.TB 的應用迅速發(fā)展。 T-SPOT.TB 繼2004 年、2005年在歐洲和加拿大被批準使用后， 美國FDA 也在2008 年完成審批。 T-SPOT.TB 是目前IGRA 診斷結核感染的最主要方法之一。 T-SPOT.TB 以T 細胞免疫應答為基礎的γ-干擾素（γ-IFN）釋放實驗，其原理是結核桿菌感染者外周血單核細胞（PBMC）中存在的特異性T 細胞在受到被RDl 編碼抗原活化后分泌γ 干擾素，后者被微孔板上γ 干擾素抗體結合，通過顯色形成色素沉淀斑點，從而診斷結核感染。

Cruz 等［11］在 對210 名 兒 童 的 前 瞻 性 研 究 中 發(fā)現(xiàn)，診斷為活動性肺結核兒童的T-SPOT.TB 的敏感病為92%，高于TST 的77%。 Lalvani［12］綜合5 項研究總計1 136 例密切接觸者后認為。 T-SPOT.TB 與BCG 接種無明顯相關，提示了更高的特異度，且TSPOT.TB 與結核分枝桿菌暴露程度的相關性優(yōu)于TST，顯示了良好的靈敏度。Detjen 等［13］通過73 名結核患兒觀察TST 和INF-γ 釋放試驗在兒童結核病中的診斷價值， 發(fā)現(xiàn)T-SPOT.TB 的特異度為98%，高于TST 的58%，而兩者的敏感度均為100%。國內張衛(wèi)平等［14］對0～14 歲75 例疑似肺結核患兒用兩種方法對比分析顯示，T-SPOT.TB 靈敏度為80.6%，特異度為89.5%， 假陰性率為19.4%， 假陽性率為10.5%。 在結核病組中，T-SPOT.TB 陽性率顯著高于TST 試驗（80.6% vs 48.4%）。 李明武等［15］對62 名例患兒進行對比分析研究顯示，T-SPOT.TB 試驗診斷兒童結核病的敏感度為90.6%，特異度為96.8%，而且受其它干擾因素的影響較小， 可用于兒童結核病的早期快速診斷。 孫琳等［16］通過對1990-2011 年TSPOT.TB 在兒童結核病和潛伏結核感染診斷篩查中的應用研究進行Meta 分析，結果顯示PPD 試驗因受卡介苗接種的影響，特異度較低；γ-干擾素釋放試驗不受卡介苗接種的影響而具有較高的特異度。 其他研究［17-18］也顯示T-SPOT.TB 檢測能顯著提高結核診斷的靈敏度和特異度，有利于早期診斷和治療。

本次研究結果顯示， 針對2～14 歲的移民申請人，T-SPOT.TB 篩查結核感染的陽性率 （1.75%）明顯低于PPD 試驗的陽性率（9.84%）；而T-SPOT.TB陽性人群中X 光異常檢出率（18.03%）顯著高于PPD陽性人群（1.13%）。 由此可知，T-SPOT.TB 檢測在赴美移民結核篩查中的敏感性和特異性優(yōu)于PPD 試驗。 根據(jù)赴美移民體檢指導的要求，T-SPOT.TB 或PPD 試驗陽性的2～14 歲申請人需進行胸部X 光檢查，而T-SPOT.TB 試驗可以排除BCG 的干擾，降低了假陽性率， 使大量的2～14 歲移民申請人避免了不必要的胸部X 光檢查。

Brodie 等［19］研 究 顯 示，T-SPOT.TB 陽 性 結 果 與肺結核密切接觸史顯著相關， 而TST 陽性結果受BCG 接種影響，T-SPOT.TB 診斷潛伏性結核感染（latent tuberculosis infection，LTBI） 較TST 更加準確。Bakir 等［20］對908 名肺結核接觸者兒童進行了前瞻性研究，T-SPOT.TB 結果為陽性的接觸者中，最終11 名發(fā)展成為活動性結核， 其發(fā)生風險是TSPOT.TB 陰性接觸者的3.86 倍。 而且與TST 相比，以T-SPOT.TB 為標準能夠更加準確地診斷結核感染。 T-SPOT.TB 的斑點數(shù)越多，發(fā)生活動性結核的可能性越大，而且短期內有過結核接觸史的患者TSPOT.TB 的斑點數(shù)較多時更有意義。 Janssens 等［21］研究了T-SPOT.TB 在鑒別潛伏結核和活動性結核中的作用，顯示T-SPOT.TB 的檢測數(shù)值在活動性結核患者中顯著高于潛伏性結核感染人群，但仍難以區(qū)分活動性結核和潛伏性結核感染。 T-SPOT.TB 的斑點數(shù)雖然并不精確地與結核活動程度呈正相關，但仍然存在著結核活動程度越高斑點數(shù)越多的趨勢。 其它研究［22-24］也顯示如果T-SPOT.TB 的斑點數(shù)在短時間內顯著增加， 則強烈提示體內結核活動，有必要給予預防性的治療。 斑點數(shù)的檢測對于結核病的治療也能起到輔助性作用，同時對評估治療效果有較高的應用價值。田建嶺等［25］研究發(fā)現(xiàn)，T 細胞斑點數(shù)的數(shù)量可反映體內的結核分枝桿菌負荷，T細胞斑點數(shù)在活動性TB 患兒中顯著高于LTBI 兒童，但還不能用于區(qū)分兒童活動性TB 與LTBI。

目前國內的研究大多還局限在少數(shù)的疑似結核或確診結核病例，還沒有對大規(guī)模的普通人群進行對比分析研究。 本研究對大量2～14 歲赴美移民申請人的結核篩查情況進行了分析。 赴美移民體檢指導要求，TST 或T-SPOT.TB 試驗陽性而胸部X 光正常的申請人應被指定為LTBI。經(jīng)對比分析本研究也發(fā)現(xiàn)，T-SPOT.TB 試驗較TST 更能準確地診斷LTBI。盡管很多研究結果表明，T 細胞斑點數(shù)還不能明確用于鑒定活動性TB 和LTBI，但T 細胞斑點數(shù)的數(shù)量越多，發(fā)生活動性結核的可能性越大。 我們可以加強T-SPOT.TB 試驗陽性人群的后期隨訪，尤其是活動性肺結核接觸者的隨訪?？傊琓-SPOT.TB在赴美移民結核篩查中的優(yōu)勢明顯優(yōu)于PPD 試驗。本研究的遺憾之處在于， 大多數(shù)人員入境美國后，其隨訪資料無法獲得。