食品中四環(huán)素殘留檢測方法比較分析

曹丁丁，陸利霞，熊曉輝

(南京工業(yè)大學(xué) 食品與輕工學(xué)院，江蘇 南京 211800)

四環(huán)素類藥物(TCs)屬于廣譜抗生素類，不僅對革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌、厭氧菌、螺旋體、支原體有良好的作用，還對衣原體和立克次體等微生物具有很強的抑制效果[1]。常見的四環(huán)素類藥物主要包括四環(huán)素(tetracycline，TC)、土霉素(oytetracycline，OTC)、金霉素(chlortetracycline，CTC)和強力霉素(doxycycline，DC)[2]，其中四環(huán)素的使用最為廣泛。由于四環(huán)素使用劑量過大、用藥時間過長，其在食品中的殘留十分嚴(yán)重，導(dǎo)致嚴(yán)重后果：一方面危害人體健康，另一方面，低濃度的四環(huán)素殘留容易誘導(dǎo)致病菌產(chǎn)生一定的耐藥性，對人類和畜禽類疾病的治療效果產(chǎn)生較大影響[3-5]。

隨著科學(xué)技術(shù)的飛速發(fā)展，四環(huán)素的檢測方法正在逐步增多和完善，如電化學(xué)適配體傳感器[6]、熒光傳感器[7]、表面增強拉曼光譜[8]和高效液相色譜[9]等技術(shù)都已被廣泛使用，本文中，筆者就四環(huán)素常用檢測方法的原理及優(yōu)缺點進(jìn)行綜述，并就目前存在的問題和未來的發(fā)展趨勢進(jìn)行總結(jié)和展望。

1 四環(huán)素的常用檢測方法

1.1 電化學(xué)適配體傳感器(electrochemical aptasensor)

電化學(xué)適配體傳感器是一種以適配體作為分子識別的接受器，通過固定化技術(shù)將其結(jié)合到感受器表面，進(jìn)行特異性識別，生成適配體-目標(biāo)分析物復(fù)合物，與產(chǎn)生的信號相關(guān)聯(lián)，利用換能器轉(zhuǎn)化為可測定的電化學(xué)信號，從而以電化學(xué)信號為變量，實現(xiàn)對目標(biāo)分析物的定量檢測[10]。與色譜法、免疫法等相比，該方法靈敏快速、簡單新穎，低成本、高收益。但是，此類傳感器壽命不長，且需定時補給電解液，比較麻煩，因此還未大面積廣泛使用，仍在探索中。

Tang等[11]通過將特定的DNA適配體與新型二氧化鈦(TiO2)納米復(fù)合材料相結(jié)合，開發(fā)出基于新型二硫化鉬-二氧化鈦@金納米顆粒(MoS2-TiO2@Au)三元復(fù)合材料的超靈敏和特異性電化學(xué)發(fā)光傳感器。該傳感器中使用的三元復(fù)合材料明顯優(yōu)于其他二元材料，其協(xié)同效應(yīng)促進(jìn)了性能的改善，在牛奶樣品中已經(jīng)能夠?qū)崿F(xiàn)定量檢測，線性范圍為1.5×10-10～6.0×10-6mol/L，檢出限為5×10-11mol/L，回收率為90%～97%，能夠很好地實現(xiàn)快速高通量檢測，是未來四環(huán)素檢測的選擇之一。

傳統(tǒng)的電化學(xué)傳感器一般僅能實現(xiàn)單一樣品的測定，各批次樣品間會出現(xiàn)差異較大、準(zhǔn)確度較低等情況。Xu等[12]基于二茂鐵(Fc)和碳納米纖維(CNF)開發(fā)出一種比例式電化學(xué)適配體傳感器，通過電流變化比率進(jìn)行測定。該傳感器很好地解決了此類問題，利用比值計算的優(yōu)勢，在10-8～10-3g/L范圍內(nèi)定量檢測四環(huán)素，檢出限為3.3×10-7g/L。同時，在對牛奶樣品的適用性方面，與超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(UPLC-ESI-MS/MS)測定的值有極好的一致性，表明在食品安全檢測中具有很大的應(yīng)用潛力。

由于阻抗技術(shù)(電化學(xué)阻抗譜(EIS))的獨特性質(zhì)和通過恒定電位電聚合對電極表面進(jìn)行修飾，Benvidi等[13]使用多壁碳納米管(MWCNTs)和電聚合的聚(L-谷氨酸)構(gòu)建了高靈敏的電化學(xué)適配體傳感器，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在最佳條件下，與Tang等[11]和Xu等[12]研發(fā)的電化學(xué)傳感器相比，該傳感器線性范圍低至1.0×10-16～1.0×10-6mol/L，檢出限低至3.7×10-17mol/L，取得了突破性進(jìn)展。目前已實現(xiàn)蜂蜜類樣品的檢測，穩(wěn)定性高、分析時間短、成本低且可多次重復(fù)利用。

禽肉類樣品中四環(huán)素的檢測一直是困擾科研工作者的難題，但He等[14]以硫堇為電活性探針，制備了基于羧基官能化多壁碳納米管和金納米顆粒復(fù)合物(COOH-MWCNTs/AuNPs/CS/Apt/AuE)的敏感電化學(xué)適配體傳感器，實現(xiàn)了禽肉類樣品中四環(huán)素檢測質(zhì)的飛躍。在最佳條件下，線性范圍為10-10～10-3mol/L，檢出限低至6×10-11mol/L，以雞肉樣品為基質(zhì)檢測時，回收率范圍為98%～109%，為現(xiàn)場檢測提供了一個很好的范本。

1.2 熒光傳感器(fluorescence sensor)

熒光傳感器是利用熒光探針為載體制備的一種新興的傳感器，相比于其他方法而言，該法靈敏度好，檢出限低，能夠?qū)崿F(xiàn)微量檢測[15]。此外，熒光傳感器還能實時在線檢測，具有解決實驗單一性問題、細(xì)胞毒性小、可測定活細(xì)胞內(nèi)不同部位的底物濃度等優(yōu)點。但熒光傳感器易受一些難以定量的可變因素干擾，且難以實現(xiàn)非常精確的檢測，此類問題仍在進(jìn)一步的研究中[16]。

Sun等[17]建立了一種基于四環(huán)素結(jié)合適配體和噻唑橙(TO)的無標(biāo)記熒光適配體傳感器，TO作為熒光探針能夠與具有G-四聯(lián)體結(jié)構(gòu)的四環(huán)素結(jié)合適配體結(jié)合，并產(chǎn)生強烈的熒光發(fā)射。在最佳條件下，該法線性范圍為0.05～100 μg/mL，檢出限為0.029 μg/mL。與其他研究相比，該法不需要對適配體或復(fù)雜儀器進(jìn)行任何修飾，檢測過程方便、均勻，在簡單混合后可直接對四環(huán)素的存在作出反應(yīng)。該法用于檢測原料乳樣品時，回收率90%～108%，時間小于1 h，為將來其他樣品的快速篩選奠定了基礎(chǔ)。

Sun等[17]的方法雖然能夠?qū)υ先橹兴沫h(huán)素進(jìn)行快速測定，但是視覺檢測的可視化程度并不顯著。Xu等[18]通過制備嵌入坡縷石(Pal)的染料分子作為熒光參照物，使用銪離子(Eu3+)作為潛在的紅色發(fā)射種子，開發(fā)出一種用于檢測四環(huán)素的比率熒光納米探針。在牛奶樣品的定量檢測中，檢出限為7.1 nmol/L，回收率為98.75%～106.04%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD，n=3)均小于3.12%。尤其是牛奶樣品中肉眼可以觀察到多色熒光，裸眼最低可檢測濃度(LDC)低至約100 nmol/L，分別低于美國食品藥品管理局(FDA)和歐盟(EU)設(shè)定的牛奶中300 ng/mL[19](676 nmol/L)和100 ng/mL[20](225 nmol/L)四環(huán)素的最大殘留限量(MRLs)。此外，該納米探針的固定化測試紙通過使用智能手機和易于訪問的彩色掃描APP作為檢測平臺，實現(xiàn)了四環(huán)素實時分析，有著廣泛的應(yīng)用前景。

無酶、無標(biāo)簽的熒光檢測方法深受科研學(xué)者的關(guān)注。Zhou等[21]基于催化發(fā)夾組裝和G-四鏈體DNA置換的新型信號放大策略，建立了一種無酶、無標(biāo)簽熒光適配體傳感器，可檢測牛奶中的四環(huán)素、土霉素、金霉素和強力霉素等4種四環(huán)素類藥物。在最佳條件下，該法線性范圍為0～1 000 μg/L，檢出限為4.6 μg/L。與其他方法相比，該熒光傳感器對目標(biāo)分析物與其他常見的不匹配獸藥具有高度的鑒別效率，未來可應(yīng)用于食品中其他四環(huán)素類藥物的檢測。

1.3 表面增強拉曼光譜(surface enhanced raman spectroscopy，SERS)

表面增強拉曼光譜克服了傳統(tǒng)拉曼光譜自身信號微弱的問題，可使待測物的拉曼信號增強106～1015倍[22]，從而達(dá)到提高靈敏度的效果。然而，現(xiàn)有的SERS 技術(shù)很難進(jìn)行定量分析，且穩(wěn)定性不夠好，該項技術(shù)還可進(jìn)一步完善。

Li等[23]開發(fā)了一種基于SERS的磁性納米球-靶向多功能方法，該方法將對巰基苯胺(PATP)嵌入的核/殼納米粒子作為標(biāo)記，并以磁芯/殼納米球作為元素識別單元，用于目標(biāo)四環(huán)素的檢測。金(Au)核和二氧化硅(SiO2)硅殼之間的錨定報告分子成功地避免了外部條件的干擾，從而提高SERS信號的穩(wěn)定性和再現(xiàn)性，RSD分別為6.61%和5.58%。在最佳條件下，釋放互補DNA-Au/PATP/SiO2(cDNA-APS)樣品的四環(huán)素濃度與SERS強度之間的相關(guān)性為0.001～100 ng/mL，檢出限為0.001 ng/mL，顯著擴(kuò)大了檢測范圍，具有良好的實用價值，已用于牛奶樣品中的摻假檢測。

現(xiàn)有的SERS技術(shù)很難進(jìn)行簡單的現(xiàn)場檢測，但Dhakal等[24]使用定制的便攜式785 nm拉曼光譜系統(tǒng)與銀膠體納米顆粒共同檢測濃度為1 000、500、100、10、1.0、0.1和0.01 mg/L的牛奶中的四環(huán)素，實現(xiàn)了現(xiàn)場檢測零的突破。在牛奶-四環(huán)素溶液中觀察到四環(huán)素振動模式為1 621、1 322 cm-1(分別從1 632、1 317 cm-1移動)。該溶液中檢測出的四環(huán)素殘余物濃度均低至0.01 mg/L。此外，在使用1 322和1 317 cm-1的峰強度來估計牛奶中四環(huán)素的濃度時，牛奶的相關(guān)系數(shù)為0.88。由此看出，這種SERS方法為今后在現(xiàn)場生產(chǎn)中四環(huán)素的定性和定量檢測奠定了基礎(chǔ)。

肉類食品中四環(huán)素殘留的SERS檢測目前已取得了較大的進(jìn)展。Zhao等[25]提出了基于表面增強拉曼光譜(SERS)的快速檢測方法，實現(xiàn)鴨肉中四環(huán)素殘留的檢測。該方法中，預(yù)處理簡單快速，使用1 558和1 272 cm-1的SERS強度比(I1272/I1558)建立SERS校準(zhǔn)曲線，鴨肉提取物中四環(huán)素的濃度與I1272/I1558呈良好的線性關(guān)系，線性回歸方程和相關(guān)系數(shù)(r)分別為y=0.017 7x+0.121 3和0.950，檢出限為1.120 mg/L，四環(huán)素的平均回收率為101%～108%，RSD為2.4%～4.6%，為禽肉中四環(huán)素的檢測方法提供了有力的保障。

1.4 高效液相色譜(high performance liquid chromatography，HPLC)

高效液相色譜法是一種常用的色譜分析技術(shù)，由于操作時間長，分析成本高，已逐漸被其他方法所取代。為了克服這些不足之處，國內(nèi)外科學(xué)家研發(fā)出快速、簡便的前處理方法與其相結(jié)合，達(dá)到了非常理想的效果。

現(xiàn)階段，常見的前處理方法有液-液萃取(liquid-liquid extraction，LLE)[26]、固相萃取(solid-phase extraction，SPE)[27]和基質(zhì)輔助固相分散萃取(matrix solid-phase dispersion，MSPD)[28]等。近年來，液-液萃取由于費時、選擇性差、溶劑消耗多以及易發(fā)生乳化現(xiàn)象等不足而逐漸被固相萃取所取代，但液-液微萃取(liquid-liquid micro-extraction，LLME)[29-30]作為一種新型微萃取技術(shù)逐漸發(fā)展起來，該方法簡單易行、耗時短、結(jié)果準(zhǔn)確且環(huán)境友好，取得了較大進(jìn)展。

Xu等[31]開發(fā)了一種新型中空纖維膜基動態(tài)液-液微萃取(HF-DLLME)與HPLC-UV檢測相結(jié)合的方法，用于檢測牛奶樣品中四環(huán)素的含量，不進(jìn)行脫蛋白和脫脂。與常用的固相萃取(SPE)方法相比，用于柱激發(fā)和洗脫過程的有機溶劑被分離出來，立即分析受體溶液。該方法主要消耗的材料是HF膜，成本明顯降低。該法檢出限低(0.95～3.6l g/L)，動態(tài)線性范圍寬，加標(biāo)樣品的回收率范圍為92.38%～107.3%，RSD低于8.66%，這是之前所有研究都未能達(dá)到的。這些數(shù)據(jù)表明HF-DLLME在分析存在于環(huán)境和生物樣品中的低水平兩性藥物方面有著非常光明的前景。

此外，磁性固相萃取(magnetic-solid phase extraction，M-SPE)[32-33]也在進(jìn)一步開發(fā)中。與常規(guī)固相萃取(SPE)填料相比，納米顆粒比表面積大，擴(kuò)散距離短，低濃度的微量萃取只需很少吸附劑和很短平衡時間就能實現(xiàn)。磁性顆粒也可以很容易地通過外加磁場從待測體系中分離和收集，避免了繁瑣的過濾或離心過程。

Zhou等[34]制備了親水性聚合物刷磁性微球(HMMs)，采用磁分散固相萃取(MDSPE)-高效液相色譜法(HPLC)測定蜂蜜中四環(huán)素類藥物的殘留。該方法檢出限和定量限分別為1.92～2.56 μg/kg和6.40～8.53 μg/kg，，在0.05、0.10和0.20 mg/kg的加標(biāo)水平下，四環(huán)素(TC)、金霉素(CTC)和強力霉素(DC)的回收率為85.8%～94.5%，RSD為1.6%～4.4%，能夠用于生物、食品和環(huán)境樣品等復(fù)雜基質(zhì)樣品中四環(huán)素類藥物的分離富集和凈化。

Wei等[35]基于氧化石墨烯/納米零價鐵(GO/nZVI)的磁性固相萃取(MSPE)實現(xiàn)了水和牛奶中四環(huán)素等6種四環(huán)素類藥物的痕量測定。該方法對于水和牛奶樣品低定量檢出限為8.05～83.19 ng/L和17.42～182.75 ng/L，加標(biāo)回收率為84.2%～105.5%，首次實現(xiàn)了水樣和牛奶樣品中的多種微量四環(huán)素類藥物的痕量檢測，大大減少了檢測時間和精力，為實現(xiàn)現(xiàn)場快速測定提供了強有力的選擇。

1.5 近紅外光譜(near-infrared reflectance spectroscopy，NIRS)

近紅外光譜是指介于中紅外光與可見光之間、波長范圍為780～2 526 nm的電磁波。近紅外光譜分析技術(shù)具有快速、無損、可在線分析等優(yōu)勢，廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)、化工、制藥和食品等許多行業(yè)的檢測中[36]。但是，近紅外光譜吸收強度弱，有效信息率低，分析難度高，操作相對復(fù)雜。

Wu等[37]將近紅外光譜技術(shù)(NIRS)與偏最小二乘法(PLS)方法相結(jié)合，研究開發(fā)出一種可用于測定牛奶中四環(huán)素的方法。該實驗中，將純牛奶和摻假牛奶各40份樣本正確地分配到100%準(zhǔn)確度的校準(zhǔn)集中，在預(yù)測集中獲得了96.3%的正確分類率。定量摻假牛奶中四環(huán)素的含量時，校準(zhǔn)和預(yù)測模型的均方根誤差分別為0.61和4.22 mg/L。相比較而言，這種基于近紅外光譜的方法能夠區(qū)分出四環(huán)素?fù)郊倥Ｄ虂碜鳛楦咝б合嗌V的補充，從而提高檢測效率。該法中聯(lián)用的PLS模型對于校準(zhǔn)集中擬合效果良好，但對于低濃度樣品，預(yù)測能力相當(dāng)有限。

因此，該方法還需進(jìn)一步的整合和改善。相信不久的將來，隨著近紅外光譜技術(shù)的發(fā)展，靈敏度和檢出限會更為精確，能夠更好地應(yīng)用于四環(huán)素的檢測當(dāng)中。

1.6 酶聯(lián)免疫技術(shù)(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)

酶聯(lián)免疫技術(shù)現(xiàn)已廣泛使用，可進(jìn)行定量或者定性分析。此方法可用于檢測大分子抗原和特異性抗體等，同時，酶的催化效率很高，能夠間接放大免疫反應(yīng)的結(jié)果，提高反應(yīng)靈敏度。與傳統(tǒng)的免疫學(xué)方法相比，特異性更高，檢測結(jié)果更為準(zhǔn)確。

Jayalakshmi等[38]用競爭性間接化學(xué)發(fā)光酶聯(lián)免疫分析(CL-ELISA)法進(jìn)行肉、牛奶和雞蛋中四環(huán)素類殘留物的測定。CL-ELISA的靈敏度比常規(guī)ELISA高2～3倍，測定牛奶中四環(huán)素的含量時，在133份牛奶樣品中，發(fā)現(xiàn)18份樣品含有四環(huán)素，質(zhì)量濃度在16～134.5 μg/L范圍內(nèi)，實現(xiàn)了快速、簡便的精準(zhǔn)測定。

Korkmaz等[39]用競爭性酶聯(lián)免疫測定法檢測59份天然松木蜂蜜樣品中四環(huán)素的殘留。59份樣品中有35份發(fā)現(xiàn)了四環(huán)素殘留，線性范圍為6～42 μg/L，24份樣品中的水平低于檢測水平(<4 μg/L)。相比較而言，該方法的檢測范圍更為精確，達(dá)到10-9級，同時，操作也更為簡單，價格更為低廉，有著非常良好的應(yīng)用前景。

此外，ELISA也可應(yīng)用于食品中多種四環(huán)素類藥物的同時檢測。Chen等[40]開發(fā)出一種敏感的四環(huán)素類特異性單克隆抗體，用酶聯(lián)免疫技術(shù)和免疫層析法檢測牛奶和蜂蜜樣品中的四環(huán)素、土霉素和金霉素的殘留量。該方法檢測出四環(huán)素的線性范圍為0.26～2.00 μg/L，四環(huán)素、土霉素和金霉素的半抑制濃度(IC50)為0.72、3.2和6.4 μg/L，牛奶樣品中三者的回收率為82%～102%、91%～105%和90%～101%，蜂蜜樣品為88%～101%、89%～101%和89%～95%。免疫層析法測定時，牛奶中三者的截斷值(即判斷標(biāo)準(zhǔn)，是判定試驗陽性與陰性的界值，用來區(qū)分某項指標(biāo)的正常與異常)為15、15和50 μg/L，蜂蜜中為40、40和40 μg/L，可提供半定量結(jié)果用于判定殘留量是否高于檢出限，具有很強的創(chuàng)新性和較大的實用價值。

1.7 表面等離子體共振(surface plasmon resonance，SPR)

表面等離子共振一般不需要對樣品進(jìn)行處理，且所需樣品量極少，一般一個表面僅需要1 mg蛋白。此外，SPR傳感技術(shù)可實時、定量檢測樣品，方便、快捷地獲得高通量、高質(zhì)量的分析數(shù)據(jù)，具有獨特的優(yōu)勢[41]。

Wang等[42]選擇典型的小分子四環(huán)素(Mw444.4 g/mol)作為模型，將適配體技術(shù)、DNA納米結(jié)構(gòu)和Biacore T200 SPR儀器結(jié)合起來，開發(fā)出一種簡單的SPR適配體傳感器。檢測蜂蜜樣品中的四環(huán)素殘留時，檢出限為0.006 9 μg/kg，比常規(guī)HPLC分析所需的檢測水平(mg/kg)高出許多個數(shù)量級。回收率為80.20%～114.3%，明顯優(yōu)于其他方法，充分顯現(xiàn)出SPR技術(shù)的高效性和準(zhǔn)確性，可作為未來四環(huán)素檢測的有力選擇。

然而，現(xiàn)階段已有的SPR傳感技術(shù)與傳統(tǒng)分析手段相比，尤其是免疫檢測手段，在檢測成本、易用性、穩(wěn)定性和檢測效率等方面還存在許多不足，這種現(xiàn)狀決定了該技術(shù)還有很大的發(fā)展空間，在研發(fā)和檢測方面還需進(jìn)一步改善。

2 不同四環(huán)素檢測方法的特點比較

電化學(xué)適配體傳感器和熒光傳感器技術(shù)是目前研究者的熱點，這兩類傳感器不僅快速靈敏、簡單新穎、低成本高效益，而且能夠?qū)崟r在線檢測、重復(fù)利用，有很強的創(chuàng)新性和借鑒價值。表面增強拉曼光譜技術(shù)[43]是一種無損檢測技術(shù)，能夠有效避免誤差，但是現(xiàn)有的檢測技術(shù)難以定量，穩(wěn)定性還需加強，仍有一定的發(fā)展空間。高效液相色譜法是研究中最常用的檢測方法，高效、快速、易于測定，但前處理比較復(fù)雜，現(xiàn)已進(jìn)行優(yōu)化，操作更為簡便。酶聯(lián)免疫法比較完善，可用于定量或定性檢測，且能與其他多項技術(shù)相結(jié)合，但是由于存在一定的交叉反應(yīng)，因此不適合作殘留確證，而適用于快速篩選。近紅外光譜和表面等離子體共振技術(shù)與其他方法相比，檢測成本高、分析難度大，穩(wěn)定性方面也有待加強，需進(jìn)一步改善才能更好地普及和投入實際樣品的檢測。

3 結(jié)論與展望

隨著社會的發(fā)展和科技的進(jìn)步，四環(huán)素的殘留問題已然成為食品安全的重大問題之一，越來越多的研究學(xué)者致力于此類藥物檢測方法的制備和完善。目前國內(nèi)外標(biāo)準(zhǔn)中所采用的檢測方法都存在不足之處，且檢測的樣品種類較為局限，操作更加方便、靈敏度更高的方法亟待開發(fā)，從而保證民眾的身體健康和環(huán)境安全。

現(xiàn)如今，四環(huán)素的檢測方法正朝著快速、簡單、有效、新穎的方向發(fā)展，進(jìn)一步降低檢出限和拓寬動態(tài)范圍已經(jīng)勢在必行。然而，這還需解決一些已經(jīng)存在的問題。例如，表面增強拉曼光譜、熒光傳感器等方法難以進(jìn)行精確的定量測定，需要與高效液相色譜等其他方法進(jìn)行多級聯(lián)用，這在一定程度上加大了檢測的難度，也增加了耗費的成本。近紅外光譜等方法有效信息率低、分析難度大，技術(shù)設(shè)備還需改進(jìn)和完善。此外，很多方法目前只在試行階段，未能投入到實際樣品的檢測，進(jìn)一步改善和優(yōu)化迫在眉睫。這些問題的存在預(yù)示著會有更先進(jìn)、更精確的技術(shù)引入，如納米技術(shù)、高通量傳感器技術(shù)和換能檢測技術(shù)等，在不久的將來一定會實現(xiàn)四環(huán)素更靈敏、更穩(wěn)定的檢測。