酸解法制備五倍子抗腐敗希瓦氏菌活性物質(zhì)的工藝

鄭洪偉，馮佳，吳杰，王鑫彤，陳慧，王樂，曹曦，張菲，郭雷，2，*

（1.江蘇海洋大學江蘇省海洋生物資源與環(huán)境重點實驗室，江蘇連云港 222005；2.江蘇省海洋資源開發(fā)研究院，江蘇連云港 222004）

微生物活動是引起生鮮水產(chǎn)品腐敗變質(zhì)的主要原因。冷藏是延長水產(chǎn)品貨架期的最常用的方法，但仍有少數(shù)微生物能在低溫下生存繁殖并產(chǎn)生腐敗異味和臭味的代謝產(chǎn)物，這樣的微生物稱之為特定腐敗菌[1-2]。研究表明，在有氧冷藏條件下，腐敗希瓦氏菌（Shewanella putrefaciens）是大黃魚、帶魚和南美白對蝦等水產(chǎn)品冷藏過程中特定腐敗菌之一[3-4]。腐敗希瓦氏菌歸屬于弧菌科希瓦氏菌屬（Shewanella），是嗜冷性的革蘭氏陰性運動桿菌，其能把氧化三甲胺還原為三甲胺，產(chǎn)生硫化氫，腐敗時出現(xiàn)酸臭味等異味，最終導致水產(chǎn)品的腐敗變質(zhì)[5]。

中草藥因其不易產(chǎn)生抗藥性、藥物殘留低、毒副作用小，在替代抗生素資源開發(fā)方面引起了越來越多的重視和關(guān)注[6-7]。五倍子為漆樹科植物鹽膚木（Rhus chinensis Mill.）、青麩楊（Rhus potaninii Maxim.）或紅麩楊（Rhus punjabensis Stew.var.sinica （Diels）Rehd.et Wils.）葉上的蟲癭，主要由五倍子蚜（Melaphis chinensis（Bell）Baker）寄生而形成[8]。五倍子是我國傳統(tǒng)中藥之一，具有抗菌、抗病毒、抗氧化、防齲、抗癌、護肝、止瀉、抗炎、抗凝血等活性，已被農(nóng)業(yè)部批準用于水產(chǎn)動物細菌性疾病的防治[9-11]。五倍子的主要化學成分為鞣質(zhì)和沒食子酸。鞣質(zhì)又稱鞣酸、單寧酸，是五倍子的主要成分，含量可達70%[12]。五倍子鞣質(zhì)是一混合物，是一分子葡萄糖與1～10 個分子的沒食子酸縮合而成[13-14]。沒食子酸是五倍子的主要有效成分，在五倍子中的含量約為2%～4%，其可通過水解五倍子鞣質(zhì)而得[15-16]。

本研究對酸解法制備五倍子抗腐敗希瓦氏菌活性物質(zhì)過程中影響五倍子提取液抗菌活性的4 個主要影響因素（鹽酸濃度、酸解溫度、酸解時間和液料比）進行單因素試驗，在單因素試驗結(jié)果的基礎(chǔ)上，采用Box-Behnken 試驗設(shè)計和響應面法對酸解法制備五倍子抗菌物質(zhì)的工藝進行優(yōu)化，以期為進一步鑒定和開發(fā)五倍子抗腐敗希瓦氏菌活性物質(zhì)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

五倍子：安徽亳州中藥廠，經(jīng)粉碎機粉碎后，過40目篩備用；腐敗希瓦氏菌QL-1（Shewanella putrefaciens），由江蘇海洋大學微生物天然產(chǎn)物化學實驗室保存；牛肉膏、蛋白胨、瓊脂、鹽酸、氫氧化鈉均為分析純：國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

QJ32W1000A 型高速萬能粉碎機：天津泰斯特儀器有限公司；HH-4 型數(shù)顯恒溫水浴鍋：金壇市榮華儀器制造有限公司；DUG-9240D 型電熱鼓風干燥箱：上海一恒科學儀器有限公司；BS 124S 電子分析天平：北京賽多利斯科學儀器有限公司；GL25M 型低溫高速離心機：金壇區(qū)金城春蘭實驗儀器廠；RE-52A 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海青浦滬西儀器廠；CCA-20 型低溫冷卻水循環(huán)泵：上海一凱儀器設(shè)備有限公司；SHZ-D（III）型循環(huán)水真空泵：鞏義市予華儀器有限公司，YXQ-LS 型立式壓力蒸汽滅菌器：上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；SW-CJ-1F 型單人雙面凈化工作臺：蘇州凈化設(shè)備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 單因素試驗

單因素試驗中分別考察鹽酸濃度、酸解溫度、酸解時間和液料比對五倍子提取物抗菌活性的影響。

鹽酸濃度：稱取5 份五倍子粉1.0 g 放入錐形瓶內(nèi)，各加入 2、3、4、5、6 mol/L 的鹽酸溶液 20 mL，搖勻，使鹽酸與五倍子粉末充分混合，于80 ℃水浴酸解3 h。酸解液經(jīng)抽濾后，取濾液用4 mol/L NaOH 調(diào)pH 值至中性，定容到100 mL，然后于5 000 r/min 離心10 min，上清液即為五倍子提取液。取上清液測定抗菌活性。

酸解溫度：稱取5 份五倍子粉1.0 g 放入錐形瓶內(nèi)，并加入3 mol/L 的鹽酸溶液20 mL，混合均勻，分別于 60、70、80、90、100 ℃水浴酸解 3 h。酸解液經(jīng)抽濾后，取濾液用4 mol/L NaOH 調(diào)pH 值至中性，定容到100 mL，然后于5 000 r/min 離心10 min，取上清液測定抗菌活性。

酸解時間：稱取5 份五倍子粉1.0 g 放入錐形瓶內(nèi)，并加入3 mol/L 的鹽酸溶液20 mL，混合均勻，于100 ℃水浴分別酸解 1、2、3、4、5 h。酸解液經(jīng)抽濾后，取濾液用4 mol/L NaOH 調(diào)pH 值至中性，定容到100 mL，然后于5 000 r/min 離心10 min，取上清液測定抗菌活性。

液料比：稱取5 份五倍子粉1.0 g 放入錐形瓶內(nèi)，并分別加入 3 mol/L 的鹽酸溶液 10、20、30、40、50 mL，混合均勻，于100 ℃水浴酸解3 h。酸解液經(jīng)抽濾后，取濾液用4 mol/L NaOH 調(diào)pH 值至中性，定容到100 mL，然后于5 000 r/min 離心10 min，取上清液測定抗菌活性。

1.3.2 響應面法優(yōu)化

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，采用酸解溫度100 ℃，以鹽酸濃度、酸解時間和液料比為設(shè)計的3 個變量，五倍子提取液的抗菌活性為響應值，進行三因素三水平共17 個試驗的Box-Behnken 設(shè)計（表1）。利用Design Expert 7.0 軟件構(gòu)建模型、分析方差及預測最優(yōu)值[17]。

1.3.3 抗菌活性的測定

利用瓊脂擴散法測定五倍子提取液的抗腐敗希瓦氏菌活性[18]。將冷卻至50 ℃左右的牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基倒入直徑約90.00 mm 的培養(yǎng)皿內(nèi)，每個培養(yǎng)皿加20mL 左右。培養(yǎng)基凝固后，取200μL1×106個/mL～2×106個/mL 腐敗希瓦氏菌液均勻涂布于培養(yǎng)基上，放置20 min。然后在培養(yǎng)皿內(nèi)放置牛津杯，將200 μL 待測液加入牛津杯內(nèi)，32 ℃培養(yǎng)24 h，用游標卡尺測量抑菌圈直徑，試驗平行進行3 次，抗菌活性大小以抑菌圈直徑的平均值（mm）表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗結(jié)果

2.1.1 鹽酸濃度對五倍子提取物抗菌活性的影響

鹽酸濃度對五倍子提取液抗菌活性的影響如圖1所示。

圖1 鹽酸濃度對五倍子提取物抗菌活性的影響Fig.1 Effect of concentration of HCl on actibacterial activity of the extracts of Galla chinensis（GCE）

從圖1 可以看出，當鹽酸濃度在3 mol/L～4 mol/L時，五倍子提取液的抗菌活性保持在較高水平，因此在其他的單因素試驗中，采用3 mol/L 的鹽酸溶液進行酸解。

2.1.2 酸解溫度對五倍子提取物抗菌活性的影響

酸解溫度對五倍子提取液抗菌活性的影響如圖2所示。

圖2 溫度對五倍子提取物抗菌活性的影響Fig.2 Effect of temperature on actibacterial activity of GCE

從圖2 可以看出，隨著溫度的增加，五倍子提取液的抗菌活性也隨之增大，100 ℃時最大，因此將酸解溫度定為100 ℃。

2.1.3 酸解時間對五倍子提取物抗菌活性的影響

酸解時間對五倍子提取液抗菌活性的影響如圖3所示。

圖3 時間對五倍子提取物抗菌活性的影響Fig.3 Effect of time on actibacterial activity of GCE

從圖3 可以看出，隨著時間的增加，五倍子提取液的抗菌活性也隨之增大，4 h～5 h 時趨于穩(wěn)定，因此將3、4、5 h 定為響應面優(yōu)化時酸解時間的3 個水平。

2.1.4 液料比對五倍子提取物抗菌活性的影響

液料比對五倍子提取液抗菌活性的影響如圖4所示。

圖4 液料比對五倍子提取物抗菌活性的影響Fig.4 Effect of liquid/material ratio on actibacterial activity of GCE

從圖4 可以看出，隨著液料比的增加，五倍子提取液的抗菌活性也隨之增大，液料比為50（mL/g）時抗菌活性最強，因此將 40、50、60（mL/g）作為響應面優(yōu)化時液料比的3 個水平。

2.2 響應面法優(yōu)化

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，酸解溫度定為100 ℃，以鹽酸濃度（2、3、4 mol/L）、時間（3、4、5 h）和液料比[40、50、60（mL/g）]為響應面法優(yōu)化的 3 個因素及 3 個水平，五倍子提取液的抗菌活性為響應值（Y），進行總共17個試驗的Box-Behnken 設(shè)計。試驗設(shè)計變量因素的編碼值、實際值及其響應值如表1 所示。利用Design Expert 7.0 軟件進行模型構(gòu)建和方差分析見表2。通過對試驗數(shù)據(jù)進行多元回歸分析，得出反映測試變量與響應變量關(guān)系的二階多項式方程：

表1 Box-Behnken 設(shè)計方案與結(jié)果Table 1 Coded（actual）levels of the operational parameters and observed values of Box-Behnken design

表2 響應面分析試驗方差分析結(jié)果Table 2 ANOVA for the quadratic response surface model

從表2 可以看出，模型的P 值小于0.05，而失擬項的P 值大于0.05，說明構(gòu)建的模型是顯著的，并且能用于變量優(yōu)化的預測。液料比、鹽酸濃度與溫度的交互作用和鹽酸濃度的二次項達到顯著水平，時間的效應達到極顯著水平，測試變量對響應變量的影響效應也可從其兩兩交互作用的響應面圖進行觀察（圖5）。通過對上述方程進行回歸分析，模型預測的最佳工藝為鹽酸濃度4 mol/L、時間5 h 和液料比45 mL/g，預測的抗菌活性為22.63 mm。在最佳酸解工藝下進行驗證試驗，五倍子提取液的實際抗菌活性為（23.68±0.68）mm（n=4），與預測值沒有顯著差異，說明響應面法應用于優(yōu)化酸解法制備五倍子抗腐敗希瓦氏菌活性物質(zhì)的工藝是可行的。

圖5 兩個因素交互作用的響應曲面Fig.5 Response surface plots for the interactions of two variables on actibacterial activity of GCE

3 結(jié)論

采用單因素試驗、Box-Behnken 試驗設(shè)計結(jié)合響應面法對酸解法制備五倍子抗腐敗希瓦氏菌活性物質(zhì)的工藝進行了優(yōu)化，最佳的酸解工藝為：鹽酸濃度4 mol/L、液料比45 mL/g、溫度100 ℃時提取5 h。五倍子提取液的實際抗菌活性為（23.68±0.68）mm，與預測值（22.63 mm）沒有顯著差異，表明響應面法應用于優(yōu)化酸解法制備五倍子抗腐敗希瓦氏菌活性物質(zhì)的工藝是可行的。本研究為進一步鑒定和開發(fā)五倍子抗腐敗希瓦氏菌活性物質(zhì)提供了依據(jù)。