木霉菌輔助合成納米銀對(duì)甜瓜的防病促生作用研究

曲明星，姚薇，高增貴，夏潤(rùn)璽，劉限*

1. 沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，遼寧 沈陽(yáng) 110866；2. 沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，遼寧 沈陽(yáng) 110866

甜瓜（Cucumis melo）枯萎病是由尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum）引起的一種重要土傳病害，全國(guó)各地都有發(fā)生（衣杰，2006），嚴(yán)重影響甜瓜品質(zhì)和產(chǎn)量，嚴(yán)重時(shí)造成甜瓜絕產(chǎn)（王志丹，2014）。近年來(lái)，枯萎病的發(fā)生越來(lái)越嚴(yán)重，防治也更加困難（李興龍等，2015）?；瘜W(xué)農(nóng)藥的使用，容易造成甜瓜品質(zhì)下降，環(huán)境污染，病原菌產(chǎn)生抗藥性（陸楚月等，2015；吳麗媛等，2014；范星菊等，2018）。因此，人們?cè)趯ふ一瘜W(xué)農(nóng)藥的替代品，采用各種天然和人工控制方法來(lái)保護(hù)植物免受這些疾病的侵害（郭海艷等，2018；劉翔等，2010；莊敬華等，2005）。

納米銀（Silver Nanoparticles，AgNPs）作為抗微生物劑已引起人們的重視（Kaur et al.，2016）。AgNPs是指粒徑在1—100 nm之間的超細(xì)銀顆粒，具有獨(dú)特的理化性質(zhì)和強(qiáng)大的殺菌活性，為生物醫(yī)學(xué)、農(nóng)業(yè)、環(huán)境和生理化學(xué)研究開(kāi)辟了新思路，逐漸得到了科學(xué)界的認(rèn)可（Seetharaman et al.，2018；Arvizo et al.，2012）。目前，AgNPs作為殺菌劑已被應(yīng)用于植物病原真菌的防治，如根腐離蠕孢（Bipolaris sorokiniana）、（Magnaporthe grisea）、瓜果腐霉菌（Pythium aphanidermatum）、油菜菌核病菌（Sclerotinia sclerotiorum）和煙曲霉（Aspergillus fumigatus）等（Jo et al.，2009；Mahdizadeh et al.，2015；Bhainsa et al.，2006）。AgNPs可通過(guò)物理、化學(xué)和生物方法獲得，物理法制備 AgNPs操作復(fù)雜，所需儀器成本高；化學(xué)法制備過(guò)程簡(jiǎn)單快速，但化學(xué)試劑的毒副作用會(huì)對(duì)人或環(huán)境造成威脅。從細(xì)菌、真菌或植物等生物中提取的還原劑和穩(wěn)定劑合成 AgNPs可用于抑制病原菌、消除植物病害且可有效降低化學(xué)方法的副作用（Prabhu et al.，2012）。真菌在參與合成AgNPs過(guò)程中由于可產(chǎn)生大量蛋白質(zhì)，且易于處理和經(jīng)濟(jì)可行而備受關(guān)注。木霉菌作為傳統(tǒng)的生防菌，代謝產(chǎn)物豐富，生長(zhǎng)速度快，環(huán)境適應(yīng)能力強(qiáng)，已有研究利用Trichoderma reesei（Gemishev et al.，2019）、T.hamatum（Abdel-Kareem et al.，2018）、T.asperellum、T.harzianum、T.virens、T.longibrachiatum和T.brevicompactum（Nandini et al.，2017）輔助合成金屬納米粒子。Elgorban et al.（2016）利用T.viride發(fā)酵液合成的AgNPs能夠抑制鮑氏志賀氏菌（Shigella boydii）、鮑曼不動(dòng)桿菌（Acinetobacter baumannii）、宋內(nèi)志賀桿菌（Shigella sonnei）和鼠傷寒沙門(mén)氏菌（Salmonella typhimurium）的生長(zhǎng)。Saravanakumar et al.（2018）利用T.atroviride（KNUP001）輔助合成的 AgNPs對(duì)大腸桿菌（Escherichia coli）、銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）和金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）的生長(zhǎng)具有抑制作用。本研究利用木霉菌合成 AgNPs來(lái)探究其對(duì)甜瓜種子萌發(fā)和對(duì)甜瓜枯萎病的防治作用，為開(kāi)發(fā)甜瓜枯萎病防控的新型藥劑和農(nóng)作物枯萎病的防治奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 微生物和種子

木霉屬真菌：T.atroviride（KJ634780.1），T.crassum（KP008865.1），T.longbranchunes（MK179408.1），T.spirale（FJ436184.1），T.virens（MK439945.1），T.afroharzianum（KR911897.1），T.koningiopsis（ LC317803.1），T.hamatum（KF294843.1），T.citrinoviride（KJ665451.1）和T.velutinum（JX500738.1），分離于柞樹(shù)（Quercus）根部，保存于沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院蠶桑實(shí)驗(yàn)室。

尖孢鐮刀菌：F.oxysporum分離于患枯萎病的甜瓜株體，來(lái)自沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院。

甜瓜種子：甜瓜種子（紅城5號(hào)）購(gòu)買(mǎi)于苗壯農(nóng)資公司。

1.1.2 培養(yǎng)基

PDA培養(yǎng)基：新鮮土豆200 g去皮切塊于蒸餾水中煮沸20 min后8層紗布過(guò)濾，過(guò)濾好的土豆液重新倒入鍋中，加入20 g葡萄糖，20 g瓊脂條，不斷攪拌直至瓊脂條完全溶解，定容至1000 mL，分裝滅菌，備用。

PDB培養(yǎng)基：新鮮土豆200 g去皮切塊于蒸餾水中煮沸20 min后8層紗布過(guò)濾，過(guò)濾好的土豆液加入20 g葡萄糖，定容至1000 mL，分裝滅菌，備用。

1.1.3 試劑

硝酸銀（分析純 AR）：西隴科學(xué)股份有限公司；次氯酸鈉（化學(xué)純CP）：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 方法

1.2.1 AgNPs的生物合成

將木霉菌在PDA培養(yǎng)基上活化后，轉(zhuǎn)入PDB培養(yǎng)基，置于搖床培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速150 r·min-1。在26 ℃下培養(yǎng)3 d后，使用無(wú)菌Whatman 1號(hào)濾紙過(guò)濾并收集發(fā)酵液。每100 mL發(fā)酵液加200 μL AgNO3（1 mol·L-1），靜置光照條件下反應(yīng)5 d。離心（10000 r·min-1，30 min）收集 AgNPs，無(wú)菌水洗滌兩次，75%乙醇洗滌1次，自然晾干，稱質(zhì)量備用。

1.2.2 AgNPs對(duì)尖孢鐮刀菌的抑菌試驗(yàn)

將 AgNPs顆粒溶于無(wú)菌水，配制成質(zhì)量濃度為10000 mg·L-1的AgNPs溶液，使用超聲波細(xì)胞破碎儀對(duì)AgNPs充分破碎后，加入到PDA培養(yǎng)基，使培養(yǎng)基中 AgNPs最終質(zhì)量濃度分別為 0 mg·L-1（對(duì)照組，下同）、25、50、100和 200 mg·L-1。晾干培養(yǎng)基后接鐮刀菌菌片，28 ℃倒置暗培養(yǎng) 7 d后，通過(guò)測(cè)量菌落直徑調(diào)查鐮刀菌生長(zhǎng)情況。3次重復(fù)。

1.2.3 AgNPs的物理化學(xué)表征

使用UV-Vis（UV-Vis U-3010，日本）在300—800 nm波長(zhǎng)范圍對(duì)AgNPs進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描。AgNPs以干燥粉末形式與KBr混合，壓片后暴露于紅外光下，在4000—500 cm-1波數(shù)范圍內(nèi)對(duì)其進(jìn)行傅里葉變換紅外光譜（FTIR，Nicolet nexus 410，美國(guó)）表征檢測(cè)。在40 kV的電壓和30 mA的電流下，以CuKα1為輻射源，2θ掃描范圍30—85°，對(duì)產(chǎn)生的AgNPs進(jìn)行X射線衍射分析晶體結(jié)構(gòu)（XRD，XPert Pro MPD，荷蘭）。將一滴AgNPs水溶液加到覆有碳膜的銅網(wǎng)上，室溫干燥，使用透射電子顯微鏡TEM（TEM，HT 7700，日本）在100.0 kV下觀察AgNPs形狀和尺寸。

1.2.4 AgNPs對(duì)甜瓜種苗生長(zhǎng)的影響

種子預(yù)處理：選取籽粒飽滿、大小均勻的甜瓜種子，無(wú)菌水清洗3次，10%次氯酸鈉浸泡30 min后用滅菌水清洗3次，于36 ℃培養(yǎng)箱中浸泡12 h后備用。

種子萌發(fā)：將用質(zhì)量濃度為 0、25、50、100、200 mg·L-1的 AgNPs溶液浸濕的濾紙分別放于培養(yǎng)皿中，每皿放 20粒種子，置于26 ℃下暗培養(yǎng)，每隔2 d加2 mL無(wú)菌水。每天觀察記錄種子萌發(fā)情況，在第 10天記錄根長(zhǎng)、莖長(zhǎng)、鮮質(zhì)量和干質(zhì)量（60 ℃烘干箱2 h）。根據(jù)公式計(jì)算發(fā)芽勢(shì)（E）和發(fā)芽率（P）。

式中，G'為5 d內(nèi)的發(fā)芽數(shù)；G為10 d內(nèi)的發(fā)芽數(shù)；T為供試種子總數(shù)。

1.2.5 AgNPs對(duì)甜瓜枯萎病的防效

采用蘸根法接種尖孢鐮刀菌，當(dāng)瓜苗長(zhǎng)約 10 cm時(shí)，將苗根部劃傷后浸于濃度約為106cfu·mL-1的鐮刀菌孢子懸液中，15 min后再轉(zhuǎn)移至含有質(zhì)量濃度為0、25、50、100、200 mg·L-1的 AgNPs水溶液培養(yǎng)皿中進(jìn)行培養(yǎng)，3 d后觀察并記錄發(fā)病情況。每處理20株，3次重復(fù)。根據(jù)公式計(jì)算發(fā)病率和病情指數(shù)。

式中，M為發(fā)病率；D為病情指數(shù)；C為總發(fā)病數(shù)；C'為各級(jí)發(fā)病數(shù)；i為相應(yīng)發(fā)病級(jí)數(shù)；I為最高級(jí)數(shù)；N為總株數(shù)。

枯萎病分5級(jí)標(biāo)準(zhǔn)。4級(jí)：主根大部變褐色及整株枯萎或枯死；3級(jí)：主根1/2以上變褐色；2級(jí)：主根變褐色或須根1/4—1/2變褐色；1級(jí)：須根1/4以下變褐色，地上無(wú)癥狀；0級(jí)：整株無(wú)病癥。

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)運(yùn)用 Excel 2016進(jìn)行初步整理、分析，運(yùn)用SPSS 21.0進(jìn)行One-way ANOVA方差分析，用Duncan法進(jìn)行多重比較，P＜0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 AgNPs對(duì)尖孢鐮刀菌的抑制作用

木霉菌輔助合成的 AgNPs均對(duì)尖孢鐮刀菌有抑制作用，在相同質(zhì)量濃度下，不同木霉菌輔助合成的AgNPs對(duì)尖孢鐮刀菌的抑制率不同，AgNPs-T.longbranchiatum的抑制率最好；AgNPs對(duì)病原菌抑制作用隨質(zhì)量濃度增高而增大，不同木霉菌合成的 AgNPs均在試驗(yàn)使用的最高質(zhì)量濃度（200 mg·L-1）下顯示最高抑制效果，其中 AgNPs-T.longbranchunes在質(zhì)量濃度為200 mg·L-1時(shí)抑制率最高（48.996%，表1）。

2.2 AgNPs-T. longbranchunes表征分析

選取對(duì)尖孢鐮刀菌具有高抑制活性的納米銀粒子AgNPs-T.longbranchunes進(jìn)行表征分析。木霉菌發(fā)酵液與AgNO3生物合成AgNPs，在樣品孵育72 h后，通過(guò)UV-Vis光譜分析（圖1A），顯示表面等離子體共振發(fā)生在 417 nm處。X射線衍射（XRD）分析（圖1B）2θ角在30°—85°之間出現(xiàn)4個(gè)強(qiáng)的特征衍射峰，其中2θ值分別對(duì)應(yīng)38°、44°、64°、77°和81°這5個(gè)衍射峰與卡（JCPDS文件號(hào)01-1167）中銀的標(biāo)準(zhǔn)圖譜十分吻合，分別對(duì)應(yīng)著（111）、（200）、（220）、（311）和（222）5個(gè)晶面，表明 AgNPs結(jié)構(gòu)為典型的面心立方結(jié)構(gòu)。FTIR分析（圖1C）結(jié)果顯示在3752.91、3676.55、3447.52、2924.43、1627.41、1383.62、1022.59 和577.11 cm-1出現(xiàn)紅外光譜吸收帶，其中 3752.91 cm-1和3676.55 cm-1處為OH基團(tuán)的反對(duì)稱伸縮振動(dòng)的肩峰，3447.52 cm-1處的寬帶振動(dòng)主要是OH伸縮振動(dòng)峰和氨基酸中 NH伸縮振動(dòng)的疊加，2924.43 cm-1處是有機(jī)酸類物質(zhì)的羧酸OH的伸縮振動(dòng)峰和亞甲基CH2不對(duì)稱伸縮振動(dòng)峰，1627.41 cm-1處是由共軛雙鍵C=C苯環(huán)骨架振動(dòng)引起的特征峰，1383.62 cm-1處是 CH3的彎曲振動(dòng)峰，1022.59 cm-1處的CO鍵伸縮振動(dòng)，是醇、酯基、醚基或酚類的CO基團(tuán)振動(dòng)峰，而577.11 cm-1與AgNPs有關(guān)。通過(guò)TEM（圖1D）觀察到AgNPs粒徑范圍為5—15 nm，且大多數(shù)是分散的。

表1 AgNPs對(duì)尖孢鐮刀菌的抑制率Table 1 Inhibitory rate of silver nanoparticles against F. oxysporum

圖1 AgNPs表征Fig. 1 Characterization of AgNPs

2.3 AgNPs-T. longbranchunes對(duì)甜瓜種苗生長(zhǎng)的影響

AgNPs-T.longbranchunes對(duì)甜瓜種苗生長(zhǎng)有明顯的影響。AgNPs質(zhì)量濃度在25 mg·L-1時(shí)發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽率、根、莖、鮮質(zhì)量和干質(zhì)量均大于對(duì)照組。當(dāng)AgNPs質(zhì)量濃度大于25 mg·L-1時(shí)影響了甜瓜種子的萌發(fā)，根、莖和鮮質(zhì)量均降低且與對(duì)照組有顯著性差異，干質(zhì)量差異不明顯。由此說(shuō)明，低質(zhì)量濃度（25 mg·L-1）AgNPs能促進(jìn)甜瓜種子萌發(fā)及生長(zhǎng)（圖2）。

2.4 AgNPs-T. longbranchunes對(duì)甜瓜枯萎病防效研究

接種鐮刀菌后，使用不同濃度 AgNPs-T.longbranchunes處理甜瓜苗，調(diào)查甜瓜幼苗的發(fā)病情況。結(jié)果表明，AgNPs-T.longbranchunes能夠降低甜瓜枯萎病的發(fā)病率和病情指數(shù)；AgNPs-T.longbranchunes濃度為25 mg·L-1時(shí)發(fā)病率為80%，感病指數(shù)為66.67，隨AgNPs-T.longbranchunes濃度增大，發(fā)病指數(shù)隨之降低，200 mg·L-1時(shí)發(fā)病率降低為 33.33%，感病指數(shù)為 23.27，說(shuō)明高濃度AgNPs-T.longbranchunes能夠有效緩解尖孢鐮刀菌對(duì)甜瓜的致病性（表2）。

3 討論

AgNPs由于具有低毒性、廣譜抗菌性、持續(xù)性好和安全性高等特點(diǎn)，近年來(lái)作為抗菌劑已被廣泛應(yīng)用于植物病害管理上（Al Abboud，2018）。本研究以不同木霉菌合成的 AgNPs對(duì)甜瓜枯萎病病原菌進(jìn)行了抑菌研究，結(jié)果表明不同木霉菌合成的AgNPs對(duì)病原菌抑制情況不同，AgNPs-T.longbranchunes對(duì)尖孢鐮刀菌具有較高的抑制作用，可降低甜瓜枯萎病發(fā)病率和病情指數(shù)。AgNPs的抑菌活性受到不同顆粒特征，如尺寸、形狀和封端劑的影響（Ahmed et al.，2016）；小粒徑的AgNPs具有更好的殺菌活性（Kumari et al.，2017），具有豐富封端劑的AgNPs是生物合成AgNPs的抗菌活性優(yōu)勢(shì)（Basha et al.，2010）。通過(guò)分析AgNPs-T.longbranchunes的表征特性，可知獲得了高度結(jié)晶的、具有穩(wěn)定封端劑的、粒徑尺寸較小且分散性好的AgNPs。

表2 不同濃度AgNPs-T. longbranchunes對(duì)甜瓜枯萎病發(fā)病和病情指數(shù)的影響Table 2 Effect of different concentrations of AgNPs-T. longbranchunes on the disease index of muskmelon wilt

圖2 不同濃度AgNPs對(duì)甜瓜種子萌發(fā)及生長(zhǎng)的影響Fig. 2 Effect of different concentrations of AgNPs on germination and growth of melon seeds

AgNPs-T.longbranchunes處理甜瓜種子，在質(zhì)量濃度為25 mg·L-1時(shí)，可促進(jìn)甜瓜種子萌發(fā)及生長(zhǎng)，增大濃度后種子萌發(fā)和生長(zhǎng)都受到一定影響。有文獻(xiàn)報(bào)道，AgNPs可提高玉米（Zea mays）、西瓜（Citrullus lanatus）、西葫蘆（Cucurbita pepo）（Almutairi et al.，2015）、日本黃瓜（Cucumis sativus）（Sotoodehnia et al.，2019）、向日葵（Helianthus annuus）、大豆（Glycine max）（Shelar et al.，2015）和狼尾草（Pennisetum glaucum）（Parveen et al.，2015）等種子的萌發(fā)率。也有研究發(fā)現(xiàn)各種納米材料對(duì) 6種植物種子萌發(fā)的輕微影響（Lin et al.，2007）。TiO2、ZnO、Al2O3和CuO等納米粒子對(duì)苜蓿（Medicago sativa）、番茄（Solanum lycopersicon）、黃瓜（Cucumis sativus）和蘿卜（Raphanus sativus）種子萌發(fā)及生長(zhǎng)具有雙重作用，低濃度下可促進(jìn)種子萌發(fā)及生長(zhǎng)，高濃度則產(chǎn)生抑制效果（Ahmed et al.，2019），這些結(jié)果與本研究結(jié)果基本一致。金屬納米粒子對(duì)植物的影響取決于金屬納米粒子的種類、質(zhì)量濃度和植物種類（Zuverza et al.，2017）。金屬納米粒子促進(jìn)植物種子發(fā)芽和增加植物生物量可能與增加植物硝酸還原酶，增強(qiáng)對(duì)水和肥料的吸收和利用能力（Yang et al.，2006；Rezaizad et al.，2019）和增加氨同化作用和相關(guān)酶的數(shù)量，有利于氨迅速轉(zhuǎn)化為有機(jī)氮有關(guān)（Salama，2012）。金屬納米粒子對(duì)植物產(chǎn)生負(fù)面作用可能是釋放的金屬離子超過(guò)了種子和幼苗吸收金屬離子的閾值水平，對(duì)植物產(chǎn)生毒害作用，也可能是高濃度的金屬納米粒子阻礙了植物根部水運(yùn)輸（Nair et al.，2014；Rastogi et al.，2017）。整體上高濃度的金屬納米粒子可能以多種方式干擾植物的新陳代謝，如通過(guò)提供微量營(yíng)養(yǎng)元素、基因的上下調(diào)節(jié)以及干擾氧化過(guò)程從而導(dǎo)致負(fù)面影響（Ahmed et al.，2019）。

4 結(jié)論

不同木霉菌輔助合成的 AgNPs對(duì)尖孢鐮刀菌具有不同的抑制效果，AgNPs-T.longbranchunes-CL抑菌效果最強(qiáng)。對(duì)AgNPs-T.longbranchunes-CL表征分析表明合成了具有高度結(jié)晶、含有穩(wěn)定封端劑，粒徑較小且單分散性好的AgNPs。試驗(yàn)使用最低質(zhì)量濃度的AgNPs（25 mg·L-1）可促進(jìn)甜瓜種子萌發(fā)及生長(zhǎng)，而高質(zhì)量濃度（＞25 mg·L-1且＜200 mg·L-1）表現(xiàn)出抑制作用。AgNPs可降低甜瓜枯萎病的發(fā)病率及病情指數(shù)。