硅、磷配施對水稻鎘吸收轉(zhuǎn)運(yùn)的影響及其機(jī)制

曹庭悅，劉鳴達(dá)，沃惜慧，李 軍

（沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)土地與環(huán)境學(xué)院，沈陽 110866）

鎘是一種生物毒性較大的重金屬，也是主要的土壤重金屬污染物之一[1]。對植物而言，鎘不是一種必需的營養(yǎng)元素，鎘的攝入會抑制植物幼苗生長[2]，影響植物內(nèi)酶活性[3]，抑制氣孔開放，進(jìn)而影響光合作用等重要生理過程[4]。水稻作為人類的主要糧食，全球近50%的人口以水稻為食。土壤中的重金屬可以被水稻同化，由根部吸收通過莖部運(yùn)輸至籽粒[5]，通過食物鏈進(jìn)入人體，是人體攝入鎘的主要來源[6]。因此，研究水稻安全生產(chǎn)對于世界糧食安全問題具有重要意義。

硅被認(rèn)為是對許多高等植物有益的元素。其不僅能夠促進(jìn)植物正常的生長發(fā)育，而且能夠提高植物對生物和非生物脅迫的抗性[7]。大量研究表明，硅對植物鎘毒害具有一定的緩解作用[8-10]。磷是植物生長發(fā)育的必需元素之一，對保障作物生長及產(chǎn)量起著不可替代的作用。有研究發(fā)現(xiàn)施用含磷肥料在固定重金屬方面具有顯著效果，可以成為修復(fù)重金屬污染土壤的一種經(jīng)濟(jì)可行的重要措施[11-14]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，硅、磷配合施入對于抑制植物重金屬脅迫具有協(xié)同作用。徐應(yīng)星等[15]通過盆栽試驗，研究了硅、磷配合施入對鎘脅迫下玉米生物量及其鎘吸收量的影響。結(jié)果表明，硅、磷配合施入可降低玉米莖葉中的鎘含量，且作用效果大于硅、磷單獨(dú)施入。由此可見，硅、磷、鎘三者間交互作用較為復(fù)雜，因此，研究三者間的交互作用，對于更好地緩解水稻鎘毒害，抑制水稻對鎘的吸收，保證水稻的安全生產(chǎn)，降低鎘通過食物鏈對人體健康造成危害具有重要意義。

近年來，對于鎘在植物中的分子機(jī)制的研究主要集中在鎘相關(guān)的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白上，研究發(fā)現(xiàn)，水稻根莖間存在影響鎘轉(zhuǎn)移的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，水稻對鎘的吸收和轉(zhuǎn)移受這些相關(guān)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性的影響[16-17]。相關(guān)基因受水稻生長環(huán)境的影響，基因表達(dá)量受到調(diào)控[18]。Sasa?ki等[19]發(fā)現(xiàn)OsNramp5是水稻根部內(nèi)皮層、外皮層以及木質(zhì)部參與吸收鎘的主要轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，同時影響鎘從根部向地上部的運(yùn)輸。重金屬ATP酶家族的OsH?MA2是一個位于水稻韌皮部的鎘轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，其基因在根中表達(dá)強(qiáng)烈，參與鎘從根部向地上部的轉(zhuǎn)運(yùn)[20-21]。LCD是一個與已知基因不同源的新基因，主要在根的維管束和葉片韌皮部的伴胞中表達(dá)，與鎘在水稻體內(nèi)的運(yùn)輸和積累有關(guān)[22]。OsLCT1是水稻低親合力陽離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，位于植物細(xì)胞的質(zhì)膜上，參與鎘向籽粒的運(yùn)輸，在葉片和莖節(jié)中強(qiáng)烈表達(dá)[23]。水稻中存在的這些與鎘相關(guān)的基因，對鎘在水稻中的吸收轉(zhuǎn)移具有重要作用。因此，硅、磷的施入可能是通過調(diào)控這些基因的表達(dá)來減少水稻對鎘的吸收、轉(zhuǎn)移和積累。本研究從水稻對鎘吸收轉(zhuǎn)運(yùn)的機(jī)制出發(fā)，探究緩解水稻鎘脅迫的最適硅、磷濃度，并結(jié)合水稻鎘相關(guān)基因的表達(dá)，探究施磷影響水稻吸收積累鎘的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 供試品種和試驗設(shè)計

本試驗于室內(nèi)光照培養(yǎng)箱中進(jìn)行，采用水培試驗，選用圓柱形培養(yǎng)桶，高19 cm，桶口徑16.5 cm，桶內(nèi)放置用于固定植物的定植籃，定植籃深10 cm，每桶裝2 L培養(yǎng)液，培養(yǎng)液按照國際水稻研究所配方配制。試驗期間，每4 d更換一次培養(yǎng)液。供試品種為沈稻529，由沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院提供。

挑選籽粒飽滿的水稻種子，用2%的H2O2消毒15 min，用去離子水反復(fù)沖洗，放入去離子水中浸種，再將種子均勻灑在育苗盤上，置于培養(yǎng)箱內(nèi)培育。選取長勢均衡的二葉期幼苗，移栽至培養(yǎng)桶中，每桶兩穴，每穴5株，采用定植籃固定。使用1/2培養(yǎng)液預(yù)培養(yǎng)10 d后換用完全培養(yǎng)液，進(jìn)行各梯度處理。磷以磷酸二氫鈉形式施入，分別設(shè)置4個磷濃度梯度處理，分別為0（P0）、60（P1）、180（P2）、360 mg·kg-1（P3），硅以九水合硅酸鈉形式施入，設(shè)置4個硅濃度梯度處理，分別為 0（Si0）、142（Si1）、284（Si2）、568 mg·kg-1（Si3），每個處理重復(fù)3次。與完全培養(yǎng)液混合后用HNO3和NaOH調(diào)節(jié)pH至5.6，用NaNO3補(bǔ)齊各處理間Na+和NO-3的差異，用于水稻幼苗培養(yǎng)，每天光照13 h，光照時保持室溫27℃，停止光照時保持室溫23℃，培養(yǎng)15 d后，進(jìn)行鎘脅迫處理，以氯化鎘溶液形式進(jìn)入，濃度設(shè)置為5.5 mg·kg-1。鎘處理15 d后，收獲水稻樣品，一部分烘干后用于水稻生物量及鎘含量的測定，另一部分保存于-80℃冰箱用于水稻鎘轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因表達(dá)的分析。

1.2 測定方法

1.2.1 水稻生物量的測定

收獲水稻樣品用去離子水沖洗干凈，105℃殺青1 h后繼續(xù)80℃烘干至恒質(zhì)量，稱量烘干樣品質(zhì)量。

1.2.2 植株各部位鎘含量的測定

取烘干樣品，粉碎過60目篩，稱取各處理水稻樣品0.5 g于三角瓶中，以硝酸∶高氯酸=4∶1進(jìn)行消煮后，用電感耦合等離子體質(zhì)譜儀（ICP-MS）測定鎘的含量，每組重復(fù)3次。

1.2.3植株鎘轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因的表達(dá)量測定

取 Si0P0、Si0P2、Si2P0、Si2P2 4個處理水稻樣品，其總RNA采用UNIQ-10柱式Trizol總RNA抽提試劑盒提取，用第一鏈cDNA合成試劑盒（RevertAid Premium Reverse Transcriptase）逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。實時定量PCR體系按照SG Fast qPCR Master Mix定量試劑盒的要求配制，并用ABI Stepone plus型熒光定量PCR儀進(jìn)行分析，反應(yīng)步驟如下：95℃預(yù)變性3 min；95℃變性3 s，60℃退火30 s，60℃延伸30 s，共45個循環(huán)；以O(shè)sActin基因作為內(nèi)參基因，采用2-△△CT法[24]計算各處理水稻樣品中鎘轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)蛋白基因的相對表達(dá)水平，引物序列見表1，每組重復(fù)3次。

1.2.4 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2010進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計和作圖，用SPSS19.0軟件進(jìn)行方差分析。采用Duncan法進(jìn)行各處理間差異顯著性檢驗，不同小寫字母代表處理間差異顯著（P＜0.05），相同字母代表處理間差異不顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 硅、磷配施對鎘脅迫下水稻生物量的影響

如圖1所示，隨著硅、磷的施入，水稻生物量總體呈現(xiàn)上升的趨勢。當(dāng)磷施入量不變時，低濃度硅的施入顯著增加了水稻幼苗的生物量，在硅施入量為Si2水平時，水稻幼苗的生物量達(dá)到最高，較未施入硅處理增加了9.98%。當(dāng)硅施入量不變，磷施入量為P2水平時，供試水稻幼苗的生物量達(dá)到最高，增加了9.74%。當(dāng)硅、磷配合施入時，水稻幼苗在Si2P2處理時生物量達(dá)到最高，增加了27.79%，較空白處理和硅、磷單一元素施入均表現(xiàn)出顯著性差異。說明硅、磷的施入有效緩解了鎘對水稻生長的毒害，且配合施入效果好于單一元素施入。當(dāng)硅、磷施入濃度過高時，水稻幼苗生物量增加漸緩，且較Si2P2處理差異不顯著，高濃度的硅、磷施入抑制了水稻幼苗生物量的增長。

2.2 硅、磷配施對水稻根部和莖葉部鎘含量及根莖轉(zhuǎn)移系數(shù)的影響

不同硅、磷水平下水稻根部和莖葉部鎘含量的影響如圖2和圖3所示，由圖可以看出，受鎘污染脅迫下水稻根部鎘含量均高于莖葉部中鎘含量，硅、磷的施入顯著降低了水稻各部位鎘含量。在未有硅施入時，水稻根部和莖葉部均表現(xiàn)出鎘含量最高水平，隨著磷的施入，水稻根部和莖葉部中鎘含量均有降低趨勢。根部鎘含量降低2.54%～8.45%，莖葉部中鎘含量降低5.88%～28.30%，各部位均在P2處理時降低幅度最大，表現(xiàn)出顯著性差異。在未有磷施入時，隨著水稻硅施入量增加，水稻根部鎘含量降低1.13%～3.48%，莖葉部鎘含量降低6.28%～18.67%，均在Si2處理時達(dá)到最低，但根部未表現(xiàn)出顯著性差異。當(dāng)硅、磷配合施入時，水稻根部及莖葉部鎘含量降低幅度較單一元素施入時下降幅度更為顯著，均在Si2P2處理時鎘含量達(dá)到最低，分別降低12.79%和37.91%，較Si0P0處理均表現(xiàn)出顯著性差異。說明硅、磷配合施入具有一定的協(xié)同作用，較單一元素施入對緩解水稻鎘脅迫更為有效。水稻根部與莖葉部總體上表現(xiàn)出相同的降低趨勢，莖葉部變化幅度大于根系，說明硅、磷的施入對鎘脅迫下水稻苗期莖葉部中鎘含量的影響大于根部。但在硅、磷施入量過高時，水稻莖葉部和根部鎘含量由降低趨勢轉(zhuǎn)為升高趨勢，說明硅、磷配施對鎘脅迫下水稻鎘吸收的緩解作用具有一定的閾值，過多硅、磷的施入對于鎘脅迫下水稻鎘吸收的緩解作用不顯著。

表1 內(nèi)參及鎘轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因引物序列Table 1 Internal reference and cadmium transporter gene primer sequence

圖1 不同硅、磷水平下水稻的生物量Figure 1 Biomass of rice under different silicon and phosphorus levels

水稻根莖轉(zhuǎn)移系數(shù)是指水稻莖葉部鎘含量與根部鎘含量的比值。一般用來描述重金屬從水稻根部向莖葉部的轉(zhuǎn)移能力，轉(zhuǎn)移系數(shù)越高，說明水稻根部向莖葉部的重金屬轉(zhuǎn)移能力越強(qiáng)。由表2可見，隨著硅、磷配合施入濃度的升高，鎘的轉(zhuǎn)移系數(shù)呈現(xiàn)先降低后增加的趨勢。單一元素施入時水稻分別在Si0P2處理和Si2P0處理時根莖轉(zhuǎn)移系數(shù)達(dá)到最低，分別降低了21.79%和15.60%。兩種元素配合施入時，供試水稻品種根莖轉(zhuǎn)移系數(shù)在Si2P2處理時達(dá)到最低，較未添加硅、磷的處理組降低了28.70%，作用效果好于單一元素施入的作用效果。說明硅、磷的施入增加了水稻根部對鎘的固定能力，減少了鎘從水稻根部向莖葉部的遷移，且兩種元素配合施入時較單一元素施入時對水稻中鎘遷移能力的影響更大。

2.3 硅、磷配施對水稻鎘相關(guān)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因相對表達(dá)的影響

圖2 不同硅、磷水平下水稻根部鎘含量Figure 2 Cadmiumcontent in roots of rice at different levels of silicon and phosphorus

圖3 不同硅、磷水平下水稻莖葉部鎘含量Figure 3 Cadmium content in stems and leaves of rice at different levelsof silicon and phosphorus

表2 不同硅、磷水平下水稻根部向莖葉部鎘轉(zhuǎn)移系數(shù)Table 2 Cadmium transfer coefficient fromrice roots to stems and leaves under different levels of silicon and phosphorus

對Si0P0、Si0P2、Si2P0、Si2P2 4個處理組的水稻鮮樣進(jìn)行鎘相關(guān)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因的表達(dá)特征進(jìn)行分析。由圖4可見，相比于Si0P0處理，隨著磷的施入，Si0P2處理顯著下調(diào)了水稻OsLCT1基因的相對表達(dá)，下調(diào)幅度為49.30%，表現(xiàn)出顯著性差異。隨著硅的施入，Si2P0處理較Si0P0處理下調(diào)幅度為46.68%，表現(xiàn)出顯著性差異。Si2P2處理下水稻OsLCT1基因的相對表達(dá)量達(dá)到最低，較Si0P0處理下調(diào)幅度為71.58%，與Si0P2處理和Si2P0處理均表現(xiàn)出顯著性差異。各處理組水稻LCD基因的相對表達(dá)量表現(xiàn)出與水稻OsLCT1基因相似的變化趨勢。在Si0P2處理時該基因相對表達(dá)量較Si0P0處理下調(diào)27.69%。在Si2P0處理時，該基因相對表達(dá)量較Si0P0處理下調(diào)幅度為14.32%，表現(xiàn)出顯著性差異。在Si2P2處理時水稻該基因相對表達(dá)量達(dá)到最低，下調(diào)幅度為42.05%。水稻OsNramp5基因相對表達(dá)量表現(xiàn)出隨著硅、磷的施入上調(diào)的變化趨勢，在Si0P2和Si2P0處理時基因相對表達(dá)量上調(diào)幅度分別為38.43%和19.96%，表現(xiàn)出顯著性差異。在Si2P2處理時基因相對表達(dá)量達(dá)到最高，上調(diào)幅度為81.19%，表現(xiàn)出顯著性差異。當(dāng)磷施入時，水稻OsHMA2基因相對表達(dá)未表現(xiàn)出顯著差異性，當(dāng)硅施入時，水稻OsHMA2基因相對表達(dá)量下調(diào)19.11%，當(dāng)硅、磷配施時，水稻OsHMA2基因相對表達(dá)下調(diào)幅度增加，下調(diào)幅度為22.44%。隨著不同濃度硅、磷的施入，水稻OsLCT1和LCD基因表達(dá)受到抑制，OsNramp5基因表達(dá)受到促進(jìn)，OsHMA2基因變化不顯著。這種硅、磷對水稻鎘轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)基因表達(dá)的影響是硅、磷對水稻鎘含量影響的重要分子機(jī)制。

圖4 不同硅、磷水平下水稻基因相對表達(dá)量Figure 4 Relative expression of rice genesunder different silicon and phosphorus levels

3 討論

硅是植物生長和發(fā)育的重要元素，合理施硅可以緩解水稻許多非生物脅迫，降低重金屬毒害[25]。磷是植物生長必需的營養(yǎng)元素，可以促進(jìn)植物生長，增強(qiáng)植物抗逆能力[26]。有研究認(rèn)為，硅、磷化學(xué)性質(zhì)相似，存在著相互促進(jìn)的關(guān)系。本試驗通過對一常規(guī)水稻品種進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，硅、磷配合施入可有效緩解鎘對水稻生長的毒害，增加水稻幼苗生物量，在濃度為284 mg·kg-1的硅與濃度為180 mg·kg-1的磷同時施入時，水稻幼苗生物量達(dá)到最高。熊麗萍等[27]研究認(rèn)為，硅的施入可以增加水稻各器官對磷的吸收，進(jìn)而促進(jìn)了水稻的生長，水稻總生物量增加。

本試驗研究還發(fā)現(xiàn)在鎘脅迫下，在未有硅、磷施入時，水稻根部及莖葉部鎘含量最高，植株受鎘脅迫危害最大。硅、磷單一元素的施入均顯著降低了水稻根部及莖葉部鎘含量，這與一些學(xué)者研究結(jié)果相似[28-29]。當(dāng)硅、磷配合施入時，兩種元素表現(xiàn)出協(xié)同作用，在180 mg·kg-1濃度的磷與 284 mg·kg-1濃度的硅同時施入時，水稻莖葉部與根部鎘含量均達(dá)到最低，莖葉部下降幅度大于根部，有效抑制了水稻對鎘的吸收和轉(zhuǎn)移，且降低幅度高于單一元素施入降低幅度。有研究認(rèn)為，硅的施入抑制了土壤對磷的固定，增加了土壤磷的有效性，使更多的有效磷被水稻吸收利用，水稻吸收更多的磷與鎘離子形成磷酸鹽[30-31]，將鎘固定在水稻根系中，抑制了鎘向莖葉部遷移，緩解了鎘對水稻的毒害[32]。也有研究認(rèn)為，隨著硅、磷的施入，水稻植株各部位鎘含量降低，是由于硅、磷的施入促進(jìn)了水稻的生長，增加了水稻生物量，對水稻中的重金屬鎘形成稀釋效應(yīng)，單位質(zhì)量中鎘含量降低[33]。Siebers等[34]研究認(rèn)為，磷的施入對于水稻中鎘的解毒機(jī)制是由于水稻細(xì)胞壁中的磷酸根可以與正價鎘離子結(jié)合，更多地將鎘固定在細(xì)胞壁中，降低鎘在水稻細(xì)胞中的遷移速率，硅的施入增加了水稻對磷的吸收，增強(qiáng)了磷對緩解水稻鎘脅迫的效果。本研究還發(fā)現(xiàn)，硅、磷的施入對于水稻中鎘含量的影響具有一定的調(diào)節(jié)范圍，硅、磷施入量過多，水稻中鎘含量呈現(xiàn)升高趨勢。這與劉芳等[35]研究磷、鎘交互作用對煙草吸收積累鎘的影響相似，其研究認(rèn)為，高濃度硅、磷施入后水稻中鎘呈現(xiàn)增加的趨勢是由于硅、磷的施入促進(jìn)了水稻根系的生長，增加了根與生長介質(zhì)間的接觸面積，進(jìn)而增加了水稻根系吸收和積累鎘的效率。

本研究發(fā)現(xiàn)，隨著硅、磷的施入，水稻鎘相關(guān)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因相對表達(dá)受到不同程度的基因調(diào)控?？赡苡捎诹姿刈鳛楹怂?、磷脂和ATP等的重要組成成分，參與植物的能量代謝和酶促反應(yīng)[36]，隨著硅的施入水稻吸收磷含量增加，水稻核酸、ATP等生命大分子受到影響，進(jìn)而影響水稻鎘轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)基因的表達(dá)。本試驗結(jié)果表明，硅、磷的施入通過下調(diào)水稻LCD和OsLCT1基因的相對表達(dá)量和上調(diào)水稻OSNramp5基因的相對表達(dá)量，減少鎘在水稻中的吸收和轉(zhuǎn)移，且配合施入的調(diào)節(jié)效果好于單一元素施入。研究表明，低親和性陽離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白OsLCT1是一種主要在葉片和根部表達(dá)，參與鎘在韌皮部運(yùn)輸?shù)闹饕D(zhuǎn)運(yùn)蛋白[37]。OsLCT1基因表達(dá)的下調(diào)，可能抑制鎘在水稻根部與莖葉部、葉片與籽粒之間的轉(zhuǎn)移，減少鎘對水稻籽粒的毒害。水稻LCD基因位于水稻根部維管組織細(xì)胞膜，該基因缺失會影響水稻根部對鎘的吸收。本試驗研究發(fā)現(xiàn)，硅、磷施入后，水稻OsLCT1基因和LCD基因呈現(xiàn)的下調(diào)趨勢，與水稻鎘含量變化表現(xiàn)一致。水稻OsLCT1基因和LCD基因的調(diào)控可能是水稻硅、磷與鎘交互作用的重要分子機(jī)制。天然抗性相關(guān)巨噬細(xì)胞蛋白OsNramp5是定位于質(zhì)膜、在水稻根部表達(dá)、負(fù)責(zé)根部對錳和鎘吸收的主要轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。促進(jìn)OsNramp5的基因表達(dá)可以抑制鎘在水稻中從根部到莖葉部的轉(zhuǎn)移[38]，Ishimaru等[39]研究認(rèn)為，這種基因調(diào)控是通過OsNramp5調(diào)控水稻對鎘的吸收，進(jìn)而通過OsHMA2和OsHMA3基因?qū)⑵溥M(jìn)一步轉(zhuǎn)移到液泡中，減少鎘對水稻的毒害。本研究發(fā)現(xiàn)，磷的施入對水稻OsHMA2基因相對表達(dá)影響不顯著，可能是由于OsH?MA2基因在水稻中影響其表達(dá)的機(jī)制較復(fù)雜。水稻中還存在一些與鎘吸收轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，大多數(shù)基因在水稻中的調(diào)控機(jī)制尚不明確，硅、磷的施入是否會對其他鎘相關(guān)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的相對表達(dá)造成影響仍需進(jìn)一步深入研究。

4 結(jié)論

（1）硅、磷配合施入有效緩解鎘對水稻生長的毒害，增加水稻幼苗總生物量，在284 mg·kg-1濃度的硅與180 mg·kg-1濃度的磷同時施入時，水稻幼苗生物量達(dá)到最高。

（2）硅、磷配合施入，有效降低了水稻根部及莖葉部鎘含量，當(dāng)284 mg·kg-1濃度的硅與 180 mg·kg-1濃度的磷同時施入時，水稻根部及莖葉部鎘含量達(dá)到最低，有效抑制了水稻對鎘的吸收和轉(zhuǎn)移，且降低幅度高于單一元素施入時的降低幅度。

（3）硅、磷的施入，有效調(diào)控了水稻幾種鎘轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)基因的表達(dá)，水稻OsLCT1和LCD基因表達(dá)下調(diào)，OsNramp5基因表達(dá)上調(diào)，且兩者配合施入對3種基因相對表達(dá)的調(diào)控效果好于單一元素施入調(diào)控效果。鎘脅迫下，硅、磷有效參與了水稻鎘相關(guān)轉(zhuǎn)運(yùn)基因的調(diào)控，抑制了水稻對鎘的轉(zhuǎn)運(yùn)，從分子水平上說明了硅、磷配施緩解水稻鎘毒害的機(jī)制。