毓麟珠通過改善小鼠卵巢微環(huán)境防治早發(fā)性卵巢功能不全的作用機(jī)制研究

楊珍，馮遜遜，董曉英*

(1.首都醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)藥學(xué)院，北京 100069；2.首都醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，北京 100069)

早發(fā)性卵巢功能不全(POI)是2016年歐洲人類生殖及胚胎學(xué)會(ESHRE)在女性過早卵巢功能不全的管理指南上提出的概念，是介于卵巢儲備功能下降和卵巢早衰(POF)之間的一種卵巢低反應(yīng)狀態(tài)。卵巢內(nèi)卵泡池減少和卵泡功能障礙是POI的典型表現(xiàn)，是一種嚴(yán)重的內(nèi)分泌和生殖紊亂疾病[1]。臨床特點(diǎn)是女性在40歲前出現(xiàn)至少4個(gè)月以上的閉經(jīng)，每月監(jiān)測血FSH，出現(xiàn)兩次以上>40 U/L[2]。由于缺乏正常的卵泡排出，女性的月經(jīng)和受孕受到影響，嚴(yán)重影響女性的生殖和身心健康。目前，POI的發(fā)病率呈上升趨勢[3]。隨著二胎政策的出臺，這一疾病引起了越來越多學(xué)者的關(guān)注。目前，激素替代療法在西方國家非常流行，但不能有效地促進(jìn)卵泡的發(fā)育[4]。相反，中藥治療POI在改善卵巢功能、促進(jìn)卵泡發(fā)育方面取得了良好的臨床效果，引起了眾多研究者的關(guān)注[5]。

臨床中，我們通常使用動態(tài)超聲監(jiān)測卵泡。在基礎(chǔ)研究中，超高分辨率的動物超聲成像系統(tǒng)也可以無損傷地在小鼠身上完成這一過程。同時(shí)，與人體超聲一樣，超聲血流參數(shù)也可以在動物身上進(jìn)行測量。在本次實(shí)驗(yàn)中，我們選擇采用古方毓麟珠(《景岳全書·婦人規(guī)》)作為治療藥物，動態(tài)觀察其對免疫性POI卵巢形態(tài)、血流和卵泡發(fā)育的影響，結(jié)合卵巢微環(huán)境相關(guān)氧化因子的變化，動態(tài)、靜態(tài)綜合分析中藥毓麟珠通過影響POI小鼠中發(fā)生的氧化應(yīng)激反應(yīng)改善卵巢微環(huán)境，進(jìn)而改善卵巢功能的作用機(jī)制。

材料與方法

一、動物和材料

1.實(shí)驗(yàn)動物：SPF級BALB/c雌性小鼠7～8周齡40只，每只18～22 g，由北京維通利華技術(shù)有限公司提供(批號：SCXK 2012-0001)。

2.實(shí)驗(yàn)試劑：(1)陽性對照藥：使用去離子水溶解戊酸雌二醇藥片(拜耳，德國)。根據(jù)“人與動物體表面積等效劑量比例表”1 mg/(人·d)，換算小鼠服用劑量，使溶液中戊酸雌二醇濃度為0.009 mg/ml。(2)中藥制劑：毓麟珠成分包括當(dāng)歸12 g、熟地12 g、菟絲子12 g、人參6 g、花椒6 g、白術(shù)6 g、炒白芍6 g、杜仲6 g、茯苓6 g、鹿角霜6 g、川芎3 g、炙甘草3 g。飲片購自北京同仁堂科技股份有限公司。根據(jù)“人與動物體表面積等效劑量比例表”煎煮，4℃冰箱保存。確定中藥組每只小鼠按照體重每日給予中藥等效劑量0.936 g/ml，0.3 ml/只。(3)造模試劑：根據(jù)小鼠透明帶3(ZP3)的330～342個(gè)氨基酸序列(NSSSSQFQIHGPR)合成透明帶，分析純度>90%(杭州中肽)。稱取6 mg ZP3透明帶多肽粉溶于6 ml雙蒸水中，取其3 ml與3 ml弗氏完全佐劑(F5506，Sigma，美國)混勻成免疫試劑，剩余3 ml透明帶多肽溶液與3 ml弗氏不完全佐劑(F5581，Sigma，美國)混合均勻制成免疫增強(qiáng)劑。

3.實(shí)驗(yàn)設(shè)備：超高分辨率小動物彩色多普勒超聲成像系統(tǒng)MS-550 D(Vevo 2100 Imaging System，F(xiàn)ujifilm Visual Sonics Inc，美國)，探頭中心頻率為40 MHz，最高分辨率為40 m。軸向分辨率為40 m，橫向分辨率為90 m。捕獲深度為11 mm，增益達(dá)25 dB。

二、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容

1.動物模型的建立：通過陰道脫落細(xì)胞涂片篩選出性周期正常的雌性小鼠40只。隨機(jī)選擇10只小鼠作為空白組，其余30只用于造模。每只小鼠于下腹部大腿根部、避開乳頭處皮下注射0.15 ml Zp3多肽抗原劑。14 d后，每只小鼠皮下注射0.15 ml Zp3多肽抗原增強(qiáng)劑。造模期間，空白組每只小鼠予以皮下注射0.15 ml生理鹽水[6]。

2.分組和管理：造模完成后將30只小鼠隨機(jī)分成模型對照組、中藥組和陽性藥組，每組10只，加上空白組10只，共4組。陰道脫落細(xì)胞涂片顯示周期紊亂提示造模成功，第15天開始灌胃?？瞻捉M和模型對照組給予生理鹽水0.3 ml，1次/d；陽性藥組每次0.3 ml戊酸雌二醇溶液，1次/d；中藥組中藥灌胃0.3 ml，1次/d，連續(xù)6周(休息1 d/周)。

3.高頻小動物超聲系統(tǒng)：(1)小鼠備皮與麻醉：麻醉前，先用脫毛膏去除小鼠背部及兩側(cè)探針掃描區(qū)域的背毛。脫毛完成后將小鼠置于超聲專用臺上，用麻醉面罩罩住小鼠的口鼻，調(diào)節(jié)異氟醚濃度到2.5%。麻醉后，調(diào)整小鼠體位，背部朝上呈俯趴位。將電極片附著在四肢(圖1)。超聲波平臺固定在40℃的溫度下，調(diào)節(jié)異氟醚，維持1.0%～1.5%的持續(xù)吸入量。在小鼠備皮區(qū)涂抹適量的超聲波耦合劑，避免對檢查區(qū)施加壓力。(2)超聲探頭定位與二維超聲成像：首先將探頭放置在小鼠背外右側(cè)表面上方2～3 mm處來回移動，以腎臟位于卵巢的頭部一側(cè)作為標(biāo)記。探頭與小鼠身體長軸平行豎直放置即可獲得右側(cè)卵巢二維超聲圖像的縱向截面。打開“旋轉(zhuǎn)”按鈕，保存整個(gè)右側(cè)卵巢成像動態(tài)視頻(每10秒300幀)。將探頭旋轉(zhuǎn)90°，與小鼠身體長軸垂直即可獲得右側(cè)卵巢二維超聲圖像的橫斷面，使用相同的方法保存動態(tài)視頻。之后將探頭移到小鼠背外左側(cè)上方2～3 mm處，重復(fù)上述步驟，獲得左側(cè)卵巢成像。(3)卵巢血流圖像的超聲采集：將彩色采樣框架放置在小鼠背部表面對應(yīng)的卵巢區(qū)域上，調(diào)整入射角顯示卵巢間質(zhì)動脈。在卵巢基質(zhì)中觀察到動脈血流，其光譜通過脈沖多普勒顯示采集小鼠卵巢血流圖像，記錄流速值。(4)超聲影像測量及分析：在工作站對所獲左右卵巢圖像動態(tài)視頻進(jìn)行離線測量分析。二維圖像：于長軸切面測量卵巢的縱徑和前后徑，短軸切面測量卵巢的橫徑和前后徑；根據(jù)假設(shè)卵巢為橢圓體并按照橢圓體公式計(jì)算卵巢體積：卵巢體積(cm3)=縱徑×橫徑×前后徑×π/6。控制所獲取的卵巢動態(tài)視頻逐幀回放，保存每一幀圖像并計(jì)數(shù)卵泡個(gè)數(shù)及測量卵泡大小。連續(xù)記錄3～5個(gè)心動周期，分別測量卵巢動脈的收縮期峰值流速(PSV)、舒張末期流速(EDV)、阻力指數(shù)(RI)及搏動指數(shù)(PI)。

圖1 超高分辨率動物超聲成像系統(tǒng)檢測小鼠卵巢

4.動物血液采集：給藥6周后，心臟穿刺取血。小鼠血液標(biāo)本靜止，低溫高速離心機(jī)離心3 000 r/min，取上清。小鼠腹腔V形剪開分離卵巢組織放入1.5 ml Ep管中，-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

5.放射免疫測定：根據(jù)生殖激素試劑盒(南京建成)的說明，采用放射免疫法檢測血清E2、FSH、LH和AMH濃度。

6.卵巢組織中超氧化物歧化酶(SOD)、活性氧(ROS)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)和丙二醛(MDA)的測定：將子宮和卵巢組織切碎，加入蛋白裂解液，用自動研磨機(jī)將組織磨碎，4℃離心12 000 r/min，離心15 min后，吸取上清，用BCA法測定總蛋白濃度，酶標(biāo)儀測定組織中MDA、SOD、GSH-Px的吸光度值，按試劑盒(南京建成生物)描述的蛋白濃度和標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算各指標(biāo)的比值。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié) 果

一、毓麟珠對POI小鼠卵巢面積和卵泡數(shù)的影響

給藥5周后，與空白組比較，模型對照組卵巢面積縮小，卵泡數(shù)顯著減少(P<0.05)；與模型對照組相比，陽性藥組和中藥組卵巢面積均增加(P<0.05)，陽性藥組卵泡數(shù)無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，中藥組卵泡數(shù)顯著增加(P<0.05)，且顯著高于陽性藥組(P<0.05)(表1、圖2)。

表1 卵巢相對值(-±s)

注：與空白組比較，*P<0.05；與模型對照組比較，#P<0.05；與陽性藥組比較，△P<0.05

A：空白組；B：模型對照組；C：陽性藥組；D：中藥組。圖A中，紅色箭頭示卵巢動脈，藍(lán)色箭頭示卵泡

二、毓麟珠對POI小鼠卵巢動脈血流速度和血流阻力的影響

給藥5周后，動態(tài)監(jiān)測卵巢血流。圖3中，紅色和藍(lán)色區(qū)域代表卵巢中血流的分布，結(jié)果表明，各組卵巢血流均有不同程度的變化。模型對照組血流最弱，空白組血流最強(qiáng)，其余血流信號介于兩組之間。從血流動力學(xué)指標(biāo)看，模型對照組的脈壓差、搏動指數(shù)和阻力指數(shù)均顯著高于空白組(P<0.05)；與模型對照組比較，陽性藥組和中藥組的脈壓差、搏動指數(shù)和阻力指數(shù)均有顯著降低(P<0.05)，中藥組比起陽性藥組雖沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但可以看出中藥組在降低血流指數(shù)方面具有較好的趨勢(表2)。

表2 卵巢動脈血流速度和血流阻力(-±s)

注：與空白組比較，#P<0.05；與模型對照組比較，*P<0.05

A：空白組；B：模型組；C：陽性藥組；D：中藥組

三、毓麟珠對POI小鼠血清生殖激素水平的影響

與空白組比較，模型對照組FSH、LH和AMH均有顯著性差異(P<0.05)，AMH水平下降，F(xiàn)SH、LH水平升高，表明造模成功。與模型對照組比較，陽性藥組E2、AMH水平升高，F(xiàn)SH、LH水平下降，均有顯著性差異(P<0.05)；與模型對照組比較，中藥組FSH、LH水平下降，AMH水平上升，均有顯著性差異(P<0.05)；與陽性藥組比較，中藥組E2、FSH、AMH均有顯著性差異(P<0.05)，表明中藥組比起西藥雌二醇治療效果更加明顯(表3)。

四、毓麟珠對POI小鼠卵巢微環(huán)境氧化應(yīng)激指標(biāo)的影響

與空白組比較，模型對照組SOD、GSH-Px下降，ROS、MDA上升，均有顯著性差異(P<0.05)。與模型對照組比較，陽性藥組ROS、MDA下降，SOD、GSH-Px升高，均有顯著性差異(P<0.05)；與模型對照組比較，中藥組ROS、MDA下降，SOD、GSH-Px升高，均有顯著性差異(P<0.05)；與陽性藥組比較，中藥組ROS有顯著性差異(P<0.05)(表4)。

表3 血清E2、FSH、AMH、LH表達(dá)水平比較(-±s)

注：與空白組比較，#P<0.05；與模型對照組比較，△P<0.05；與陽性藥組比較，◆P<0.05

表4 卵巢組織中ROS、FSH、MDA、GSH-Px和SOD表達(dá)比較(-±s)

注：與空白組比較，#P<0.05；與模型對照組比較，*P<0.05；與陽性藥組比較，&P<0.05

討 論

POI是由原始卵泡的抑制和激活引起的。研究表明，卵泡發(fā)育的能量主要來自氧化反應(yīng)，過度氧化引起的氧化應(yīng)激反應(yīng)無疑是卵巢提前老化的原因之一。ROS是氧化應(yīng)激的標(biāo)志之一，在調(diào)節(jié)顆粒細(xì)胞的生長、增殖和凋亡方面發(fā)揮著重要的生物學(xué)作用[7]。因此，測定活性氧相關(guān)因子及其水平，可作為判斷POI發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)歸的依據(jù)[8]。卵巢微環(huán)境的改變引起血流周期性變化，影響卵泡發(fā)育中所需的營養(yǎng)物質(zhì)和激素的輸送。越來越多的研究表明，卵巢微環(huán)境的氧化應(yīng)激可影響卵泡的發(fā)育，這是POI的根本原因[9]。卵泡的發(fā)育依賴于卵巢和卵泡微環(huán)境中能量平衡的維持。POI患者的卵母細(xì)胞和顆粒細(xì)胞對抗ROS的能力降低[10]。ROS作為細(xì)胞損傷的生理誘導(dǎo)劑，是衡量氧化應(yīng)激反應(yīng)的重要生理指標(biāo)之一。在循環(huán)的月經(jīng)周期中，只有有限數(shù)量的卵泡生長發(fā)育成熟排出，大多數(shù)生長中小卵泡不會達(dá)到排卵前階段甚至經(jīng)歷閉鎖，尤其是腔前和早期腔內(nèi)階段的卵泡[11-12]。這些因素加在一起會導(dǎo)致卵巢老化。當(dāng)卵巢功能衰退為生育能力下降的主要決定因素時(shí)，我們有必要擴(kuò)大對整個(gè)卵巢微環(huán)境的研究。因此，研究卵巢微環(huán)境的變化對預(yù)示卵巢功能是否良好有著重要的指導(dǎo)作用。

毓麟珠一方首見于(《景岳全書·婦人規(guī)》)，為臨床上應(yīng)用較多的調(diào)經(jīng)方之一。全方12種藥，包括：菟絲子、鹿角霜、花椒、杜仲和八珍丸。全方溫補(bǔ)腎精，健脾生血，養(yǎng)血調(diào)經(jīng)，注重腎陰腎陽平衡，動靜結(jié)合，補(bǔ)氣養(yǎng)血，滋補(bǔ)通氣，益精助孕。臨床研究發(fā)現(xiàn)，針對脾腎陽虛型POF的30例患者經(jīng)過3～6個(gè)月給予古方毓麟珠的治療，癥狀有了顯著的緩解，血清激素水平得到了不同程度的改善，收到了較好的療效，其對月經(jīng)的影響可以在停藥后依然維持，分析中藥可能調(diào)控了自身的內(nèi)分泌軸[13]?；A(chǔ)研究發(fā)現(xiàn)，毓麟珠通過上調(diào)卵泡及卵巢間質(zhì) Bcl-2 蛋白的表達(dá)，下調(diào) Bax 蛋白的表達(dá)，抑制卵泡的過快凋亡，進(jìn)而改善卵巢功能，有促進(jìn)卵泡正常發(fā)育的作用[14]。

本研究結(jié)果表明，模型對照組小鼠FSH升高，AMH降低，這是判斷卵巢早衰的標(biāo)準(zhǔn)，說明POI造模成功；ROS升高，SOD降低，說明POI小鼠卵巢微環(huán)境氧平衡紊亂，發(fā)生氧化應(yīng)激；高頻率小動物超聲顯示模型對照組小鼠卵巢面積縮小，卵泡數(shù)顯著減少。給藥6周后，陽性藥組和中藥組FSH降低，AMH升高，且中藥組比陽性藥組FSH及AMH水平有顯著性改善。陽性藥組和中藥組ROS降低，SOD升高，中藥組ROS比起陽性藥降低顯著，提示中藥毓麟珠可顯著改善氧化酶活性，緩解卵巢組織氧化失衡，改善卵巢微環(huán)境。

由于卵泡發(fā)育過程是動態(tài)的，因此超聲動態(tài)監(jiān)測對POI的測定起著重要作用。本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步通過高頻小動物超聲動態(tài)觀察小鼠卵巢結(jié)構(gòu)和血流變化，模型對照組小鼠卵巢面積縮小，卵泡數(shù)顯著減少，中藥組和陽性藥組卵巢面積和卵泡數(shù)均增加，中藥組比陽性藥組卵泡數(shù)增加更明顯，表明毓麟珠對卵泡發(fā)育的作用比西藥雌二醇的改善效果更好。高頻小動物超聲顯示中藥組小鼠卵巢血流指數(shù)均得到改善，表明毓麟珠可降低脈動指數(shù)、阻力指數(shù)和脈壓，促進(jìn)卵泡微環(huán)境的改善。

綜合以上可以認(rèn)為，卵巢微環(huán)境缺氧狀態(tài)改善則有利于卵泡的發(fā)育。研究表明，處方中的熟地、菟絲子、杜仲、人參等多種藥物均能提高過氧化物歧化酶活性，清除體內(nèi)自由基，增強(qiáng)機(jī)體免疫力；當(dāng)歸和川芎能改善卵巢血流量[15]。因此，我們可以得出結(jié)論：中藥毓麟珠通過改善卵巢微環(huán)境、促進(jìn)卵泡發(fā)育對治療免疫性POI有積極的作用。當(dāng)然，毓麟珠具體通過影響哪些環(huán)節(jié)出現(xiàn)這種改變及作用靶點(diǎn)還不清楚，我們推測，這可能與某些通路的調(diào)節(jié)有關(guān)，還需要進(jìn)一步的研究。