不同麥秸還田模式對(duì)稻田土壤微生物活性和微生物群落組成的影響

王 寧，羅佳琳，2，趙亞慧，李 勇，于建光，2，4*

（1.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)資源與環(huán)境研究所，南京 210014；2.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，南京 210014；3.江蘇省常州市金壇區(qū)土壤肥料技術(shù)指導(dǎo)站，江蘇常州 213200；4.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部江蘇耕地保育科學(xué)觀測(cè)實(shí)驗(yàn)站，南京 210014）

在長(zhǎng)江中下游地區(qū)，稻麥輪作作為典型的種植模式在保障主要糧食供應(yīng)上起著重要的作用，但由于小麥?zhǔn)斋@后秸稈產(chǎn)生量大以及茬口時(shí)間短、季節(jié)緊，秸稈還田作為一種直接有效的秸稈處置措施被廣泛采用。秸稈還田不僅能夠改善土壤結(jié)構(gòu)、增加土壤養(yǎng)分和提高作物產(chǎn)量[1-3]，而且對(duì)土壤微生物也有著重要的影響[4-5]。

微生物量碳氮和酶活性作為土壤微生物活性的重要指標(biāo)，是土壤養(yǎng)分轉(zhuǎn)化和有機(jī)質(zhì)分解的關(guān)鍵因子，常被用于評(píng)價(jià)土壤質(zhì)量的生物學(xué)特性[6-9]。近年來(lái)，利用土壤微生物活性指標(biāo)的變化來(lái)評(píng)價(jià)麥秸還田對(duì)稻田土壤生態(tài)學(xué)效應(yīng)的研究相對(duì)較多。研究發(fā)現(xiàn)，秸稈還田對(duì)稻田土壤微生物活性的影響與秸稈還田方式、土壤性質(zhì)等多種環(huán)境因子密切相關(guān)[10-12]，因此，合理的秸稈還田技術(shù)能夠有效地改善土壤微生物活性進(jìn)而提升土壤肥力。然而，由于目前土壤環(huán)境的復(fù)雜性，使得對(duì)于典型稻麥輪作區(qū)大田試驗(yàn)條件下不同小麥秸稈還田模式對(duì)稻田土壤微生物活性的影響效應(yīng)仍不夠明確。

細(xì)菌是土壤微生物的重要組成部分，直接影響土壤物質(zhì)循環(huán)和養(yǎng)分轉(zhuǎn)化等[13-14]。然而由于土壤中大部分細(xì)菌很難分離培養(yǎng)，采用傳統(tǒng)的土壤微生物研究方法如微生物平板培養(yǎng)法、變性梯度凝膠電泳（DG?GE）等通常無(wú)法詳細(xì)描述出土壤微生物的群落多樣性和組成方面的信息[15-17]，使得對(duì)于土壤細(xì)菌生物多樣性的研究仍然匱乏，有關(guān)其演替規(guī)律仍不清楚。近年來(lái)興起的現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)如高通量測(cè)序技術(shù)等[13-14]，為深入探究土壤微生物群落組成、功能及其適應(yīng)機(jī)制提供了良好的契機(jī)。已有研究表明，不同微生物在秸稈降解過(guò)程中起著不同的作用，例如，在秸稈降解初期細(xì)菌起主要作用[18-19]，而且秸稈還田顯著增加擬桿菌門(mén)（Bacteroidetes）、β-變形菌門(mén)（Betapro?teobacteria）和芽單胞菌門(mén)（Gemmatimonadetes）豐度，從而改變土壤細(xì)菌群落[20-21]。然而目前關(guān)于典型稻麥輪作區(qū)大田試驗(yàn)條件下稻田土壤細(xì)菌群落組成對(duì)秸稈還田的響應(yīng)仍不夠清晰。

因此，本試驗(yàn)擬通過(guò)研究長(zhǎng)江下游典型稻麥輪作區(qū)不同小麥秸稈還田模式對(duì)土壤微生物活性和微生物群落組成的影響，為尋求良好的土壤微生物生態(tài)環(huán)境提供理論和實(shí)踐依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)地概況

試驗(yàn)于2017年6月至11月在江蘇省常州市金壇區(qū)薛埠鎮(zhèn)羅村稻麥輪作試驗(yàn)田進(jìn)行。該試驗(yàn)田0～20 cm土壤的理化狀況為：pH值5.81、堿解氮51.3 mg·kg-1、速效磷12.2 mg·kg-1、速效鉀190 mg·kg-1、有機(jī)質(zhì)23.7 g·kg-1。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與田間管理

試驗(yàn)采用隨機(jī)區(qū)組排列，設(shè)置四種處理，分別為對(duì)照（Control）、麥秸直接還田（S）、麥秸與氮肥配施還田（SN）、麥秸泡田還田（SP），每個(gè)處理三個(gè)重復(fù)。每個(gè)小區(qū)面積為2000～3000 m2，小區(qū)之間以自然田埂或筑埂分隔。試驗(yàn)前先將上季的小麥?zhǔn)斋@，留茬10 cm左右，然后通過(guò)收割機(jī)將小麥秸稈粉粹，長(zhǎng)度約5～10 cm。待秸稈均勻拋撒后采用常規(guī)旋耕還田，深度為10～12 cm，上水泡田若干天后移栽稻秧苗，品種為武運(yùn)粳23號(hào)，11月1日收獲。各處理施肥和泡田具體管理情況見(jiàn)表1，其中Control、S和SP處理下氮、磷、鉀肥總施用量分別為270、37.5、71.25 kg·hm-2；SN處理下氮肥用量增加到330 kg·hm-2，磷肥和鉀肥施用量保持不變?；试谂萏铩⒄厍笆?；分蘗肥在插秧后7～10 d施；穗肥在倒三葉期（8月上旬）葉色褪淡時(shí)施。除草、病蟲(chóng)害防治等按照當(dāng)?shù)爻Ｒ?guī)管理。

1.3 取樣測(cè)定方法

在水稻成熟期（2017-11-01），采用五點(diǎn)取樣法在各試驗(yàn)小區(qū)采集深度為0～20 cm的土壤樣品。所有土壤樣品挑除動(dòng)植物雜體后混勻，分為三部分：一部分風(fēng)干后用于土壤性質(zhì)和土壤酶活性的測(cè)定，一部分鮮樣保存于4℃冰箱用于土壤微生物量碳氮的測(cè)定，最后一部分鮮樣保存于-20℃冰箱用于細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)分析。

土壤pH值采用酸度計(jì)（pHs-3C型精密pH計(jì)，上海雷磁儀器廠）測(cè)定（土∶水=1∶5）；土壤電導(dǎo)率（EC）采用電導(dǎo)儀（DDSJ-318型電導(dǎo)率儀，上海雷磁儀器廠）測(cè)定；土壤總有機(jī)碳（TOC）采用重鉻酸鉀外加熱法[22]；土壤溶解性有機(jī)碳（DOC）采用有機(jī)碳分析儀（Shimadzu TOC-Vcph，Japan）測(cè)定（土∶水=1∶5）；土壤全氮（TN）采用半微量開(kāi)氏法[22]；堿解氮（AN）采用堿解擴(kuò)散法[22]；有效磷（AP）采用鉬銻抗比色法[22]；速效鉀（AK）采用火焰光度計(jì)比色法[22]；土壤過(guò)氧化氫酶（Catalase）采用高錳酸鉀滴定法[23]；多酚氧化酶（Poly?phenol oxidase，PPO）采用鄰苯二酚比色法[23]；酸性磷酸酶（Acid phosphatase，ACP）采用對(duì)硝基苯磷酸二鈉比色法[23]；蔗糖酶（Invertase）采用二硝基水楊酸比色法[23]；脲酶（Urease）采用靛酚比色法[23]；微生物量碳氮（MBC、MBN）采用氯仿熏蒸浸提法[24]。

根據(jù)FastDNA?Spin Kit for Soil試劑盒說(shuō)明書(shū)提取土壤微生物總DNA，所獲得的DNA送至上海美吉生物有限公司，用于Illumina Miseq測(cè)序，細(xì)菌群落組成高通量測(cè)序所用引物為515F（5′-GTGCCAGC?MGCCGCGG-3′）和 907R（5′-CCGTCAATTC?MTTTRAGTTT–3′）[25]。

1.4 數(shù)據(jù)處理

高通量測(cè)序所得原始序列首先經(jīng)拼接和過(guò)濾后去除含錯(cuò)誤接頭、漏測(cè)核苷酸（N）或者連續(xù)出現(xiàn)10次以上堿基的序列；再次過(guò)濾低質(zhì)量的序列（含20個(gè)以上低質(zhì)量的堿基），并去除引物。所得的序列隨后在I-Sanger云平臺(tái)進(jìn)行分析，流程主要包括：參照綠色基因數(shù)據(jù)庫(kù)（Greengenes database，2011版）在97%的相似度水平劃分序列的OTU；挑選代表的OTU用RDP分類(lèi)；去除含嵌合體的OTU歸類(lèi)為葉綠體或線(xiàn)粒體的OTU以及只出現(xiàn)一次的OTU；在不同的分類(lèi)水平上將具有相同歸屬的OTU合并；將所有樣品的序列數(shù)校正到樣品中出現(xiàn)的最低序列數(shù)，并在此基礎(chǔ)上做系數(shù)分析，計(jì)算物種群落組成、物種差異性分析和β多樣性。其中β多樣性是指根據(jù)樣品兩兩間bray-curtis做非度量多維尺度分析（NMDS），用于表征樣品之間基于一些OTU存在與否的細(xì)菌群落的相似性。測(cè)序數(shù)據(jù)圖形繪制均在I-Sanger云平臺(tái)上完成。

所得數(shù)據(jù)采用Excel 2007和SPSS 23.0軟件進(jìn)行處理與統(tǒng)計(jì)分析，圖形繪制采用SigmaPlot 10.0。

2 結(jié)果與分析

2.1 土壤理化性質(zhì)

不同麥秸還田模式下，稻田土壤部分理化性質(zhì)的變化見(jiàn)表2。由表2可以看出，與未施用麥秸的對(duì)照土壤相比，S處理稻田土壤pH、TOC和AK含量都有上升趨勢(shì)，土壤EC和TN則呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，但影響效應(yīng)并不顯著（P＞0.05），而稻田土壤中AP含量則顯著提高，AN含量顯著降低（P＜0.05）。三種麥秸還田模式下，稻田土壤中pH、TOC、DOC、AK、EC和TN并無(wú)顯著變化。與S處理相比，SN處理顯著提高了土壤中AN含量，并顯著降低了稻田土壤中AP的含量，而與對(duì)照土壤相比，SN處理顯著提高了土壤中DOC含量；SP處理與S處理相比僅顯著降低了土壤中AP含量，而對(duì)其他性質(zhì)無(wú)顯著影響。以上研究結(jié)果表明，麥秸還田主要顯著改變了土壤中易被微生物可利用的碳、氮、磷的含量如DOC、AN和AP，而對(duì)土壤中pH、EC、TOC、TN和AK則無(wú)顯著影響。

表1 不同麥秸還田模式下稻田施肥和泡田管理情況Table 1 Fertilization and ponding treatments in paddy soils with different straw returning

表2 不同麥秸還田模式下稻田土壤理化性質(zhì)的變化Table 2 Soil properties in paddy soils with different straw returning

2.2 土壤微生物量碳和微生物量氮

不同麥秸還田模式下稻田土壤MBC和MBN含量，以及計(jì)算的MBC/MBN見(jiàn)圖1。由圖1可以看出，與對(duì)照土壤相比，三種麥秸還田模式下稻田土壤MBC含量由249 μg·g-1升高到257～282 μg·g-1，但其升高效應(yīng)并不顯著（P＞0.05）；而土壤中MBN則是由16.9μg·g-1顯著提高到24.6～31.3μg·g-1（P＜0.05），提高了45.6%～85.2%，其中SN處理下土壤中MBN含量最高。基于MBC和MBN結(jié)果，還發(fā)現(xiàn)麥秸還田下MBC/MBN由14.9顯著降低到8.58～10.7（P＜0.05），其中SN處理下土壤中MBC/MBN最低。以上研究結(jié)果表明，麥秸還田提高了稻田土壤中MBC和MBN含量，并顯著降低了土壤中MBC/MBN比值。

圖1 不同麥秸還田模式下稻田土壤微生物量碳、氮含量以及微生物量碳氮比的變化Figure 1 Concentration in microbial biomass carbon（MBC）and nitrogen（MBN）,and MBC/MBNin paddy soils with different straw returning

2.3 土壤酶活性

不同麥秸還田模式下稻田土壤的過(guò)氧化氫酶、多酚氧化酶、酸性磷酸酶、蔗糖酶以及脲酶活性見(jiàn)圖2。由圖2可知，與對(duì)照土壤相比，三種麥秸處理模式下，S和SN處理稻田土壤中過(guò)氧化氫酶活性由0.92 mL·g-1顯著增加到 1.12 mL·g-1和 1.06 mL·g-1，增加了15.2%～21.7%，而SP處理土壤中過(guò)氧化氫酶則無(wú)明顯變化；S和SN處理稻田土壤中蔗糖酶活性無(wú)顯著變化，而SP處理土壤中蔗糖酶活性由對(duì)照的10.5 mg·d-1·g-1顯著提高到 17.1 mg·d-1·g-1，增加了61.9%；三種麥秸處理模式下稻田土壤中多酚氧化酶活性由對(duì)照的16.7 μmol·g-1·h-1顯著提高到 23.5、24.8 μmol·g-1·h-1和21.5 μmol·g-1·h-1，分別提高了40.5%、48.1%和28.7%；三種麥秸處理模式對(duì)稻田土壤中酸性磷酸酶活性無(wú)顯著性影響。此外，S和SP處理下稻田土壤中脲酶活性由對(duì)照71.0 mg·d-1·g-1降低到54.8 mg·d-1·g-1和60.5 mg·d-1·g-1，顯著降低了22.8%和14.8%，而SN處理下土壤中脲酶活性增加了9.86%，但其增加效應(yīng)并不顯著。以上結(jié)果表明，麥秸還田主要顯著提高了稻田土壤中多酚氧化酶活性，但對(duì)于酸性磷酸酶活性則無(wú)顯著影響，而稻田土壤中過(guò)氧化氫酶、蔗糖酶和脲酶活性的變化在不同麥秸還田模式下不同。

2.4 土壤細(xì)菌群落組成

利用Illumina高通量測(cè)序技術(shù)，對(duì)12個(gè)不同麥秸還田模式下稻田土壤樣品按照97%相似性對(duì)非重復(fù)序列（不含單序列）進(jìn)行OTU聚類(lèi)。不同麥秸還田模式下，稻田土壤的細(xì)菌群落組成見(jiàn)圖3。由圖3可以看出，未施用麥秸的對(duì)照稻田土壤優(yōu)勢(shì)細(xì)菌為綠彎菌門(mén)（Chloroflexi，25.5%）、放線(xiàn)菌門(mén)（Actinobacteria，24.1%）、變形菌門(mén)（Proteobacteria，18.2%）、酸桿菌門(mén)（Acidobacteria，10.1%）和 厚 壁 菌 門(mén)（Fimicutes，8.35%）。

圖2 不同麥秸還田模式下稻田土壤酶活性Figure 2 Soil enzyme activity in paddy soils with different straw returning

與對(duì)照土壤相比，麥秸還田處理對(duì)稻田土壤中主要優(yōu)勢(shì)菌門(mén)豐度的影響見(jiàn)圖4。由圖4可知，麥秸還田條件下稻田土壤中優(yōu)勢(shì)菌變形菌門(mén)（Proteobacte?ria）的豐度由18.2%提高至20.7%，而其他優(yōu)勢(shì)菌門(mén)并無(wú)顯著變化。研究還發(fā)現(xiàn)，不同麥秸還田模式之間土壤中優(yōu)勢(shì)菌門(mén)并無(wú)顯著差異（圖3）。以上結(jié)果表明，麥秸還田顯著提高了稻田土壤中變形菌門(mén)（Pro?teobacteria）的相對(duì)豐度，但對(duì)其他優(yōu)勢(shì)菌門(mén)相對(duì)豐度并無(wú)顯著影響，且不同麥秸還田模式之間稻田土壤中優(yōu)勢(shì)菌門(mén)相對(duì)豐度也無(wú)顯著差異。

為了進(jìn)一步探究麥秸還田對(duì)土壤中細(xì)菌群落組成的影響，我們對(duì)不同麥秸還田模式下土壤中細(xì)菌群落組成進(jìn)行了非度量多維尺度分析（NMDS）（圖5）。結(jié)果顯示，與對(duì)照土壤相比，S和SN處理下土壤中細(xì)菌群落組成有一定的遷移；SP和對(duì)照之間細(xì)菌群落組成正好重合。以上結(jié)果表明，麥秸直接還田和麥秸與氮肥配施還田改變了土壤中細(xì)菌群落組成，但麥秸泡田還田并未改變土壤中細(xì)菌群落組成。

3 討論

土壤微生物量碳氮是土壤微生物軀體中所固定的碳素和氮素，是土壤養(yǎng)分的儲(chǔ)存庫(kù)。已有研究表明，秸稈覆蓋還田能夠顯著提高土壤微生物量碳氮含量[11]。本研究也發(fā)現(xiàn)麥秸還田下稻田土壤中微生物量碳含量有上升趨勢(shì)，同時(shí)微生物量氮含量顯著提高。這很可能是由于秸稈還田提高了土壤中DOC含量，為微生物生長(zhǎng)和繁殖提供了大量碳源，從而提高了土壤微生物量。土壤微生物生長(zhǎng)不僅受碳源的影響，氮肥的調(diào)控也會(huì)影響土壤微生物的量[26]。當(dāng)秸稈與氮肥配施還田時(shí)，氮肥施用為微生物生長(zhǎng)提供了較多的氮源，刺激了微生物的生長(zhǎng)[26]，因此麥秸與氮肥配施還田下土壤中微生物量氮含量最高。

已有研究表明，秸稈還田條件下，土壤微生物量的增加能夠促進(jìn)土壤酶內(nèi)在的分泌物數(shù)量，從而提高土壤酶活性，而土壤酶能夠催化土壤中的生物化學(xué)反應(yīng)，對(duì)土壤肥力有著重要的影響[27]。本研究也發(fā)現(xiàn)麥秸還田顯著提高了土壤中多酚氧化酶活性。氧化還原酶在土壤轉(zhuǎn)化過(guò)程中有很重要的作用，其中多酚氧化酶與土壤有機(jī)質(zhì)的形成有關(guān)，是腐殖化的一種媒介[28]。麥秸還田條件下多酚氧化酶活性的提高很可能主要是有效促進(jìn)秸稈腐質(zhì)化，從而提高土壤有機(jī)質(zhì)含量。而磷酸酶活性主要參與土壤中磷素的轉(zhuǎn)化，本研究發(fā)現(xiàn)三種麥秸還田模式下土壤有效磷含量并無(wú)顯著變化，因此三種麥秸還田對(duì)土壤磷酸酶活性也無(wú)顯著影響。此外，稻田土壤中過(guò)氧化氫酶、蔗糖酶和脲酶活性對(duì)不同麥秸還田模式響應(yīng)有所差異。過(guò)氧化氫酶活性從某方面反映了加入到土壤中的秸稈的分解狀況，與土壤有機(jī)碳的轉(zhuǎn)化有關(guān)[29]。與麥秸泡田還田相比，麥秸直接還田和麥秸與氮肥配施還田時(shí)，泡田時(shí)間較短情況下，土壤中含氧量較高易于好氧微生物生長(zhǎng)，而泡田時(shí)間延長(zhǎng)的情況下土壤中含氧量逐漸降低，形成一定的厭氧環(huán)境，厭氧微生物量逐漸增多，其對(duì)秸稈的分解程度通常不如好氧微生物徹底。因此秸稈分解較快的麥秸直接還田和麥秸與氮肥配施還田下土壤過(guò)氧化氫酶活性更高。而蔗糖酶活性在麥秸泡田還田處理下較高，很可能是因?yàn)閰捬鯒l件下，有機(jī)質(zhì)分解不夠徹底，釋放出較多蔗糖，因此需要較高的蔗糖酶來(lái)進(jìn)一步分解成更小分子有機(jī)碳。脲酶活性主要是與土壤中氮的供給與利用情況密切相關(guān)[29]。本研究發(fā)現(xiàn)麥秸還田顯著提高了土壤中溶解性有機(jī)碳含量，而微生物對(duì)土壤中C、N的利用有一定的比例范圍，一旦C/N比值變大，勢(shì)必引起微生物對(duì)N源的爭(zhēng)奪利用，麥秸直接還田和麥秸泡田還田下隨著秸稈的施入，土壤中堿解氮含量顯著降低（37.5 mg·kg-1vs28.6～31.3 mg·kg-1），造成土壤氮缺乏[30]，從而降低脲酶活性。而麥秸與氮肥配施還田隨著氮肥施用量的增大增加了土壤中堿解氮含量（49.4 mg·kg-1），因此脲酶活性則又有所提高。

圖4 麥秸還田對(duì)稻田土壤在門(mén)水平上的主要優(yōu)勢(shì)菌豐度的影響Figure 4 Class distribution of bacterial community in soils with different straw returning

圖5 不同麥秸還田模式下稻田土壤在OTU水平上細(xì)菌群落組成的β多樣性Figure 5β-diversity of bacterial community at OTUlevel in soils with different straw returning

土壤微生物生物量碳氮比經(jīng)常被用于描述微生物的群落結(jié)構(gòu)信息[31]。一般來(lái)說(shuō)，細(xì)菌的C/N比值在3～6之間，而真菌的C/N比值在7～12之間[32]。本研究中土壤微生物生物量碳氮的比值一直較大，維持在8～15（圖1），說(shuō)明該土壤中真菌數(shù)量比較高，而秸稈還田后，土壤微生物生物量碳氮比有所降低，很可能是由于秸稈還田后土壤pH的升高更利于細(xì)菌生長(zhǎng)[11，33]。細(xì)菌作為微生物重要組成部分之一，在稻田土壤碳氮元素轉(zhuǎn)化過(guò)程中的作用不可忽視。已有研究表明秸稈還田能夠顯著改變土壤細(xì)菌群落[20]，并能顯著增加擬桿菌門(mén)（Bacteroidetes）、β-變形菌門(mén)（Be?taproteobacteria）和芽單胞菌門(mén)（Gemmatimonadetes）豐度[21]。本研究發(fā)現(xiàn)麥秸還田顯著增加了稻田土壤中變形菌門(mén)（Proteobacteria）的相對(duì)豐度，而細(xì)菌群落的遷移在不同麥秸還田模式下響應(yīng)明顯不同。土壤細(xì)菌群落組成僅在麥秸直接還田和麥秸與氮肥配施還田處理中有一定遷移，而麥秸泡田還田處理下細(xì)菌群落組成并無(wú)變化，這很可能是由于不同麥秸還田模式下土壤性質(zhì)變化不同，而土壤性質(zhì)是調(diào)控土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的重要因子[14]。

4 結(jié)論

（1）三種麥秸還田模式均提高了稻田土壤微生物量碳氮含量，并顯著降低了微生物量碳氮比。

（2）麥秸還田顯著提高了稻田土壤中多酚氧化酶活性，但對(duì)酸性磷酸酶活性無(wú)顯著影響；而稻田土壤中過(guò)氧化氫酶、蔗糖酶和脲酶活性的變化與其麥秸還田模式緊密相關(guān)。

（3）麥秸還田顯著提高了稻田土壤中變形菌門(mén)（Proteobacteria）的相對(duì)豐度，其中麥秸直接還田和麥秸與氮肥配施還田改變了土壤中細(xì)菌群落組成，而麥秸泡田還田并未改變土壤中細(xì)菌群落組成。