菌株和培養(yǎng)基質(zhì)對(duì)蟲(chóng)草菌質(zhì)主要營(yíng)養(yǎng)成分和活性成分的影響

楊宗渠，李長(zhǎng)看，雷志華，曲金柱，李坤陶，孔慶寒，羅青

（1.鄭州師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，河南鄭州450044；2.河南省涉鳥(niǎo)故障工程技術(shù)研究中心，河南鄭州450044；3.鄭州師范學(xué)院生物物種資源研究中心，河南鄭州450044）

冬蟲(chóng)夏草是我國(guó)特有的名貴中藥資源，是由冬蟲(chóng)夏草菌（Cordyceps sinensis）侵染鱗翅目蝙蝠蛾幼蟲(chóng)后發(fā)育而成的由子座和菌核組成的菌體，具有補(bǔ)肺益腎、止血、化痰等功效。冬蟲(chóng)夏草含有腺苷、蟲(chóng)草素、蟲(chóng)草多糖、蟲(chóng)草酸、甾醇類物質(zhì)，及多種氨基酸、維生素和礦物質(zhì)元素[1]?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明，冬蟲(chóng)夏草有抗腫瘤、抗菌、抗氧化、抗衰老、降血壓、調(diào)節(jié)內(nèi)分泌、提高免疫力、鎮(zhèn)靜、抗心肌缺血以及調(diào)節(jié)心率等功效[2]。冬蟲(chóng)夏草的生長(zhǎng)對(duì)寄主和環(huán)境條件的要求非常嚴(yán)苛，主要生長(zhǎng)在高海拔雪域地區(qū)，產(chǎn)量很低。市場(chǎng)對(duì)冬蟲(chóng)夏草的需求量日益增加，價(jià)格飆升，造成對(duì)冬蟲(chóng)夏草的肆意采挖，使這一珍貴的野生物種資源瀕臨滅絕。在冬蟲(chóng)夏草人工培育技術(shù)尚未成熟的情況下，通過(guò)發(fā)酵法生產(chǎn)冬蟲(chóng)夏草菌絲體，以菌絲體活性成分替代天然冬蟲(chóng)夏草的藥用價(jià)值受到人們的關(guān)注[3]。王尊生等[4]分析了冬蟲(chóng)夏草菌絲體固體發(fā)酵粉的化學(xué)成份，指出蟲(chóng)草發(fā)酵粉中3′-脫氧腺苷，甘露醇的含量明顯高于冬蟲(chóng)夏草，其它化學(xué)成份和冬蟲(chóng)夏草相應(yīng)成份基本一致。陳建國(guó)等[5]對(duì)冬蟲(chóng)夏草菌絲體進(jìn)行了安全性毒理學(xué)評(píng)價(jià)，證實(shí)冬蟲(chóng)夏草菌絲體屬無(wú)毒級(jí)。韋會(huì)平等[6]用蛹蟲(chóng)草為發(fā)酵菌株、大米為基質(zhì)生產(chǎn)蟲(chóng)草素，經(jīng)過(guò)約13 d的培養(yǎng)，培養(yǎng)基中蟲(chóng)草素達(dá)到0.60%，比傳統(tǒng)液體發(fā)酵方法的最高產(chǎn)量高出近2 倍。吳彩琴等[7]以豆粕和米糠為培養(yǎng)基質(zhì)，采用固體發(fā)酵生產(chǎn)冬蟲(chóng)夏草多糖，在適宜的工藝條件下，菌質(zhì)中多糖含量達(dá)到16.991 mg/g。由于試驗(yàn)菌株和發(fā)酵基質(zhì)的不同，文獻(xiàn)報(bào)道的固體發(fā)酵工藝條件和活性成分產(chǎn)率差別較大。本文以小麥為發(fā)酵基質(zhì)，通過(guò)固體發(fā)酵培養(yǎng)蟲(chóng)草菌絲體，分析菌質(zhì)中活性成分和主要營(yíng)養(yǎng)成分的含量，從而找出活性成分含量高的蟲(chóng)草菌株和固體培養(yǎng)基質(zhì)，為蟲(chóng)草固體發(fā)酵提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)菌株

試驗(yàn)的蟲(chóng)草菌株分別由廣東省微生物研究所和河南農(nóng)業(yè)大學(xué)提供，編號(hào)分別為ZNB2.1 和ZNB2.2。

1.1.2 試劑

葡萄糖：天津市天力化學(xué)試劑有限公司；苯酚：天津市北聯(lián)精細(xì)化學(xué)品開(kāi)發(fā)有限公司；濃硫酸：廣州萬(wàn)從化工有限公司；氯化鈣：無(wú)錫市亞泰聯(lián)合化工有限公司；碘：天津市津北精細(xì)化工有限公司；二甲基亞砜（分析純）：天津市申泰化學(xué)試劑有限公司。

1.1.3 儀器與設(shè)備

LDZX-50FB 型高壓蒸汽滅菌鍋：上海申安醫(yī)療器械廠；DH-420 型電熱恒溫培養(yǎng)箱：北京科偉永興儀器有限公司；TU-1901 紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)：北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；Resesrch plus 移液器：德國(guó)Eppendorf 公司。

1.2 方法

1.2.1 培養(yǎng)基質(zhì)的制備

用清水將麥粒清洗2 遍，浸泡12 h 后撈出，放入鍋中加熱直至鍋內(nèi)水沸騰，煮沸20 min，待麥粒充分吸水膨脹但不開(kāi)裂時(shí)撈出，瀝去多余的水分。然后將麥粒攤晾至麥粒表面無(wú)水分，配制成5 種培養(yǎng)基質(zhì)。A：小麥100%；B：小麥50%、燕麥30%、玉米20%；C：小麥50 %、燕麥30 %、糙米 10 %、谷子10 %；D：小麥50%、燕麥30%、蕎麥5%、高粱 5%、玉米10%；E：小麥50%、燕麥30%、糙米5%；玉米8%、高粱7%。將不同配方的培養(yǎng)基質(zhì)分裝于500 mL 菌種瓶中，每瓶裝干料150 g，121 ℃下殺菌2 h。每個(gè)配方4 次重復(fù)。

1.2.2 接種和培養(yǎng)

在無(wú)菌條件下，將蟲(chóng)草母種接種到經(jīng)過(guò)高壓殺菌的培養(yǎng)基質(zhì)上，接種后的菌種瓶置于25 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行避光培養(yǎng)。

1.2.3 蟲(chóng)草多糖含量測(cè)定

1.2.3.1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

取105 ℃烘干至恒重的葡萄糖20 mg 放入小燒杯中，加蒸餾水溶解，然后轉(zhuǎn)至500 mL 容量瓶中，加水定容，即為40 μg/mL 的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液。分別取40 μg/mL的葡萄糖溶液 0、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8 mL至編號(hào)為0～8 的9 支20 mL 具塞試管中，各加蒸餾水1.8 mL，6%的苯酚溶液1.6 mL 以及濃硫酸7.5 mL，搖勻，靜置 10 min，再搖勻，（23±2）℃放置 20 min 后，每組設(shè)3 個(gè)平行樣品，用紫外分光光度計(jì)在490 nm 波長(zhǎng)測(cè)定樣品吸光度。橫坐標(biāo)為葡萄糖微克數(shù)，縱坐標(biāo)為吸光度，用excel 軟件制作葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.3.2 樣品提取液的制備

精確稱取烘干粉碎的菌質(zhì)樣品放入100 mL 燒杯中，分別加入50 mL 的蒸餾水，85 ℃水浴加熱浸提2 h，連續(xù)提取3 次。合并濾液用蒸餾水定容至100 mL。

1.2.3.3 去淀粉處理

將固體菌質(zhì)用粉碎機(jī)打成細(xì)末狀，然后稱取樣品粉末放入50 mL 燒杯中。向燒杯中分別添加4 mL 3 mol/L 的CaCl2溶液，然后將燒杯放入85 ℃的水浴鍋中加熱，用玻璃棒攪拌10 min 促進(jìn)溶解，使淀粉糊化。取出燒杯，再分別向燒杯中添加15 mL 6 mmol/L 的I2-DMSO 溶液，溶解淀粉，放入85 ℃的恒溫水浴鍋中，加熱30 min。將燒杯里的樣品倒入離心管中，放入離心機(jī)中，轉(zhuǎn)速3 000 r/min，離心5 min。取出離心管，倒掉上清液，取出離心管底部的沉淀放入燒杯中，向燒杯中分別添加4 mL 的CaCl2溶液，置85 ℃的恒溫水浴鍋里，進(jìn)行第2 次去淀粉，再制備樣品提取液，提取，定容，稀釋2 倍，裝于50 mL 容量瓶中。

1.2.3.4 樣品多糖含量的測(cè)定

分別從50 mL 的容量瓶中用移液槍取0.2 mL 提取液至10 支20 mL 具塞試管中，另準(zhǔn)備一支20 mL 具塞試管作為對(duì)照，向11 支具塞試管中加蒸餾水補(bǔ)至1.8 mL。分別加1.6 mL 的6%的苯酚溶液和7.5 mL 的濃硫酸至20 mL 具塞試管中，搖勻，靜置10 min；再次搖勻，（23±2）℃放置 20 min 后，于 490 nm 測(cè)定吸光度。

樣品多糖含量/（mg/g）=[提取液的多糖含量（μg）×稀釋倍數(shù)×100]/[樣品干重（g）×1 000]

1.2.4 蟲(chóng)草素含量測(cè)定

稱取2.00 g 粉碎的樣品于離心管中，加入15 mL的蒸餾水，在50 ℃水浴中超聲60 min，離心取上清液；再向離心管中加入5 mL 的蒸餾水，混合均勻，水浴超聲30 min，離心取上清液；然后再加入5 mL 蒸餾水，混勻水浴超聲30 min，離心取上清液，將3 次離心的上清液合并，用蒸餾水定容25 mL，過(guò)濾膜進(jìn)樣測(cè)定，若渾濁再次離心后過(guò)濾膜。色譜柱為C18（4.6 mm×250 mm，5 μm），柱溫 35 ℃，流動(dòng)相為水與乙腈體積比為 90 ∶10，流速 1.0 mL/min，進(jìn)樣量 20 μL，波長(zhǎng) 260 nm。

1.2.5 蟲(chóng)草酸含量測(cè)定

提取過(guò)程與蟲(chóng)草素測(cè)定相同。色譜柱C18（4.6 mm×250mm，5μm），柱溫35℃，流動(dòng)相為水，流速0.6 mL/min，進(jìn)樣量20 μL，檢測(cè)器為示差檢測(cè)器。

1.2.6 營(yíng)養(yǎng)成分含量測(cè)定

1）還原糖：GB/T 5009.7-2016《食品中還原糖的測(cè)定》直接滴定法。

2）蛋白質(zhì)：GB/T 5009.5-2016《食品中蛋白質(zhì)的測(cè)定》凱氏定氮法。

3）脂肪：GB/T 5009.6-2016《食品中脂肪的測(cè)定》酸水解法。

4）淀粉：GB/T 5009.9-2016《食品中淀粉的測(cè)定》酸水解法。

2 結(jié)果與分析

2.1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

測(cè)定葡萄糖含量，標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1 所示。以葡萄糖質(zhì)量為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)，得到回歸方程y=0.004 9x+0.021 9，R2=0.986 6。

圖1 葡萄糖含量標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of glucose content

2.2 不同菌質(zhì)中蟲(chóng)草多糖含量

培養(yǎng)基質(zhì)是蟲(chóng)草菌絲體生長(zhǎng)的基礎(chǔ)，基質(zhì)的成分和原料配比直接影響菌絲的生長(zhǎng)，進(jìn)而影響次生代謝產(chǎn)物的形成。不同菌質(zhì)的蟲(chóng)草多糖含量見(jiàn)表1。

表1 不同菌質(zhì)的蟲(chóng)草多糖含量Table 1 Cordyceps polysaccharide content of different fungal substance

由表1 可以看出，2 個(gè)菌株在5 種不同配方的培養(yǎng)基質(zhì)上的多糖產(chǎn)率不同，菌株ZNB2.1 在B 和C 培養(yǎng)基質(zhì)中的多糖產(chǎn)率較高，分別為5.119%、5.037%，A培養(yǎng)基質(zhì)中的多糖含量最低，僅為3.578 %。菌株ZNB2.2 在E 培養(yǎng)基質(zhì)中的多糖含量最高，達(dá)到4.853%，在C 培養(yǎng)基質(zhì)中的多糖含量最低，為2.799%。由表1還可知，菌株ZNB2.1 在5 種培養(yǎng)基質(zhì)中多糖含量的平均值大于菌株ZNB2.2，說(shuō)明ZNB2.1 產(chǎn)生多糖的能力大于ZNB2.2。

2.3 去淀粉處理的多糖含量的影響

據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，測(cè)定菌質(zhì)的多糖含量時(shí)，菌質(zhì)中的剩余淀粉，特別是被蟲(chóng)草菌絲降解而產(chǎn)生的小分子淀粉，會(huì)使多糖的測(cè)定值提高，增大試驗(yàn)誤差[8]。為減小菌質(zhì)中淀粉對(duì)蟲(chóng)草多糖測(cè)定的干擾，采用二甲基亞砜去除殘留淀粉后，再測(cè)定蟲(chóng)草多糖含量。樣品經(jīng)去淀粉處理后，蟲(chóng)草多糖含量測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 去淀粉后的菌質(zhì)中蟲(chóng)草多糖含量Table 2 Cordyceps polysaccharide content of fungal substance after starch removal

由表2 可知，去淀粉后10 個(gè)菌質(zhì)樣品的多糖含量都比去淀粉前降低，ZNB2.1 菌株5 種培養(yǎng)基質(zhì)的菌質(zhì)多糖含量由3.578 %～5.119 %降至2.588 %～4.188%，ZNB2.2 菌株5 種培養(yǎng)基質(zhì)的菌質(zhì)多糖含量則由2.799%～4.853%降至2.094%～3.924%。

5 種培養(yǎng)基質(zhì)中，ZNB2.1 在B 培養(yǎng)基質(zhì)中產(chǎn)生的多糖最多，菌質(zhì)多糖含量最高，為4.188%，在A 培養(yǎng)基質(zhì)中形成的多糖最少，菌質(zhì)多糖含量最低，為2.588%。ZNB2.2 在E 培養(yǎng)基質(zhì)中的多糖產(chǎn)率最高，菌質(zhì)多糖含量達(dá)到3.924 %，C 培養(yǎng)基質(zhì)中的多糖含量最低，為2.094%。由表 2 還可知，去淀粉后，ZNB2.1 在 5 種培養(yǎng)基質(zhì)菌質(zhì)的多糖含量平均值依然大于ZNB2.2。無(wú)論是去淀粉前還是去淀粉后，ZNB2.1 在5 種培養(yǎng)基質(zhì)中多糖含量的平均值都大于菌株ZNB2.2。

2.4 不同菌株的菌質(zhì)中主要營(yíng)養(yǎng)成分及活性成分的影響

發(fā)酵前后基質(zhì)的營(yíng)養(yǎng)成分變化和活性成分含量見(jiàn)表3。

表3 發(fā)酵前后基質(zhì)的營(yíng)養(yǎng)成分變化和活性成分含量Table 3 Changes of nutritional components and contents of active components in substrates before and after fermentation

蟲(chóng)草菌絲體在生長(zhǎng)過(guò)程中，從培養(yǎng)基質(zhì)中吸取營(yíng)養(yǎng)，完成生長(zhǎng)代謝過(guò)程，產(chǎn)生活性成分，同時(shí)使基質(zhì)的營(yíng)養(yǎng)成分發(fā)生變化。將2 個(gè)菌株分別接種到基質(zhì)E上，發(fā)酵結(jié)束后測(cè)定菌質(zhì)的主要營(yíng)養(yǎng)成分及活性成分含量，可以發(fā)現(xiàn)基質(zhì)經(jīng)過(guò)2 個(gè)蟲(chóng)草菌株發(fā)酵后，其營(yíng)養(yǎng)成分發(fā)生了變化，均表現(xiàn)為還原糖含量增高，淀粉和蛋白質(zhì)含量降低。ZNB2.2 菌株在發(fā)酵過(guò)程中，產(chǎn)生蟲(chóng)草素和蟲(chóng)草酸，菌質(zhì)中生活性成分蟲(chóng)草素和蟲(chóng)草酸的含量分別達(dá)到207.4 mg/kg 和22.1 g/kg，而ZNB2.1 菌質(zhì)中未檢測(cè)到蟲(chóng)草素和蟲(chóng)草酸。說(shuō)明蟲(chóng)草菌絲體固發(fā)酵可產(chǎn)生蟲(chóng)草素和蟲(chóng)草酸，產(chǎn)生活性成分的能力因菌株而異。

3 結(jié)論與討論

菌株ZNB2.1 和ZNB2.2 分別在基質(zhì)B 中和基質(zhì)E中的多糖產(chǎn)率最高，ZNB2.1 產(chǎn)生蟲(chóng)草多糖的能力大于ZNB2.2。對(duì)菌質(zhì)樣品進(jìn)行去淀粉處理，可減小殘留淀粉對(duì)蟲(chóng)草多糖測(cè)定的干擾?；|(zhì)經(jīng)過(guò)蟲(chóng)草固體發(fā)酵后，還原糖含量增高，淀粉和蛋白質(zhì)含量降低。ZNB2.2 菌株的菌質(zhì)中蟲(chóng)草素和蟲(chóng)草酸的含量分別達(dá)到207.4 mg/kg和22.1 g/kg，而ZNB2.1 菌質(zhì)中未檢測(cè)到蟲(chóng)草素和蟲(chóng)草酸。蟲(chóng)草菌絲體固發(fā)酵產(chǎn)生活性成分的能力因菌株而異，綜合考慮蟲(chóng)草多糖、蟲(chóng)草素和蟲(chóng)草酸的產(chǎn)率，蟲(chóng)草固體發(fā)酵宜選用ZNB2.2 菌株和基質(zhì)E。

莊毅等以槐耳菌為發(fā)酵菌種、中藥材黃芪為發(fā)酵基質(zhì)進(jìn)行雙向固體發(fā)酵，即基質(zhì)為槐耳菌生長(zhǎng)提供所需營(yíng)養(yǎng)，槐耳菌產(chǎn)生新的活性成分，而基質(zhì)的原有成分因真菌分泌的酶的作用發(fā)生變化，槐耳菌絲體、活性成分和黃芪基質(zhì)共同構(gòu)成藥性菌質(zhì)，從而產(chǎn)生新的性味功能，具有比該真菌或藥性基質(zhì)本身或兩者簡(jiǎn)單相加更好的藥效[9]。本研究選用蟲(chóng)草為發(fā)酵菌種、小麥為發(fā)酵基質(zhì)進(jìn)行雙向固體發(fā)酵，雖然基質(zhì)中的淀粉和蛋白質(zhì)等營(yíng)養(yǎng)成分被菌絲分解而減少，但菌質(zhì)中生成了蟲(chóng)草的活性成分——蟲(chóng)草多糖、蟲(chóng)草素和蟲(chóng)草酸，菌質(zhì)可用于開(kāi)發(fā)營(yíng)養(yǎng)保健食品。該雙向固體發(fā)酵研究為小麥的精深加工提供了一條新途徑。薛俊杰等報(bào)道，蟲(chóng)草素的分泌與菌株特性有密切關(guān)系，并不與菌株的長(zhǎng)勢(shì)直接相關(guān)[10]。孫軍德等通過(guò)5 個(gè)蟲(chóng)草菌株的菌絲生長(zhǎng)速率和培養(yǎng)基中活性物質(zhì)含量的對(duì)比研究，發(fā)現(xiàn)不同蟲(chóng)草菌株的菌絲生長(zhǎng)速率、蟲(chóng)草多糖和蟲(chóng)草素地含量不同[11]。劉艷芳等對(duì)19 個(gè)蟲(chóng)草屬菌株的菌絲體中活性成分進(jìn)行了分析，結(jié)果表明不同菌株菌絲體蟲(chóng)草素含量差異顯著[12]。本試驗(yàn)中不同蟲(chóng)草菌株產(chǎn)生活性成分的能力不同，與文獻(xiàn)[10-12]的研究結(jié)果一致。另?yè)?jù)報(bào)道，蟲(chóng)草菌絲的培養(yǎng)條件直接影響菌質(zhì)中活性成分的含量，為提高蟲(chóng)草多糖、蟲(chóng)草素和蟲(chóng)草酸等活性物質(zhì)的產(chǎn)率，需要對(duì)蟲(chóng)草雙向固體發(fā)酵的培養(yǎng)條件進(jìn)行更深入的研究。