動物源性食品中氯霉素殘留檢測方法進展

繆宇騰，郁宏燕，陸利霞，熊曉輝

(1.南京工業(yè)大學 食品與輕工學院，江蘇 南京 211800；2.昆山市市場監(jiān)督管理局 食品質(zhì)量監(jiān)管隊，江蘇 蘇州 215300)

氯霉素(chloramphenicol，CAP)是一種使用時間較長、應(yīng)用廣泛的抗生素。長期食用氯霉素殘留的食物，會使機體菌群產(chǎn)生耐藥性，導致機體正常菌群失調(diào)[1]。

美國、歐盟規(guī)定氯霉素殘留限量標準為不得檢出[2]。目前，我國對氯霉素的檢測定量方法主要包括高效液相色譜、氣相色譜等[3]。高裕鋒等[4]對廣東省7個城市水產(chǎn)品中氯霉素殘留情況進行了調(diào)研，最終水產(chǎn)品中氯霉素檢出率高達10%，且7個城市均存在氯霉素檢出的情況，情況不容樂觀。

目前，國家標準中用于氯霉素檢測的方法包括高效液相色譜、氣相色譜-質(zhì)譜以及液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜等[5]，但耗時長，檢測設(shè)備昂貴。方便快捷的氯霉素檢測方法逐漸受到關(guān)注，包括電化學生物傳感器、表面等離子體共振、壓電免疫傳感器、熒光免疫分析法和化學發(fā)光等。本文中，筆者分析了各種氯霉素檢測方法，對各方法的原理和優(yōu)缺點進行了介紹，并對氯霉素檢測未來發(fā)展方向進行了探討和展望。

1 氯霉素殘留量檢測方法

1.1 電化學傳感器(ECBSS)

ECBSS是由生物材料作為敏感元件，電極作為轉(zhuǎn)換元件，以電勢或電流作為特征檢測信號的傳感器。利用電化學傳感器進行物質(zhì)檢測時，待測物擴散進入生物活性材料，通過分子識別，產(chǎn)生生物學反應(yīng)，經(jīng)過電極等轉(zhuǎn)化為光電等信號，放大信號，最終得到待測物濃度。

近年來基于分子印跡(MIPs)的電化學傳感器成為研究熱門，傳感器以分子印跡技術(shù)作為模板的識別元件，將MIPs電活性材料修飾電極后，可以制備出用于特定識別目標分子的高靈敏傳感器[6]。

Munawar等[7]采用新型納米雜化材料構(gòu)建三維印跡納米結(jié)構(gòu)。通過兩步主要過程將銅納米粒子沉積在碳納米管上，然后在3D CNTs@Cu NPs上包覆分子印跡聚合物而形成雜化結(jié)構(gòu)，最終一層層地組裝成一個電化學傳感器用于氯霉素的檢測。結(jié)果表明在最佳實驗條件下，檢出限(LOD)為10 μmol/L。由于特定的結(jié)合位點產(chǎn)生選擇性的傳感器信號，對氯霉素有100%的選擇性，表明該方法可以用于對氯霉素的靈敏檢測。Chen等[8]使用二硫化鉬聚苯胺(MoS2/PANI)復合納米材料設(shè)計了一款用于氯霉素檢測的電化學傳感器，該傳感器檢測范圍為(1.0×10-7)～(1.0×10-4)mol/L，LOD為6.9×10-8mol/L，由于MoS2和聚苯胺(polyainlin，PANI)的協(xié)同作用，該傳感器具有特殊的三維結(jié)構(gòu)，更容易吸附氯霉素分子，故靈敏度更好。Meenakshi等[9]展示了一種無介體電化學敏感傳感器用于檢測氯霉素。通過表面活性劑輔助剝離法合成了石墨烯納米片(GNFs)修飾在玻碳電極(GCE)上。氯霉素使用無介體玻碳電極平臺進行敏感檢測，在最佳實驗條件下，LOD為0.38 nmol/L。Zhao等[10]制造了一種電化學仿生傳感器用于檢測牛奶和蜂蜜中的氯霉素殘留量，使用鉑薄膜微電極(Pt TFME)可以對樣品量較少的基質(zhì)進行檢測，在最佳實驗條件下，LOD為0.396 1 nmol/L。加標牛奶樣品檢測過程中，使用液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法(LC-MS/MS)驗證結(jié)果一致，表明該方法具有良好的準確性。Cardoso等[11]采用分子印跡和電化學傳感器的方法，設(shè)計了一款可以應(yīng)用于現(xiàn)場檢測的儀器，檢測范圍從1 nmol/L～100 μmol/L，方法簡單，操作性強，適用于現(xiàn)場的快速檢測。

相比較而言，經(jīng)過電極材料的優(yōu)化，傳感器的靈敏度被逐步提高，三維納米材料的應(yīng)用使分子吸附更加容易，克服了電化學傳感器靈敏度不高、檢測范圍較窄的缺陷。不同的分子印跡材料對傳感器的靈敏度存在不同影響。

1.2 熒光探針技術(shù)(fluorescent probe technique)

熒光探針是以熒光物質(zhì)作為指示劑，并在一定波長光的激發(fā)下使指示劑產(chǎn)生熒光，通過對所產(chǎn)生熒光的檢測，實現(xiàn)對被檢測物質(zhì)的定性或定量分析。熒光分子探針通常由識別基團、熒光基團和連接體三部分組成。由于投資小、附加值高等優(yōu)勢，廣泛應(yīng)用于日常食品檢測中。

Wang等[12-13]基于熒光共振能量轉(zhuǎn)移(fluorescence resonance energy transfer，F(xiàn)RET)和單鏈DNA結(jié)合蛋白，利用適配體及量子點與膠體金距離小于10 nm會發(fā)生能量共振轉(zhuǎn)移現(xiàn)象這一特點，將單鏈DNA結(jié)合蛋白結(jié)合到硒化鎘(CdSe)量子點上面得到QDs@SSB受體。金納米粒子上面通過Au-S鍵結(jié)合巰基化的適配體得到受體Au@apt。在最佳實驗條件下，熒光強度隨著氯霉素質(zhì)量濃度從0.005 ng/mL到100 ng/mL線性增加。LOD為3 pg/mL。檢測時間小于30 min，通過改變適配體，也可以應(yīng)用于其他物質(zhì)的檢測中。Miao等[14]采用相同原理，在Wang等[12-13]基礎(chǔ)上優(yōu)化了受體，利用納米金粒子與SiO2復合物結(jié)合形成SiO2@Au受體，可以極大地催化CdSe量子點熒光強度值的猝滅，導致熒光強度變化劇烈，并用于CAP量化。實驗結(jié)果表明，CAP檢測線性范圍為0.001～10 ng/mL，LOD為0.000 2 ng/mL。該方法檢出限更低，適用于微量殘留的檢測。Li等[15]利用靜電紡絲技術(shù)制備碲化鎘(CdTe)量子點/聚乳酸(PLA)納米熒光纖維探針，通過靜電紡絲的方法將量子點結(jié)合在纖維膜上，用于提高量子點穩(wěn)定性。在最佳實驗條件下，體系的熒光猝滅強度與氯霉素質(zhì)量濃度在10～80 μg/mL范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系，其LOD為0.814 μg/mL。結(jié)果顯示，熒光探針的方法檢測氯霉素比電化學傳感器更加靈敏，線性范圍達到了4個數(shù)量級，且檢出限比電化學方法更低。

Tan等[16]利用牛血清白蛋白穩(wěn)定的金納米團簇(BSA-AuNCs)熒光法來測定氯霉素，在最佳條件下，可以對微量的氯霉素進行檢測，其線性范圍為0.10～70.00 μmol/L，LOD為33 nmol/L(信噪比=3)，應(yīng)用于牛奶樣品的檢測時，回收率為98.4%～106%。劉長青等[17]采取類似的方法，利用BSA-Au NCs熒光體系，改良形成一種可以應(yīng)用于氯霉素檢測的新型檢測方法，此方法LOD為1.2×10-9mol/L，應(yīng)用在實際牛奶樣品的檢測時，回收率為98.8%～101.75%。

1.3 表面增強拉曼光譜技術(shù)(surface enhanced raman spectroscopy，SERS)

拉曼光譜技術(shù)是一種能提供拉曼光譜特征和光譜信息的光譜技術(shù)，然而，拉曼散射的產(chǎn)率很低，在大多數(shù)情況下都會產(chǎn)生微弱的拉曼信號[18]。表面增強拉曼光譜技術(shù)(SERS)是拉曼光譜中的一種，利用一些分子被吸附到某些粗糙的金屬(如金、銀、銅等)表面時，拉曼散射強度會增加104～106倍，SERS信號的強弱與拉曼的增強基底有著密切的關(guān)系[19]。

Ji等[20]利用膠體金納米粒子作為基底，可以顯著提高CAP的拉曼光譜信號。以1 344 cm-1處的拉曼峰作為食品樣品中CAP的定量分析指標。最佳實驗條件下，LOD為0.1 μg/mL。通過對實際雞肉樣品的測定，其變異系數(shù)為1.5%左右。Yu等[21]研究并開發(fā)了分散磁性固相微觀表面增強拉曼散射光譜技術(shù)(Dis-MSPME-SERS)。采用層層組裝的方法制備了一種多功能磁性石墨烯基底(Fe3O4@GO@Ag)，利用這種三元基底對氯霉素的殘留進行測定。在最佳實驗條件下，定量限(LQD)和LOD分別為1.0×10-8和1.0×10-10mol/L，通常情況下檢測時間<10 min。利用這種三元基底提高了靈敏度，改善了SERS難以對多種分子混合體系檢測的弊端。劉治剛[22]采用同樣的方法、基底，將其應(yīng)用在農(nóng)殘和地溝油的檢測中，同樣取得良好的效果。Ding等[23]用均勻和單分散的膠體金(Au NPs)當作該方法的底物，在最佳實驗條件下，其檢出限為1×10-8mol/L，并用HPLC對該方法進行了驗證，兩者結(jié)果一致，表明其準確性良好。

Xie等[24]通過一種新型雜化分子印跡材料(MIP-Au)作為基底，制作了一種可以應(yīng)用于快速檢測氯霉素的SERS傳感器。該傳感器可以用于實際牛奶樣品的檢測中，其檢出限為0.1 μg/mL，靈敏度不如劉長青等[17]的熒光方法，但檢測時間更短，通常在10 min內(nèi)得到結(jié)果。Yang等[25]用磁分離和表面增強拉曼光譜的方法，設(shè)計出一款新型傳感器用于氯霉素的檢測，使用抗體綴合磁珠代替固體基質(zhì)作為支持材料和分離工具，借助磁體，達到良好的富集、濃縮作用。該傳感器檢測線性范圍廣(1～1×104pg/mL),檢出限為1.0 pg/mL。Gao等[26]將分子印跡和表面增強拉曼光譜相結(jié)合(MIPs-SERS)，開發(fā)了一種生物納米傳感器，傳感器可以實現(xiàn)對牛奶、蜂蜜等實際樣品的氯霉素加標檢測，效果良好。這種傳感器價格便宜、方便快捷，最快可以在15 min內(nèi)得出結(jié)果。

SERS活性基底主要有貴金屬電極活性基底、金屬溶膠活性基底、雙金屬納米活性基底等幾類，通過開發(fā)不同的基底，靈敏度也越來越高。相比較其他方法，該方法更適合現(xiàn)場的快速檢測，相對比較完善，具有一定潛力。

1.4 色譜分析(chromatography and chromato-graphic analysis)

高效液相色譜(HPLC)是一種以液體為流動相，采用高壓輸液系統(tǒng)，將具有不同極性的單一溶劑或不同比例的混合溶劑、緩沖溶液等流動相泵入裝有固定相的色譜柱，柱內(nèi)樣品分離后，進入檢測器檢測[27]。根據(jù)檢測器的不同逐漸發(fā)展出液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法(LC-MS)和超高效液相色譜(UPLC)等。

Chu等[28]利用電紡納米纖維的固相萃取技術(shù)(PFSRE)和HPLC測定牛奶中的氯霉素，在最佳實驗條件下，LOD為0.2 mg/L，線性范圍為0.5～10 mg/L，回收率在97.5%～104.0%范圍內(nèi)。加標樣品的日內(nèi)和日間RSD分別為4.6%～7.1%和8.4%，均低于10%。證明該方法精密度良好。王安偉等[29]采用HPLC測定羅非魚中的氯霉素殘留量，在最佳實驗條件下檢測限為 0.02 μg/g，回收率為80.5%～107.1%。

Amelin等[30]使用高效液相色譜-高分辨質(zhì)譜法檢測對肉類、牛奶等7種樣品進行檢測，不僅顯示出氯霉素的存在，而且顯示出其琥珀酸的形式。在最佳實驗條件下，LOD和LQD分別為0.1 μg/kg和0.3 μg/kg。分析結(jié)果RSD<10%。分析檢測時間小于1 h。niegocki等[31]提出了一種可以測定20多種生物基質(zhì)中氯霉素的方法，提取物通過SPE柱分離后，通過LC-MS/MS以電噴霧模式分析氯霉素。該方法檢出范圍為0.10～10 μg/kg?；厥章试?2.1%～107.1%，重復性小于11.0%。

Ashraf等[32]建立了一種測定蜂蜜中氯霉素殘留量的超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(UPLC-MS/MS)，并結(jié)合電子噴霧電離技術(shù)，利用多重反應(yīng)監(jiān)測躍遷串聯(lián)質(zhì)譜法對目標物進行了鑒定，結(jié)果表明該方法定量限、決策限和決策能力分別為0.15、0.10和0.20 μg/kg。Kivrak等[33]采用和前者類似的技術(shù)，引入超聲波提取的方法，可以對蜂蜜中23種抗生素同時檢測。結(jié)果表明，氯霉素LOD、LQD分別為0.61和0.27 μg/kg。色譜分析方法靈敏度高，可重復性強，結(jié)果可靠。但是對操作人員有一定的技術(shù)要求，且方法較SERS繁瑣，檢測成本高。

1.5 免疫學技術(shù)(immunological technique)

1.5.1 酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)

酶聯(lián)免疫法，該方法核心就是讓抗體與酶復合物相結(jié)合，然后通過顯色來檢測。ELISA可用于測定抗體，也可用于測定抗原。ELISA試劑盒具有高效、靈敏、穩(wěn)定且重現(xiàn)性好等特點，廣泛應(yīng)用于醫(yī)療和食品等日常檢測中。

Tao等[34]建立了一種非常敏感的直接競爭酶聯(lián)免疫吸附試驗(CL-ELISA)，該方法用于檢測實際樣品效果良好。在最佳實驗條件下，LOD為0.7 ng/L，線性范圍為2.1～92.4 ng/L，該方法所需時間較短，15 min內(nèi)可以得到結(jié)果，適用于快速檢測實際樣品的氯霉素殘留。通過與安徽省地方標準DB34/T 821—2008酶聯(lián)免疫法的對比，優(yōu)化后的ELSA方法檢出限遠低于標準0.1 μg/kg的要求。Chughtai等[35]開發(fā)和驗證了一種直接競爭的ELISA方法。結(jié)果表明，加標后的牛奶樣品平均回收率為73%～100%，方差系數(shù)為7%～11%，決定限度(CCα)和檢測能力(CCβ)分別為0.10和0.12 ng/mL。

Jester等[36]用LC-MS/MS的方法評估了一種市場上銷售的ELISA試劑盒，驗證發(fā)現(xiàn)在加標的蟹和蝦肌肉樣品中ELISA具有良好的重復性，CAP的回收率范圍為102%～107%，表明ELISA試劑盒快檢可以應(yīng)用于對大量樣品的篩選，為以后的定量檢測做準備。

1.5.2 化學發(fā)光免疫分析(chemiluminescence immuno assay，CLIA)

化學發(fā)光免疫分析，是將具有高度靈敏的化學發(fā)光測定技術(shù)與特異性的免疫反應(yīng)相結(jié)合。當有機分子吸收化學能后發(fā)生能級躍遷，產(chǎn)生一種高能級的電子激發(fā)態(tài)不穩(wěn)定的中間體，當其返回到基態(tài)而發(fā)出光子，這就是化學發(fā)光，化學發(fā)光免疫技術(shù)通常包括2個部分，即免疫反應(yīng)系統(tǒng)和發(fā)光化學系統(tǒng)。該方法適用于各種抗原、抗體和藥物等分析檢測。

Liang等[37]開發(fā)了納米金磁性微球(Au-MNPs)的直接競爭化學發(fā)光免疫測定法(CLIA)，

通過使兩種CAP抗原(CAP堿基和CAP琥珀酸酯)固定在微球的表面上，獲得兩種不同的抑制曲線。兩種方法的50%抑制濃度(IC50)值分別約為0.044和0.072 ng/mL，LOD分別約為0.001和0.006 ng/mL。兩種方法檢出限均遠低于傳統(tǒng)ELISA方法。Wang等[38]制備了Fe3O4@SiO2磁性納米粒子(Fe-MNPs)應(yīng)用于化學發(fā)光免疫檢測。使用兩種不同類型的功能化Fe-MNP(胺官能化Fe3O4@SiO2和羧酸官能化Fe3O4@SiO2)的兩種方法檢測樣品。兩種方法的IC50值分別約為0.024和0.046 ng/mL，LOD分別約為0.000 2和0.001 ng/mL。相比較使用納米金磁性微球作為載體，該方法成本相對較低并且不影響靈敏度。

1.5.3 膠體金免疫層析技術(shù)(gold immuno chromatographic assay，GICA)

膠體金免疫層析技術(shù)是一種是以膠體金顆粒作為示蹤標志物，以顯示抗原一抗體反應(yīng)的一種免疫標記技術(shù)，膠體金在弱堿環(huán)境下帶負電荷，由于靜電作用，與蛋白質(zhì)分子的正電荷基團結(jié)合，形成牢固的金標結(jié)合物。近年來，膠體金免疫層析技術(shù)在食品安全領(lǐng)域的應(yīng)用逐漸廣泛，主要應(yīng)用于水產(chǎn)品中氯霉素的檢測。

Zhou等[39]制備了平均直徑約為20 nm的納米金顆粒，構(gòu)建膠體金免疫試紙條，檢測水產(chǎn)品中的氯霉素殘留量，該方法CAP的檢出限為0.5 ng/mL。用于實際樣品的檢測時，色譜分析時間小于10 min，在不同溫度下，色譜分析帶的儲存壽命大于90 d。Zhou等[40]建立了氯霉素、鏈霉素、四環(huán)素和β-內(nèi)酰胺類抗生素這4種抗生素的四聯(lián)體金免疫熒光分析法，對氯霉素的可視化檢測限為2.4 ng/mL;氯霉素的檢測范圍為0.019～1.2 ng/mL，線性相關(guān)系數(shù)大于0.97。通過對比地方標準(DB34/T 2254—2014)水產(chǎn)品中氯霉素殘留的檢測-膠體金法，可以發(fā)現(xiàn)兩種方法的檢出限均遠遠低于地方標準提供方法的檢出限。

免疫分析法特異性強，靈敏度高，成本低，安全可靠，但其檢測限不高，定量檢測受到一定的限制，不如色譜方法，但可以為國標方法定量檢測提供依據(jù)。檢測陽性的樣品需要通過現(xiàn)行有效的LC-MS/MS，或氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜(GC-MS/MS)驗證。

1.6 表面等離子共振技術(shù)(surface plasmon resonance，SPR)

表面等離子共振技術(shù)，根據(jù)入射光與金屬表面的等離子發(fā)生共振的原理，依靠光在其表面能量的變化來檢測分子之間的相互作用。該方法無需標記樣品，故樣品所需用量少，可以動態(tài)檢測生物分子相互作用的全過程，具有高靈敏度、檢測過程簡單等優(yōu)點。然而由于儀器價格昂貴、分析時所用芯片較多，故成本高、難以大面積推廣。目前該技術(shù)多與其他檢測技術(shù)連用，用于提高檢測靈敏度。

Xia等[41]以表面等離子共振技術(shù)為基礎(chǔ)制作了一種生物傳感器，用于檢測復雜樣品中氯霉素和慶大霉素的含量。將抗原和牛血清白蛋白(BSA)兩種結(jié)合物共同固定在傳感器芯片上，通過梯度洗脫后順序檢測，最終得出2種抗生素的含量，對于氯霉素的檢測，LOD為5.28 ng/mL。該方法提高了樣品同時檢測的能力，但氯霉素抗體的解離能力有限，該傳感器還有很大的提升空間。Kara等[42]基于MIP和SPR技術(shù)結(jié)合檢測CAP，通過MIP納米粒子制備了具有CAP識別位點的SPR納米傳感器，該傳感器對蜂蜜樣品檢出限為40 ng/kg。選擇弗洛芬尼(Flovanni，F(xiàn)LP)和甲砜霉素(thiamphenicol，TAP)作為競爭者以確定納米顆粒的選擇性，通過實驗確定CAP/TAP的選擇性常數(shù)為8.86，CAP/FLP的選擇性常數(shù)為8.36，表明該方法具有良好的選擇性。

2 不同檢測方法的比較

色譜技術(shù)是國際上公認的氯霉素殘留檢測方法，應(yīng)用于歐盟、日本和韓國等標準中，具有高靈敏度、結(jié)果準確、重復性好等優(yōu)勢。然而該方法不適合大量樣品的檢測，現(xiàn)階段單一的色譜技術(shù)已經(jīng)不能滿足國際上對氯霉素檢出限的要求，如我國2015年后使用液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜的方法全面替代傳統(tǒng)的高效液相色譜法。

免疫分析法特異性強、靈敏度高、成本低廉并且安全可靠。然而該方法檢出限不高，定量檢測受到一定限制。表面等離子共振技術(shù)具有高靈敏度、檢測過程簡單等優(yōu)點。然而由于儀器價格昂貴、分析時所用芯片較多，故成本高、難以大面積推廣。表面增強拉曼光譜技術(shù)檢測范圍極其廣，且不受樣品狀態(tài)的影響?？梢詸z測固體、流動的液體。然而該技術(shù)發(fā)展仍有待改進，優(yōu)化樣品光路、設(shè)計新型分光計等都可以進一步提高拉曼檢測能力。

電化學傳感器以其高靈敏性、高穩(wěn)定性、高選擇性以及簡捷、快速、經(jīng)濟等優(yōu)點，被廣泛應(yīng)用于氯霉素的檢測，是一種流行的檢測方法，目前關(guān)于電化學研究較為廣泛。但是目前的研究還存在線性范圍窄、離子干擾等問題，尤其是化學修飾電極的研究應(yīng)用還處在探索試驗階段，因此電化學傳感器測定氯霉素的研究還處在不斷發(fā)展中。

3 結(jié)論與展望

隨著人民生活水平的提高，食品安全問題日益成為人們關(guān)注的焦點。為了滿足實際檢測的需要，各種實驗方法也在快速發(fā)展。針對目前的研究現(xiàn)狀和實際發(fā)展，開發(fā)創(chuàng)新型的檢測方法勢在必行。筆者認為，納米材料的應(yīng)用提高了各種方法的靈敏度，如磁性納米材料的應(yīng)用、半導體量子點的應(yīng)用、納米金顆粒的應(yīng)用等，為日益嚴格的食品檢測提供了新的契機，其覆蓋了食品檢測的各個環(huán)節(jié)，包括樣品的前處理、傳感器的制備以及檢測分析信號的產(chǎn)生等。

目前氯霉素檢測方法取得了一定的進展，但由于食品基質(zhì)復雜多樣，實際樣品基質(zhì)干擾嚴重，并且氯霉素殘留量為不得檢出，單一的檢測技術(shù)已經(jīng)不能滿足檢測靈敏度的要求。前處理技術(shù)應(yīng)當與新型儀器設(shè)備組合使用，實現(xiàn)萃取進樣的智能化，使得分析更加快速簡潔化，樣品提取過程中應(yīng)當減少有機溶劑的使用，合成高選擇性的固相聚合物材料。目前可以通過固相萃取、微萃取和磁珠分離技術(shù)等樣品前處理技術(shù)與食品安全快速檢測技術(shù)聯(lián)用，建立用于復雜食品樣品分析的快速檢測方法。在未來的研究中，應(yīng)當開發(fā)小型化、便攜、穩(wěn)定性好以及靈敏度高、可定量的傳感器。

此外，各級政府及食品全鏈條應(yīng)當加強對氯霉素非法使用的監(jiān)督管理工作，從源頭上對氯霉素的使用精細管控，從而從源頭上杜絕氯霉素的非法添加。