響應(yīng)面優(yōu)化堿性蛋白酶法提取藜麥淀粉工藝

孔露，孔茂竹，余佳熹，呂遠平

（四川大學(xué)輕紡與食品學(xué)院，四川成都610065）

藜麥（Chenopodium quinoa willd），又被稱為南美藜、藜谷等，原產(chǎn)地為南美洲，是藜科藜屬的一年生草本植物，能在寒冷、干旱、瘠薄和鹽堿等條件下生長[1]。我國于上個世紀90 年代成功引進藜麥，在內(nèi)蒙古、拉薩、甘肅、青海等地繁育并且廣泛種植[2]。藜麥中的營養(yǎng)成分極為豐富，氨基酸的種類和比例均衡，并且富含膳食纖維、礦物質(zhì)和維生素等營養(yǎng)物質(zhì)[3]。此外，藜麥還含有多酚、黃酮、皂苷、生物堿等生物活性成分[4]。藜麥中淀粉含量約為49%～60%[5]，藜麥淀粉的粒徑很小，不同品種的藜麥淀粉粒徑略有不同，但總體大小約為1 μm～2 μm[6]。小顆粒的藜麥淀粉應(yīng)用廣泛，在生物可降解材料領(lǐng)域、脂肪替代物、載體材料和化妝品粉撲中均有較好的發(fā)展前景[7]。

目前關(guān)于藜麥淀粉提取方法的研究主要有稀堿法[8-9]、中性蛋白酶法[10]、復(fù)合酶法[6]等。藜麥中蛋白質(zhì)含量高達12.9%～16.5%[11]，并且淀粉和蛋白質(zhì)容易形成致密結(jié)構(gòu)[12]，同時淀粉顆粒與蛋白質(zhì)存在靜電作用、疏水作用、二硫鍵、氫鍵等[13]，影響淀粉的提取。堿性蛋白酶提取的淀粉表面具有光滑完整的結(jié)構(gòu)，采用堿性蛋白酶法提取的淀粉并未對淀粉顆粒的大小與結(jié)構(gòu)產(chǎn)生不良影響[14-15]。本試驗采用堿性蛋白酶法提取藜麥淀粉，通過Box-Behnken 試驗設(shè)計及響應(yīng)面對此工藝條件進行優(yōu)化，以確定提取藜麥淀粉的最佳工藝參數(shù)，為進一步研究藜麥淀粉性質(zhì)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

藜麥：青海綠洲種業(yè)有限公司；堿性蛋白酶（酶活100 000 U/g）：浙江綠之源食品生物科技有限公司；無水乙醚（500 mL）、鹽酸（500 mL）、氫氧化鈉（500 g）、氫氧化鉀（500 g）、硫酸（500 mL）、乙醇（500 mL）、葡萄糖（500 g）、蒽酮（5 g）、甲基紅（25 g）、溴甲酚綠（25 g）、硼酸（500 g）、硒粉（25 g）：分析純，成都科龍化工試劑廠。

1.2 儀器與設(shè)備

臺式低速離心機（TD-420 型）：四川蜀科儀器有限公司；馬弗爐（SX2-4-12 型）：鄭州恩格電子科技有限公司；凱氏定氮儀（KDN-C 型）、粗脂肪測定儀（SZF-06型）：上海新家儀器有限公司；pH 計（PHS-3C 型）：上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；紫外分光光度計（UV-1800BPC 型）：上海美譜達儀器有限公司；電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（GZX-GF101-Z-BS 型）：上海躍進醫(yī)療器械有限公司；電熱恒溫水浴鍋（HWS-26 型）：上海齊傾科學(xué)儀器有限公司；中草藥粉碎機（FW 型）：天津市泰斯特儀器有限公司；分析天平（SQP 型）：北京賽多利斯科學(xué)儀器有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 藜麥淀粉的提取

藜麥原料用中草藥粉碎機破碎，破碎后過80 目篩，除去麩皮等大顆粒物質(zhì)。取過篩后的藜麥粉，索氏抽提法除去脂肪，抽提溫度為60 ℃，乙醚回流6 次/h，抽提6 h 后取出藜麥粉，再用85%的乙醇除去可溶性糖。取脫脂脫糖后的藜麥粉，加入一定比例的堿性蛋白酶，按照1 ∶12（g/mL）的料液比加入調(diào)節(jié)至好的一定pH 值的濃度為0.1%的NaOH 溶液。將藜麥漿液放置于一定溫度的恒溫水浴鍋中進行酶解一段時間，將酶解后的藜麥漿液于25 ℃下進行離心（4 000 r/min）10 min，棄去上清液，用蒸餾水洗滌沉淀，再次于25 ℃下離心（4 000 r/min）10 min，重復(fù)3 次。將沉淀物于烘箱中以溫度40 ℃以下進行干燥，得到藜麥粗淀粉提取物。

1.3.2 主要成分測定

水分含量的測定：參考國標GB 5009.3-2016《食品安全國家標準食品中水分的測定》；脂肪含量的測定：參考GB 5009.6-2016《食品安全國家標準食品中粗脂肪的測定》；淀粉含量的測定：參考蒽酮比色法[16]；蛋白質(zhì)含量的測定：參考國標GB 5009.5-2016《食品安全國家標準食品中蛋白質(zhì)的測定》；灰分的測定：參考國標GB 5009.4-2016《食品安全國家標準食品中灰分的測定》；粗纖維的測定：參考國標GB/T 5515-2008《食品安全國家標準糧食中粗纖維測定》。

1.3.3 蒽酮比色法測定淀粉含量

1.3.3.1 葡萄糖標準曲線的制作

配制不同濃度的葡萄糖（0 %～0.8 %）標準溶液，取1 mL 溶液分別加入蒽酮試劑4 mL，在室溫（25 ℃）下靜置10 min 后，于620 nm 波長下比色。以吸光值為縱坐標，標準葡萄糖濃度（μg/mL）含量為橫坐標，做出標準曲線。標準曲線見圖1。

圖1 葡萄糖標準曲線Fig.1 Standard curve of glucose

1.3.3.2 提取淀粉吸光度測定

稱取1.000 0 g 左右的淀粉粗提物，放入50 mL 的三角瓶中，再加入沸水25 mL，在沸水中水浴10 min。冷卻后過濾稀釋，稀釋至一定比例，吸取1 mL 稀釋液，加入蒽酮試劑4 mL，于室溫（25 ℃）下靜置10 min 后，在620 nm 波長下測定樣品的吸光度。利用標準曲線計算出葡萄糖的含量，以一定系數(shù)（0.9）折換成淀粉含量，計算淀粉提取率。

1.3.3.3 提取率的計算

提取率的計算公式如下所示：

1.3.4 工藝優(yōu)化試驗說明

1.3.4.1 單因素試驗

以酶添加量、pH 值、酶解時間、酶解溫度為影響因子設(shè)計單因素試驗。

1）酶添加量對藜麥淀粉提取率的影響

固定酶解pH 9.00，酶解溫度40 ℃，酶解時間120 min，料液比 1 ∶12（g/mL），選取不同酶添加量（0%、0.20%、0.40%、0.60%、0.80%、1.00%、1.20%、1.40%）進行單因素試驗。

2）pH 值對藜麥淀粉提取率的影響

固定酶添加量0.60%，酶解溫度40 ℃，酶解時間120 min，料液比 1 ∶12（g/mL），選取不同 pH 值（7.00、8.00、9.00、10.00、11.00、12.00）進行單因素試驗。

3）酶解時間對藜麥淀粉提取率的影響

固定酶添加量0.60%，酶解pH 9.00，酶解溫度40 ℃，料液比 1 ∶12（g/mL），選取不同酶解時間（20、40、60、80、100、120、140、160、180 min）進行單因素試驗。

4）酶解溫度對藜麥淀粉提取率的影響

固定酶添加量0.60%，酶解pH 9.00，酶解時間120 min，料液比 1 ∶12（g/mL），選取不同酶解溫度（20、30、40、50、60 ℃）進行單因素試驗。

1.3.4.2 響應(yīng)面工藝參數(shù)

在單因素試驗的基礎(chǔ)上確定藜麥淀粉的最佳提取因素范圍，利用Box-Behnken 試驗設(shè)計原理設(shè)計響應(yīng)面試驗，以藜麥淀粉得率為評價指標，響應(yīng)面試驗因素與水平見表1。

表1 響應(yīng)面試驗因素與水平Table 1 Factors and levels used in single factor design

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Origin 8.5 對單因素試驗數(shù)據(jù)進行處理，采用響應(yīng)面設(shè)計軟件Design Expert 8.0.6 進行響應(yīng)面分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 藜麥原粉主要成分

藜麥原粉的主要成分見表2。

表2 藜麥原粉的主要成分Table 2 The main indexes of Chenopodium quinoa powder%

由表2 可知，藜麥原粉中淀粉含量最高，蛋白質(zhì)含量次之，高含量的蛋白質(zhì)不僅能與淀粉形成致密的結(jié)構(gòu)，影響淀粉的提取，還會影響提取淀粉的純度，因此，堿性蛋白酶可以除去藜麥淀粉中的蛋白質(zhì)，保證藜麥淀粉的純度。

2.2 單因素試驗

2.2.1 酶添加量對淀粉提取率的影響

酶添加量對淀粉提取率的影響見圖2。

圖2 酶添加量對淀粉提取率的影響Fig.2 Effect of the amount of enzyme addition on the starch extraction rate

由圖2 可知，當(dāng)酶添加量為0.60%時，藜麥淀粉的提取率達到最高值。這是由于隨著酶濃度的不斷升高，酶與底物的作用與接觸面積持續(xù)增加，導(dǎo)致酶解反應(yīng)速率增大。當(dāng)酶添加量大于0.60%時，提取率下降，是因為當(dāng)酶的濃度達到一定值時，酶的含量持續(xù)增加導(dǎo)致底物分解，底物濃度相對較低，酶與底物觸面積減少，并且與底物結(jié)構(gòu)相同的分子結(jié)合酶的活性中心，對堿性蛋白酶產(chǎn)生抑制作用，導(dǎo)致淀粉提取率降低[17]。

2.2.2 pH 值對淀粉提取率的影響

pH 值對淀粉提取率的影響見圖3。

圖3 pH 值對淀粉提取率的影響Fig.3 Effect of pH value on the starch extraction rate

由圖3 可知，曲線在pH 值為9 時出現(xiàn)最高轉(zhuǎn)折點，這可能是由于在該pH 值下的堿性蛋白酶的酶活力最高，酶解作用最強，同時在堿和酶的作用下，藜麥蛋白中一些特定的氨基酸基團暴露在外面，有利于堿性蛋白酶的內(nèi)外切同時作用[18]。當(dāng)pH 值大于10 時，提取率呈明顯下降趨勢，可能是由于堿性太強導(dǎo)致蛋白酶變性，酶失去活力，無法與底物作用，導(dǎo)致提取率降低。

2.2.3 酶解時間對淀粉提取率的影響

酶解時間對淀粉提取率的影響見圖4。

圖4 酶解時間對淀粉提取率的影響Fig.4 Effect of enzymolysis time on the starch extraction rate

由圖4 可以看出，適宜提取時間為120 min。當(dāng)酶解時間小于120 min 時，堿性蛋白酶與底物作用時間較短，酶解不充分導(dǎo)致提取率不高。120 min 時酶解反應(yīng)基本完成，繼續(xù)增加時間對提取率貢獻不大，底物被分解完全。提取率明顯降低可能是因為堿性蛋白酶將與淀粉分子結(jié)合的蛋白質(zhì)除去后，淀粉更容易被水解，提取時間過長導(dǎo)致淀粉進一步水解為可溶性單糖，單糖在后續(xù)離心洗滌中被除去。

2.2.4 酶解溫度對淀粉提取率的影響

酶解溫度對淀粉提取率的影響見圖5。

圖5 酶解溫度對淀粉提取率的影響Fig.5 Effect of enzymolysis temperature on the starch extraction rate

由圖5 可知，40 ℃時藜麥淀粉提取率最高。溫度對酶活力的影響非常大，從20 ℃到40 ℃，提取率呈上升趨勢，溫度升高使酶促反應(yīng)反應(yīng)速度加快。當(dāng)溫度上升到40 ℃時，酶促反應(yīng)速度達最大值。這是由于當(dāng)酶在其最適溫度范圍內(nèi)，酶活性最強并且與底物持續(xù)作用，酶促反應(yīng)速度達到最大值，藜麥淀粉提取率最高。但如果超過40 ℃繼續(xù)升溫，高溫使酶促反應(yīng)速度下降，這是由于反應(yīng)溫度過高使得蛋白酶變性，酶活力降低，導(dǎo)致提取率下降。

2.3 響應(yīng)面分析

2.3.1 Box-Behnken 設(shè)計及提取結(jié)果

根據(jù)單因素試驗的結(jié)果，固定料液比1∶12（g/mL），選取酶添加量、pH 值、酶解時間、酶解溫度進行四因素三水平響應(yīng)面優(yōu)化試驗。利用Design-Expert.8.0 軟件的Box-Behnken 中心組合試驗設(shè)計方案，試驗方案及結(jié)果見表3。

表3 Box-Behnken 設(shè)計及提取結(jié)果Table 3 Box-Behnken design and extraction results

2.3.2 回歸模型的建立和顯著性分析

利用Design-Expert 8.0 軟件對表3 數(shù)據(jù)進行多元回歸擬合，獲得各個因素與淀粉提取率之間的二次多項回歸方程為：Y=88.44-0.39A+1.61B+1.37C-0.075D+2.02AB-1.18AC+0.60AD-0.72BC+3.40BD-0.098CD-8.71A2-10.51B2-10.36C2-0.96D2。

該模型的有效性和顯著性分析見表4。

表4 回歸模型的方差分析Table 4 Variance analysis of regression model

由表4 可知，P 值＜0.000 1，故回歸模型極顯著，失擬項＞0.05，失擬項不顯著，說明回歸模型與實際情況很好地進行了吻合，試驗誤差小，可以用此模型對藜麥淀粉的提取率進行分析和預(yù)測。模型中一次項B、C極顯著，A、D 不顯著。交互項 AB、BD 極顯著，AC 顯著，AD、BC、CD 不顯著。二次項 A2、B2、C2極顯著，D2顯著。

根據(jù)回歸模型的方差分析結(jié)果可知，交互項AB、BD 極顯著，AC 顯著，為了更直觀地反映出各個交互項對藜麥淀粉提取率的影響，分別繪制出相應(yīng)的三維響應(yīng)面分析圖和等高線圖，各因素的交互作用見圖6、圖 7 和圖 8。

三維響應(yīng)面分析圖和等高線圖可以直觀地反映出各個因素對藜麥淀粉提取率的影響。曲面越陡峭，說明該因素對提取得率的影響越大，交互作用越顯著。等高線形狀為橢圓表示兩因素間的交互作用顯著[19]。從圖6 中可以看出pH 值對應(yīng)的曲面較陡，說明pH 值對藜麥淀粉提取率的影響較大，等高線圖為橢圓形說明pH 值和酶添加量的交互作用顯著。

圖6 AB 交互作用對藜麥淀粉提取率影響的響應(yīng)面圖和等高線圖Fig.6 Response surface plots and contour plots of AB interaction on the extraction rate of Chenopodium quinoa starch

圖7 AC 交互作用對藜麥淀粉提取率影響的響應(yīng)面圖和等高線圖Fig.7 Response surface plots and contour plots of AC interaction on the extraction rate of Chenopodium quinoa starch

圖8 BD 交互作用對藜麥淀粉提取率影響的響應(yīng)面圖和等高線圖Fig.8 Response surface plots and contour plots of BD interaction on the extraction rate of Chenopodium quinoa starch

圖7 中酶添加量對提取率的影響比酶解溫度更大，從等高線圖可以看出酶解溫度和酶添加量交互顯著。

圖8 中pH 值對提取率的影響比酶解溫度大，等高線圖說明pH 值和酶解溫度有顯著的交互作用。

2.3.3 驗證試驗

由Design-Expert 8.0 軟件分析可知，最大響應(yīng)值對應(yīng)的因素條件為酶添加量為0.598%，pH 值為9.09，酶解時間為122 min，酶解溫度為40.60 ℃。在最佳提取工藝條件下，藜麥淀粉提取率的預(yù)測值為89.26%。為了驗證回歸模型預(yù)測值的準確性，對響應(yīng)面分析得到的最佳工藝條件進行驗證試驗，經(jīng)過3 次平均試驗，得出藜麥淀粉的主要成分見表5。

表5 藜麥淀粉的主要成分Table 5 The mainl indexes of Chenopodium quinoa starch%

由表5 可以看出藜麥淀粉的水分含量、脂肪含量、粗纖維含量與灰分含量比起藜麥原粉均有所下降，這是由于在淀粉提取過程中進一步被除去。藜麥淀粉實際提取率為（89.09±0.15）%，與理論預(yù)期值的相對誤差為0.19%，兩者相比無顯著性差異，并且蛋白質(zhì)的殘留量為1%，說明經(jīng)堿性蛋白酶處理的藜麥淀粉蛋白質(zhì)含量降低，可以將藜麥淀粉應(yīng)用于蛋白含量低的變性淀粉中或者用于制備藜麥淀粉-硬脂酸復(fù)合物[20]。

3 結(jié)論

本研究采用堿性蛋白酶提取青海高原藜麥淀粉，經(jīng)響應(yīng)面優(yōu)化后的最佳工藝條件為：酶添加量0.598%，pH 值 9.09，酶解時間 122 min，酶解溫度 40.60 ℃。在此條件下，對藜麥淀粉進行提取并測定蛋白質(zhì)殘留率。結(jié)果表明藜麥淀粉提取率為（89.09±0.15）%，蛋白質(zhì)殘留率為（1.02±0.46）%，經(jīng)提取后的藜麥淀粉其水分含量、脂肪含量、粗纖維含量與灰分含量比起藜麥原粉均有所降低。驗證試驗值與預(yù)測試驗值相對誤差為0.19%，說明可以用此回歸模型對藜麥淀粉提取率進行分析與預(yù)測。