丁苯酞促進心肌梗死大鼠血管再生的作用研究

田小超，何偉亮，賈 妍，武宇洲，金 鑫，劉素云*

(1.河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院心內(nèi)科，河北 石家莊 050000；2.河北省人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，河北 石家莊 050051)

心肌梗死(myocardial infarction，MI)是一類嚴重危害人類身體健康的疾病，其主要發(fā)病機制是心肌缺血。血管再生可以改善心肌梗死患者的心肌缺血，故如何促進缺血心肌血管再生已經(jīng)成為目前研究的熱點。血管再生是一個復(fù)雜的過程，血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF) 和堿性成纖維細胞生長因子(basic fibroblast growth factor，β-FGF)等促血管生長因子參與其中，發(fā)揮著重要的作用。丁苯酞(dl-3-n-butylphthalide,NBP)主要活性成分為正丁基苯酞，對急性腦梗死具有顯著治療作用[1-2]。心肌梗死和腦梗死的發(fā)病機制類似，本課題組前期研究發(fā)現(xiàn),NBP通過促進VEGF改善腦心缺血[3]，但NBP對心肌梗死血管再生的作用及機制仍需深入研究。最新研究表明Notch通路與心肌梗死等疾病關(guān)系密切[4]，激活Notch l通路能減輕創(chuàng)傷后心肌缺血再灌注損傷[5-6]。因此，本研究旨在探討NBP促進心肌梗死大鼠血管再生的作用，報告如下。

1 材料與方法

1.1藥品、實驗動物與儀器 NBP由石藥集團恩必普藥業(yè)公司提供，批準(zhǔn)文號：國藥準(zhǔn)字H20100041。體重為200～280 g的 SD大鼠由河北省實驗動物中心提供(合格證書：SCXK-冀-2008-1-003)，對動物的處置符合動物倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)。

1.2大鼠心肌梗死模型的制備及分組 將大鼠以10%水合氯醛腹腔注射麻醉，按線栓法制備大鼠心肌梗死模型：接多導(dǎo)電生理記錄儀觀察大鼠心電圖，氣管插管，接小動物呼吸機輔助呼吸。于胸骨左緣第3、4肋間開胸，暴露心臟，用5-0絲線結(jié)扎于冠狀動脈前降支(left anterior descending，LAD)，造成心肌梗死。結(jié)扎后心電圖Ⅰ和aVL導(dǎo)聯(lián)ST 段抬高且心肌組織變?yōu)樯n白色為造模成功。假手術(shù)過程與上述基本相同，但線栓并未置入 LAD。將大鼠分為假手術(shù)(Sham)組、心肌梗死(MI)組、NBP 低劑量(NBP-L，20 mg/kg組)和NBP高劑量(NBP-H，40 mg/kg)組，每組6只大鼠。模型成功后分別經(jīng)尾靜脈注射給予藥物治療，每天給藥1次，連續(xù)給藥2周。Sham組和MI組給予相同劑量的生理鹽水治療。

1.3心肌梗死面積的檢測 實驗結(jié)束時處死大鼠，迅速取出大鼠心臟組織，沿房室環(huán)方向?qū)⒆笮氖矣尚募庵列牡浊谐? mm厚的組織塊，置于20 g/L的氯化三苯基四氮唑溶液中，37 ℃孵育10 min，加入4%多聚甲醛固定24 h，用數(shù)碼相機拍照，用Image J軟件進行圖像分析計算梗死面積。心肌梗死面積=每片切片壞死心肌之和/整個左心室面積×100%。

1.4心臟功能的檢測 10%水合氯醛麻醉大鼠后，將其置于自制木板上，超聲診斷儀檢測大鼠心臟超聲功能，并讀取左心室收縮末期壓(left ventricular end-systolic pressure，LVESP)、左心室舒張末期壓(left ventricular end diastolic pressure,LVEDP)、心室收縮時室內(nèi)壓最大上升速率(+dP/dt max)及左心室舒張時室內(nèi)壓最大下降速率(-dP/dt max)。

1.5心肌梗死邊緣區(qū)新生血管的檢測 取正常心肌與梗死心肌交界區(qū)的心肌即缺血心肌，制作石蠟組織塊，切片(5 μm厚)，行特異性免疫組織化學(xué)染色，SP法染色，二氨基聯(lián)苯胺顯色，一抗為兔抗鼠Ⅷ因子相關(guān)抗原抗體(購自北京中山金橋生物技術(shù)有限公司)，顯微鏡下計數(shù)缺血區(qū)微血管密度，每個標(biāo)本隨機觀察5處，取其平均值作為毛細血管密度。

1.6VEGF和β-FGF及Notch 1的基因表達檢測 Trizol法提取大鼠缺血心肌組織總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，取逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物2 μg進行PCR擴增反應(yīng)。采用SYBR Green染料法于實時熒光定量PCR儀進行RT-PCR 反應(yīng)，建立反應(yīng)體系的終體積為25 μL。反應(yīng)條件為95 ℃預(yù)變性5 min、95 ℃變性5 s、60 ℃退火30 s、72 ℃延伸40 s，進行35個循環(huán)，最后72 ℃延伸5 min。由 PCR 反應(yīng)曲線得到每個樣品的Ct值，以GAPDH作為內(nèi)參，用2-△△ct法進行計算目的基因的表達量。引物合成由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司完成，引物序列為：VEGF，F(xiàn):5′-GCACTGGACCCTGGCTTTAC-3′,R:5′-CCCGCACACCGCATTAGG-3′;FGF，F(xiàn):5′-TTCACAGCCTGTGCTCTAGGG-3′,R:5′-GAT-CGGGTCAGGTTTTGGAAA-3′;Notch 1，F(xiàn):5′-GAGGCTTGAGATGCTCCCAG-3′,R:5′-ACGG-CAGGCACAGCGATAG-3′;GAPDH，F(xiàn):5′-ACC-ACAGTCCATGCCATCAC-3′,R:5′-TCCACCAC-CCTGTTGCTGTA-3′。

1.7統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件分析數(shù)據(jù)。計量資料比較分別采用F檢驗和SNK-q檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1NBP對各組大鼠心肌梗死面積的作用 Sham組大鼠均未見心肌梗死灶，MI組、NBP-L組和NBP-H組大鼠心肌梗死面積百分率大于Sham組，NBP-L組和NBP-H組大鼠心肌梗死面積百分率小于MI組,NBP-H組大鼠心肌梗死面積百分率小于NBP-L組(P<0.05)，見表1。

組別心肌梗死面積Sham組0.00±0.00MI組48.41±4.96?NBP-L組37.19±4.81?#NBP-H組28.95±3.75?#△F值22.276P值0.000

*P值<0.05與Sham組比較 #P值<0.05 與MI組比較 △P值<0.05 與NBP-L組比較(SNK-q檢驗)

2.2NBP對各組大鼠心臟功能的影響 MI組、NBP-L組和NBP-H組大鼠LVESP、+dp/dt max、-dp/dt max低于Sham組，LVED高于Sham組，NBP-L組和NBP-H組大鼠LVESP、+dp/dt max、-dp/dt max高于MI組，LVED低于MI組，NBP-H組大鼠LVESP、+dp/dt max、-dp/dt max高于NBP-L組，LVED低于NBP-L組(P<0.05)，見表2。

2.3NBP對各組大鼠梗死邊緣區(qū)新生毛細血管的作用 NBP-L組和NBP-H組心肌梗死邊緣區(qū)毛細血管密度高于MI組，NBP-H組心肌梗死邊緣區(qū)毛細血管密度高于NBP-L組(P<0.05)，見表3。

2.4NBP對各組大鼠血管再生相關(guān)因子(VEGF和β-FGF)的作用 MI組大鼠心肌VEGF、FGF mRNA水平低于Sham組，NBP-L組和NBP-H組VEGF和β-FGF mRNA水平高于Sham組和MI組,NBP-H組VEGF和-FGF mRNA水平高于NBP-L組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表4。

2.5NBP對各組大鼠Notch信號通路中Notch 1基因的影響 MI組大鼠心肌組織中Notch 1基因表達明顯低于Sham組，NBP-L組和NBP-H組大鼠心肌中Notch 1基因表達高于Sham組和MI組，NBP-H組大鼠心肌中Notch 1基因表達高于NBP-L組(P<0.05)，見表5。

組別LVESP(mmHg)LVEDP(mmHg)+dp/dt max(mmHg/s)-dp/dt max(mmHg/s)Sham組169.68±16.899.07±0.976 213.17±588.993 527.89±415.14MI組113.54±13.95?16.03±0.81?3 496.52±321.39?2 230.77±220.05?NBP-L組130.19±10.91?#14.18±1.07?#4 260.41±580.27?#2 502.67±215.84?#NBP-H組148.42±12.14?#△11.86±1.00?#△5 116.97±531.40?#△3 077.91±287.43?#△F值18.72457.61830.55923.194P值0.0000.0000.0000.000

*P值<0.05與Sham組比較 #P值<0.05與MI組比較 △P值<0.05 與NBP-L組比較(SNK-q檢驗)；1 mmHg=0.133 kPa

組別新生毛細血管密度值MI組17.01±1.57NBP-L組21.30±2.15?NBP-H組32.98±3.25?#F值107.389 P值0.000

*P值<0.05與MI組比較 #P值<0.05與NBP-L組比較(SNK-q檢驗)

組別VEGF mRNAβ-FGF mRNASham組1.01±0.191.01±0.17MI組0.64±0.08?0.71±0.11?NBP-L組1.40±0.22?#1.27±0.20?#NBP-H組2.12±0.39?#△2.01±0.29?#△F值40.72543.956P值0.0000.000

*P值<0.05與Sham組比較 #P值<0.05與MI組比較 △P值<0.05 與NBP-L組比較(SNK-q檢驗)

組別Notch 1 mRNASham組1.01±0.19MI組0.70±0.11?NBP-L組1.38±0.17?#NBP-H組1.91±0.24?#△F值48.772P值0.000

*P值<0.05與Sham組比較 #P值<0.05與MI組比較 △P值<0.05與NBP-L組比較(SNK-q檢驗)

3 討 論

缺血性心臟病已經(jīng)成為嚴重威脅人類健康的主要疾病之一，如何改善心肌缺血區(qū)血流量成為治療心肌梗死的關(guān)鍵和研究的熱點。近年來研究發(fā)現(xiàn)，血管再生可以增加缺血心肌的血流灌注，挽救頓抑心肌，改善心臟功能[7-8]。因此，探索新的以血管再生為治療靶點的心肌梗死藥物具有極其重要的價值。NBP是一種新型的抗腦缺血的藥物，國內(nèi)指南中已批準(zhǔn)用于治療腦梗死[9]。研究發(fā)現(xiàn)，NBP可改善大鼠腦缺血再灌注后微血管形態(tài)和密度，促進血管再生對腦血管缺血再灌注損傷具有一定的保護作用[10-12]。另外， NBP能改善大鼠心肌梗死模型心臟血流動力學(xué)功能和減少心臟梗死面積，對大鼠心肌具有保護作用[13]。然而，關(guān)于NBP是否通過調(diào)控血管再生對心肌梗死起保護作用的研究較少。

本研究結(jié)果顯示，MI組、NBP-L組和NBP-H組大鼠心肌梗死面積百分率大于Sham組，NBP-L組和NBP-H組大鼠心肌梗死面積百分率小于MI組,NBP-H組大鼠心肌梗死面積百分率小于NBP-L組(P<0.05)。NBP能夠降低大鼠心肌梗死面積，改善大鼠心肌梗死后心臟功能，表明NBP對心肌梗死大鼠具有保護作用。微血管密度是反映血管再生的可靠的指標(biāo)。本研究采用免疫組織化學(xué)方法檢測梗死灶邊緣區(qū)的微血管密度，結(jié)果表明NBP-L組和NBP-H組大鼠心肌組織中微血管密度要高于MI組。VEGF和β-FGF是目前動物和臨床實驗研究得較為深入的促進血管再生的活性因子[14-15]。本研究采用實時熒光定量PCR檢測了心肌組織中VEGF mRNA和β-FGF mRNA的表達，結(jié)果發(fā)現(xiàn)MI組大鼠心肌VEGF、FGF mRNA水平低于Sham組，NBP-L組和NBP-H組VEGF和β-FGF mRNA水平高于Sham組和MI組,NBP-H組VEGF和β-FGF mRNA水平高于NBP-L組(P<0.05)。表明NBP能夠促進血管再生相關(guān)因子VEGF和β-FGF的表達。所以，NBP可以促進心肌梗死大鼠VEGF和β-FGF因子在缺血心肌中的表達，進而促進缺血心肌血管再生，增加缺血心肌的血液供應(yīng)，對心肌梗死的大鼠心肌組織產(chǎn)生保護功能。

Notch信號通路主要對細胞的增殖、分化和凋亡進行調(diào)節(jié)，其中的一類受體Notch 1在心肌的發(fā)育、存活和分化中發(fā)揮著關(guān)鍵作用[16]。Notch 1通路通過促進心肌再生、誘導(dǎo)血管新生等來保護心肌[17]。敲除Notch 1可引起冠狀動脈畸形和心肌異常[18]。然而，尚未見到有關(guān)Notch 1通路是否在NBP介導(dǎo)的心肌梗死大鼠血管再生中發(fā)揮作用的報道。因此，本研究通過實時熒光定量PCR法檢測了缺血心肌組織的Notch 1基因的表達，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，MI組大鼠心肌組織中Notch 1基因表達明顯低于Sham組，NBP-L組和NBP-H組大鼠心肌中Notch 1基因表達高于Sham組和MI組，NBP-H組大鼠心肌中Notch 1基因表達高于NBP-L組(P<0.05)。表明NBP能夠激發(fā)Notch 1通路，促進血管再生，對心肌梗死后大鼠的心肌產(chǎn)生保護作用。

綜上所述，NBP可通過激活Notch 1通路促進心肌梗死后大鼠血管再生能力，對心肌梗死大鼠產(chǎn)生保護作用，為心肌梗死的治療提供了新的理論基礎(chǔ)，有利于研發(fā)心肌梗死的新干預(yù)靶點和治療藥物。