復(fù)方淫羊藿對(duì)多殺性巴氏桿菌感染小鼠保護(hù)作用研究

胡長(zhǎng)青

（湖南省寧鄉(xiāng)縣動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，湖南寧鄉(xiāng)410600）

復(fù)方淫羊藿對(duì)多殺性巴氏桿菌感染小鼠保護(hù)作用研究

胡長(zhǎng)青

（湖南省寧鄉(xiāng)縣動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，湖南寧鄉(xiāng)410600）

為了探究復(fù)方淫羊藿對(duì)豬多殺性巴氏桿菌感染動(dòng)物的保護(hù)作用，將復(fù)方淫羊藿作為飼料添加劑按0.05%、0.1%、0.15%添加到鼠飼料中，飼喂3周齡昆明白小鼠30d。對(duì)小鼠進(jìn)行碳粒廓清試驗(yàn)，溶菌酶活性及對(duì)豬多殺性巴氏桿菌感染小鼠保護(hù)試驗(yàn)。結(jié)果顯示，復(fù)方淫羊藿能夠提高免疫器官指數(shù)，增加了單核-巨噬細(xì)胞的活性，顯著提高了溶菌酶活性，增強(qiáng)了機(jī)體免疫力，從而達(dá)到了對(duì)感染豬多殺性巴氏桿菌小鼠良好的保護(hù)作用。

復(fù)方淫羊藿；多殺性巴氏桿菌；保護(hù)作用

中國(guó)是世界上最重要的生豬養(yǎng)殖和豬肉消費(fèi)大國(guó)，擁有悠久的養(yǎng)豬傳統(tǒng)。多殺性巴氏桿菌病是豬場(chǎng)常見病之一，目前主要使用疫苗預(yù)防該病，但是該菌分布廣泛，血清型多，致使免疫效果不佳。筆者根據(jù)現(xiàn)代中藥藥理學(xué)研究表明“滋補(bǔ)”類中藥都具有一定的免疫增強(qiáng)作用，根據(jù)中藥配伍原則和組方理論，將性能相關(guān)的中藥配合應(yīng)用，篩選和優(yōu)化經(jīng)驗(yàn)配方得到淫羊藿、女貞子、白術(shù)、茯苓四味中藥組成“復(fù)方淫羊藿”作為免疫增強(qiáng)劑飼喂小白鼠，考察其對(duì)豬多殺性巴氏桿菌感染小鼠的保護(hù)作用及其機(jī)理[1]，取得較為滿意的效果。現(xiàn)將試驗(yàn)情況報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)菌株

本研究中使用的豬多殺性巴氏桿菌（菌株為PM-C439），購(gòu)自北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)研究院。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

80只3周齡和60只8周齡SPF級(jí)昆明白雄鼠，購(gòu)自湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，飼養(yǎng)于湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)樓動(dòng)物房。飼喂滅菌飼料和飲水，室內(nèi)溫度為28℃，濕度為（50±10）%。動(dòng)物飼養(yǎng)適應(yīng)3天后進(jìn)行試驗(yàn)。

1.1.3 主要試劑

淫羊藿、女貞子、白術(shù)、茯苓四種藥材均采購(gòu)于養(yǎng)天和大藥房湖南農(nóng)大店。

印度墨水，購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司。溶菌酶檢測(cè)試劑盒（比濁法），購(gòu)自南京建成生物工程研究所。TSB液體培養(yǎng)基自配，購(gòu)自青島海博生物技術(shù)有限公司；小牛血清，購(gòu)自浙江天杭生物科技股份有限公司；在3%的TSB溶液中加入小牛血清，配成含5%CS（V/V），3%TSB（M/V）的液體培養(yǎng)基。巧克力色瓊脂糖培養(yǎng)基，購(gòu)自貝瑞特生物科技（鄭州）有限公司。

1.1.4 主要儀器

恒溫水浴鍋（型號(hào):HHW-420-600），由國(guó)旺實(shí)驗(yàn)儀器廠生產(chǎn)；紫外分光光度計(jì)（型號(hào):UV-3000），由北京萊伯泰科儀器有限公司生產(chǎn)；臺(tái)式離心機(jī)（型號(hào):5810R），由德國(guó)Eppendorf公司生產(chǎn)；不銹鋼立式電熱蒸汽壓力滅菌器（型號(hào):LDZX-40），由上海甲安醫(yī)療器械廠生產(chǎn)；生化培養(yǎng)箱（型號(hào): LRH-150B），由廣東省醫(yī)療器械廠生產(chǎn)；超凈工作臺(tái)（型號(hào):SW-CJ-IC），由蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司生產(chǎn)；酶標(biāo)儀（型號(hào):M200 PRO），由瑞士TECAN公司生產(chǎn)。

1.2 方法

1.2.1 復(fù)方淫羊藿飼料的制備

以藥材的10倍水量采用水提法提取復(fù)方淫羊藿藥液，送與湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司制備成含復(fù)方淫羊藿0.05%、0.1%、0.15%（w/w）的鼠飼料。

1.2.2 動(dòng)物分組及處理

將80只3周齡昆明白小鼠隨機(jī)分成4組，每組20只，分別飼喂添加了高、中、低3個(gè)劑量的復(fù)方淫羊藿鼠飼料和普通飼料，連續(xù)飼喂30 d。60只7周齡昆明白小鼠用于豬多殺性巴氏桿菌半數(shù)致死量的測(cè)定。

1.2.3 碳粒廓清試驗(yàn)

每組隨機(jī)取10只小鼠，經(jīng)行稱重，每只小鼠使用胰島素注射器由尾靜脈注入0.1 mL/10 g的印度墨汁（生理鹽水稀釋6倍），注射后分別在2 min（T1）、7 min（T2）乙醚麻醉后用玻璃毛細(xì)管從小鼠眼眶靜脈叢采血20 μL，溶于20 mL 0.1%Na2CO3溶液中搖勻，靜置20 min后每個(gè)樣品取100 μL加入到96孔板中，取兩次樣分別加入不同孔中，以0.1%溶液為空白對(duì)照，使用酶標(biāo)儀在680 nm波長(zhǎng)測(cè)量其OD值。將小鼠處死后取肝臟和脾臟，用濾紙吸干血跡后稱重，根據(jù)公式計(jì)算廓清指數(shù)K值、校正廓清指數(shù)Ka值及免疫器官指數(shù)。計(jì)算公式：

注：M=體重，M1=肝臟重，M2=脾臟重，A為吸光光度值

1.2.4 溶菌酶活性的測(cè)定

每組剩下的10只小鼠采用眼眶靜脈叢采血約0.6 mL，4℃冰箱靜置保存2 h后分離血清，按說(shuō)明書檢測(cè)溶菌酶(LZM)活性。

取200 μL的待測(cè)血清、溶菌酶標(biāo)準(zhǔn)液（0.1 mg/mL∶200 IU/mL）作為陽(yáng)性對(duì)照、雙蒸水（空白樣），分別加入2.0 mL微球菌菌液（0.25 mg/mL），立即混勻，37℃水浴15 min，按時(shí)取出置于0℃的冰水浴中3 min。530 nm，1 cm光徑，以蒸餾水調(diào)透光度100%，測(cè)定各管的透光度。計(jì)算公式：

溶菌酶含量（IU/mL）=（測(cè)定管透光度-對(duì)照管透光度）/（標(biāo)準(zhǔn)管透光度-對(duì)照管透光度）×2000 IU/mL

1.2.5 豬多殺性巴氏桿菌對(duì)小鼠半數(shù)致死量的測(cè)定

將菌株P(guān)M-C439在加有5%犢牛血清的TSB培養(yǎng)基在37℃恒溫?fù)u床上180 r/min培養(yǎng)10 h，將細(xì)菌依次10倍稀釋，分別取10 μL涂于巧克力平板培養(yǎng)后計(jì)數(shù)；同時(shí)將上述10倍稀釋的菌液分別腹腔注射（100 μL/稀釋濃度）小鼠，每個(gè)濃度處理10只7周齡的昆明白小鼠，采用6個(gè)濃度。每天觀察并記錄小鼠死亡情況，連續(xù)觀察4天。小鼠半數(shù)致死量的計(jì)算按Reed和Muench氏法。

計(jì)算公式：距離比例=（高于50%的死亡百分?jǐn)?shù)-50%）/（高于50%的死亡百分?jǐn)?shù)-低于50%的死亡百分?jǐn)?shù)）；LD50的對(duì)數(shù)（LgLD50）=死亡率高于50%的對(duì)數(shù)+距離比例×稀釋系數(shù)的對(duì)數(shù)。

1.2.6 對(duì)感染豬多殺性巴氏桿菌小鼠保護(hù)作用

將進(jìn)行溶菌酶活性測(cè)定的小鼠飼喂3天，待其恢復(fù)健康后，腹腔注射1 000個(gè)LD50菌液（100 μL）進(jìn)行攻毒，每天觀察小鼠狀態(tài)并記錄死亡情況，連續(xù)觀察4 d。

1.3 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)使用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（SD）表示，使用SPSS 17.0軟件以單因素變異數(shù)分析進(jìn)行組間差異顯著性檢驗(yàn)，P＜0.05為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 免疫器官指數(shù)測(cè)定結(jié)果

飼喂添加復(fù)方淫羊藿飼料的小鼠免疫器官指數(shù)相對(duì)于對(duì)照組略有提高（表1），其中肝臟指數(shù)組方低添加組提高最大為5.23%，脾臟指數(shù)提高最多的組方中的33.3%，肝臟指數(shù)與脾臟指數(shù)不呈同步增長(zhǎng)。

表1 小鼠免疫器官指數(shù)

2.2 碳粒廓清試驗(yàn)測(cè)定結(jié)果

如表2所示飼喂添加復(fù)方淫羊藿飼料小鼠的校正廓清指數(shù)Ka有所提高，組方大提高最明顯（相對(duì)于對(duì)照組提高了14.63%），說(shuō)明單核-巨噬細(xì)胞的吞噬活性有所提高。

表2 碳粒廓清試驗(yàn)結(jié)果

2.3 血清溶菌酶活性測(cè)定結(jié)果

從實(shí)驗(yàn)結(jié)果來(lái)看，飼喂添加復(fù)方淫羊藿飼料后小鼠血清中溶菌酶活性顯著提高（P＜0.05），其中組方大小鼠溶菌酶活性提高率達(dá)到了62.64%。

圖1 血清溶菌酶活性測(cè)定結(jié)果

2.4 豬多殺性巴氏桿菌對(duì)小鼠半數(shù)致死量的測(cè)定

菌株P(guān)M-C439在37℃培養(yǎng)10 h后，將細(xì)菌10倍稀釋涂布巧克力平板，計(jì)數(shù)得到菌落數(shù)為4.3× 1011個(gè)細(xì)菌/mL。小鼠死亡情況如表3所示，稀釋倍數(shù)為10-5～10-3處理小鼠，在3 d內(nèi)全部死亡；加大稀釋濃度有不同程度死亡。根據(jù)Reed和Muench氏法計(jì)數(shù)得到LD50=10-6.5，即為：4.3×1011（菌液濃度）×10-6.5×10-1(注射量為0.1 mL)=4.3×103.5細(xì)菌數(shù)。

表3 小鼠半數(shù)致死量（LD50）的測(cè)定

2.5 對(duì)感染豬多殺性巴氏桿菌小鼠保護(hù)作用試驗(yàn)

小鼠攻毒后在24 h內(nèi)有狂躁不安的表現(xiàn)，隨后精神萎靡，被毛凌亂，畏冷，食欲廢絕，少數(shù)出現(xiàn)擺頭的神經(jīng)癥狀。從圖2可以看出，小鼠死亡主要集中在第3天，對(duì)照組只存活1只小鼠，而飼喂添加復(fù)方淫羊藿飼料后小鼠的存活率大大提高了，在第3天分別為組方小存活4只，組方中存活5只，組方大存活了5只。直至第5天，對(duì)照組僅存活一只，其他組分別存活了2只、3只、4只。

圖2 攻毒后小鼠的存活情況

3 討論

此次研究發(fā)現(xiàn)復(fù)方淫羊藿作為飼料添加劑可以通過(guò)提高免疫器官指數(shù)，增加了單核-巨噬細(xì)胞的活性，顯著提高了溶菌酶活性，從而達(dá)到了對(duì)感染豬多殺性巴氏桿菌小鼠良好的保護(hù)作用，其中的機(jī)理可能于各個(gè)組分的有效成分的作用有關(guān)。

現(xiàn)代中醫(yī)藥學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，本方劑中的主藥淫羊藿具有補(bǔ)腎陽(yáng)、強(qiáng)筋骨、祛風(fēng)濕作用，其主要化學(xué)成分為黃酮類化合物，淫羊藿經(jīng)口給藥發(fā)揮主治功效的物質(zhì)基礎(chǔ)主要為其代謝產(chǎn)物，如淫羊藿素、去甲淫羊藿素和朝藿定A等[2]。淫羊藿苷可以提高小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的吞噬功能,并能使受到環(huán)磷酰胺損傷以及電離輻射的小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的吞噬功能恢復(fù)至正常水平,還可以通過(guò)影響巨噬細(xì)胞因子的分泌而調(diào)節(jié)免疫機(jī)能。淫羊藿同樣能促進(jìn)B淋巴細(xì)胞的增生和轉(zhuǎn)化,提高抗體生成水平[3]。

女貞子中的紅景天苷及其苷元酪醇具有提高機(jī)體免疫功能、抗炎抑菌、升高白細(xì)胞、降血糖、調(diào)血脂等功效[4]。女貞子多糖對(duì)小鼠的免疫作用與機(jī)體的免疫狀態(tài)有關(guān),對(duì)非特異性細(xì)胞免疫有增強(qiáng)作用,對(duì)正常小鼠的特異性細(xì)胞免疫無(wú)顯著影響,對(duì)免疫抑制狀態(tài)小鼠的細(xì)胞免疫有增強(qiáng)作用[5]。白術(shù)具有提高機(jī)體抗病能力、保肝利尿，抗菌等作用[6]；茯苓主要成分有茯苓多糖和茯苓素，具有保肝利尿、免疫調(diào)節(jié)、抗炎、抗病毒、抗氧化等多種藥理作用[7]。

四種“滋補(bǔ)”藥物的配伍使用，更是發(fā)揮了相須相使的作用，提高了藥效，減少了用藥量，達(dá)到了較好的保護(hù)作用。復(fù)方淫羊藿方劑有望作為一種有效的預(yù)防豬多殺性巴氏桿菌的飼料添加劑運(yùn)用到養(yǎng)殖業(yè)中。

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S816.7

A

1006-4907（2016）05-0043-04

10.3969/j.issn.1006-4907.2016.05.018

2016-08-29

胡長(zhǎng)青（1974～），男，漢族，?？疲慝F醫(yī)師，主要從事動(dòng)物防疫工作，E-mail：252421564@qq.com.