熱休克蛋白在脊髓損傷中的研究進(jìn)展

賀學(xué)崗,張廣智,馬占軍,高一誠(chéng),郭旭東,康學(xué)文*

(1．蘭州大學(xué)第二醫(yī)院骨科,中國(guó)甘肅蘭州730030;2．蘭州大學(xué),中國(guó)甘肅蘭州730030)

脊髓損傷(spinal cord injury,SCI)通常是由外力作用于脊柱導(dǎo)致椎體骨折或移位造成的[1],可分為原發(fā)性損傷和繼發(fā)性損傷。原發(fā)性損傷是指外力導(dǎo)致的碎骨片、椎間盤或韌帶等持續(xù)壓迫或撕裂脊髓組織[2];繼發(fā)性損傷包括原發(fā)性損傷所引起的炎癥反應(yīng)、組織水腫、電解質(zhì)紊亂、自由基形成、脂質(zhì)過氧化、神經(jīng)元凋亡和興奮性毒性神經(jīng)遞質(zhì)的積累等[3]。目前關(guān)于SCI的治療策略除手術(shù)解除壓迫外,主要是限制繼發(fā)性損傷的發(fā)生發(fā)展。

熱休克蛋白(heat shock proteins,HSPs)是一類在生物體內(nèi)廣泛存在的具有多種功能且高度保守的蛋白質(zhì)[4]。當(dāng)機(jī)體處于高溫、炎癥、缺血或氧化應(yīng)激等狀態(tài)時(shí),HSPs作為保護(hù)細(xì)胞和組織免受進(jìn)一步傷害的重要分子而大量合成[5]。在細(xì)胞內(nèi),HSPs主要分布于細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核、線粒體及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中,可以促進(jìn)蛋白質(zhì)二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)的形成,參與修復(fù)或清除受損變性的蛋白質(zhì),并介導(dǎo)信號(hào)傳導(dǎo)、細(xì)胞凋亡、炎癥反應(yīng)及氧化應(yīng)激等病理生理過程[6]。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn),HSPs在繼發(fā)性脊髓損傷階段起著重要的保護(hù)作用,故本文對(duì)HSPs在脊髓損傷領(lǐng)域的研究進(jìn)展予以綜述,為后續(xù)相關(guān)研究提供參考。

1 熱休克蛋白概述

1962年,Ritossa首次在果蠅唾液腺中發(fā)現(xiàn)HSPs,然而直到1986年,人們才逐漸了解其功能,并提出分子伴侶這一概念,它是指一類具有相同功能但序列不同的多肽,可以幫助其他蛋白質(zhì)正確折疊和組裝[7～9]。HSPs是生物體在應(yīng)激后高表達(dá)的蛋白質(zhì)之一,生理?xiàng)l件下其在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)相對(duì)較低,占總蛋白質(zhì)含量的5%～10%,然而在應(yīng)激情況下其表達(dá)可增至15%[10]。HSPs的相對(duì)分子質(zhì)量在15～110 kD,根據(jù)相對(duì)分子質(zhì)量的大小可將其分為以下幾類:大分子HSP家族(100～110 kD)、HSP90 家族(83～90 kD)、HSP70 家族(66～78 kD)、HSP60家族、HSP40家族、HSP20家族(15～30 kD)及泛素等[11]。其中,研究最多的是HSP70,它是對(duì)應(yīng)激最敏感的HSPs,具有兩個(gè)結(jié)構(gòu)域,在穩(wěn)定蛋白質(zhì)、信號(hào)傳導(dǎo)、細(xì)胞凋亡、炎癥及氧化應(yīng)激等生理病理過程中起著重要的調(diào)控作用[12]。

2 熱休克蛋白與脊髓損傷

繼發(fā)性脊髓損傷在原發(fā)性損傷發(fā)生后的幾分鐘內(nèi)開始,可持續(xù)數(shù)周或數(shù)月,引起病變部位及周圍脊髓組織的進(jìn)行性損傷[13]。Allen等[14]在1911年首次提出脊髓的繼發(fā)性損傷這一概念。他在研究狗的脊髓損傷時(shí)發(fā)現(xiàn),手術(shù)清除創(chuàng)傷后的血腫可以改善神經(jīng)功能,故推測(cè)在壞死的出血性損傷中存在一些生化因素會(huì)對(duì)脊髓造成進(jìn)一步的損傷,即繼發(fā)性脊髓損傷。當(dāng)然,脊髓損傷后機(jī)體也可產(chǎn)生一些保護(hù)性分子,促進(jìn)其神經(jīng)功能的恢復(fù)。相關(guān)研究表明,脊髓損傷后HSPs表達(dá)升高,并在繼發(fā)性脊髓損傷階段發(fā)揮著保護(hù)受損神經(jīng)元的關(guān)鍵作用[12]。

2.1 脊髓損傷后熱休克蛋白的誘發(fā)因素

HSPs在生理情況下表達(dá)較低,當(dāng)機(jī)體處于應(yīng)激狀態(tài)時(shí)作為保護(hù)性分子大量表達(dá)[15]。其表達(dá)主要由熱休克轉(zhuǎn)錄因子(heat shock transcription factors,HSFs)介導(dǎo)。HSFs通過其氨基末端結(jié)構(gòu)域與HSPs編碼基因5′端啟動(dòng)子中的熱休克元件(heat shock element,HSE)序列特異性結(jié)合來(lái)調(diào)控HSPs的表達(dá)[16],其中HSF1是調(diào)節(jié)HSPs表達(dá)的必要因子。在生理?xiàng)l件下HSF1與HSPs結(jié)合,當(dāng)細(xì)胞處于應(yīng)激狀態(tài)時(shí)兩者相互脫離,HSPs發(fā)揮作用,而游離的HSF1被蛋白激酶C磷酸化并轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核內(nèi)形成活化的三聚體,活化的三聚體與HSE結(jié)合從而生成更多的HSPs[17]。脊髓損傷后機(jī)體產(chǎn)生的神經(jīng)酰胺、活性氧(reactive oxygen species,ROS)及錯(cuò)誤折疊的蛋白質(zhì)等可以通過活化HSFs誘導(dǎo)HSPs的表達(dá)。

2.1.1 神經(jīng)酰胺

神經(jīng)酰胺是一種結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單的鞘脂,由長(zhǎng)度不等的脂肪酸與鞘氨醇的氨基縮合而成,是細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)成分之一[18]。神經(jīng)酰胺可以作為信號(hào)分子,將細(xì)胞外壓力轉(zhuǎn)化為細(xì)胞內(nèi)信號(hào)[19]。靜息細(xì)胞細(xì)胞膜中的神經(jīng)酰胺水平較低,當(dāng)受到應(yīng)激(如SCI)時(shí)可顯著增多[20]。在絲氨酸殘基、乙酰轉(zhuǎn)移酶及調(diào)節(jié)蛋白作用下,神經(jīng)酰胺可以將HSFs磷酸化,啟動(dòng)HSPs的轉(zhuǎn)錄[21]。Han等[22]研究顯示,Malme-3M黑色素瘤細(xì)胞經(jīng)神經(jīng)酰胺作用后,其HSP70的表達(dá)明顯升高,這提示神經(jīng)酰胺可以促進(jìn)HSPs的產(chǎn)生。脊髓損傷后,神經(jīng)元及膠質(zhì)細(xì)胞等細(xì)胞的細(xì)胞膜骨架遭到破壞,神經(jīng)酰胺大量表達(dá),進(jìn)而激活HSFs,促進(jìn)HSPs的產(chǎn)生。

2.1.2 活性氧

ROS主要由細(xì)胞內(nèi)線粒體產(chǎn)生,包括超氧陰離子(O2·-)、過氧化氫(H2O2)、羥基自由基(·OH)和一氧化氮(NO)等,是細(xì)胞氧化代謝的副產(chǎn)物,正常情況下與體內(nèi)抗氧化劑處于平衡狀態(tài)[23]。在氧化磷酸化過程中,線粒體消耗了細(xì)胞90%左右的氧氣(O2);當(dāng)線粒體功能發(fā)生障礙時(shí),電子能與更多的O2結(jié)合產(chǎn)生ROS[24]。脊髓損傷后,線粒體結(jié)構(gòu)被破壞,功能發(fā)生障礙,ROS生成增加。此外,小膠質(zhì)細(xì)胞、巨噬細(xì)胞及中性粒細(xì)胞也參與了ROS生成[23]。相關(guān)研究表明,H2O2可以直接激活HSF1,從而促進(jìn)HSP70和HSP90的mRNA表達(dá)[25]。Ahn等[26]研究表明,ROS可以體外激活HSFs,HSF1通過H2O2的氧化而被多聚化,并與DNA結(jié)合,進(jìn)一步促進(jìn)HSPs表達(dá)。

2.1.3 蛋白質(zhì)的錯(cuò)誤折疊

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是蛋白質(zhì)合成與折疊的場(chǎng)所,SCI可引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能紊亂,導(dǎo)致蛋白質(zhì)折疊錯(cuò)誤。此外,脊髓損傷后增加的ROS也可以誘導(dǎo)蛋白質(zhì)錯(cuò)誤折疊。蛋白質(zhì)的錯(cuò)誤折疊和聚集可以導(dǎo)致神經(jīng)毒性累積,并引發(fā)炎癥反應(yīng)和細(xì)胞凋亡。正常情況下,細(xì)胞可以通過蛋白酶體及自噬系統(tǒng)將錯(cuò)誤折疊的蛋白質(zhì)清除[27],當(dāng)機(jī)體不能及時(shí)清除時(shí)就會(huì)誘導(dǎo)c-Jun氨基端激酶2(c-Jun N-terminal kinase 2,JNK2)活化,活化的JNK2可以使HSF1磷酸化,并激活HSF1和HSF2的轉(zhuǎn)錄活性,從而促進(jìn)HSPs 的表達(dá)[28～29]。

2.2 熱休克蛋白在脊髓損傷后的保護(hù)作用

2.2.1 分子伴侶作用

HSPs作為分子伴侶,可以促進(jìn)蛋白質(zhì)的正確折疊,同時(shí)也可以清除錯(cuò)誤折疊的蛋白質(zhì)。HSPs可以與核糖體上新生肽鏈的疏水氨基酸短序列結(jié)合,防止新生肽鏈在完全合成之前錯(cuò)誤折疊,并能阻止相鄰肽鏈上疏水氨基酸間因相互作用而發(fā)生的聚集,促進(jìn)蛋白質(zhì)的正確折疊。泛素可通過與錯(cuò)誤折疊的蛋白質(zhì)相結(jié)合而使其泛素化,進(jìn)而使其被蛋白酶體識(shí)別并降解。SCI可導(dǎo)致蛋白質(zhì)聚集體的錯(cuò)誤折疊和積累。Cuesta等[30]證明HSP27可以作為細(xì)胞蛋白質(zhì)合成的抑制劑;他們發(fā)現(xiàn),HSP27與一種被稱為eIF4G的轉(zhuǎn)錄起始因子相互作用,并阻止eIF4G因子啟動(dòng)翻譯,而eIF4G是大多數(shù)細(xì)胞RNA轉(zhuǎn)譯所必需的。這種相互作用可能是一種保護(hù)機(jī)制,從而進(jìn)一步限制蛋白質(zhì)在應(yīng)激條件下錯(cuò)誤折疊的積累。在細(xì)胞內(nèi),細(xì)胞骨架的主要功能是維持細(xì)胞的正常結(jié)構(gòu)和生長(zhǎng),HSP27可與細(xì)胞骨架肌動(dòng)蛋白微絲結(jié)合,從而穩(wěn)定細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu),防止其解體。這可能是對(duì)細(xì)胞環(huán)境變化的適應(yīng)性反應(yīng)[31]。

2.2.2 促進(jìn)血管生成

脊髓損傷后,大的血管如脊髓前動(dòng)脈通常保持完整,而較小的髓內(nèi)血管和毛細(xì)血管則容易受損,導(dǎo)致白細(xì)胞和紅細(xì)胞外滲,進(jìn)而導(dǎo)致炎癥、脊髓能量供應(yīng)不足、缺氧和隨后的細(xì)胞線粒體功能障礙[32]。研究表明,HSPs參與了脊髓損傷后新生血管的形成。一項(xiàng)基于內(nèi)皮細(xì)胞的體外研究發(fā)現(xiàn),HSP27與血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)有著復(fù)雜的相互作用。細(xì)胞應(yīng)激后,VEGF通過激活應(yīng)激活化蛋白激酶2(stress-activated protein kinase 2,SAPK2)/p38途徑促進(jìn)HSP27的磷酸化,從而使細(xì)胞骨架重組和內(nèi)皮細(xì)胞遷移,促進(jìn)血管新生[33]。此外,HSP27的磷酸化減少了細(xì)胞外HSP27的釋放,而細(xì)胞外的HSP27可以與VEGF結(jié)合,阻止VEGF的表達(dá)[34]。HSP27也可以通過與內(nèi)皮細(xì)胞上Toll樣受體3的結(jié)合增強(qiáng)細(xì)胞內(nèi)VEGF的表達(dá)[35]。因此,HSPs通過與VEGF相互作用,促進(jìn)脊髓損傷后新生血管的形成。

2.2.3 抑制炎癥反應(yīng)

脊髓損傷后小膠質(zhì)細(xì)胞、T細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞激活并向損傷部位趨化聚集,同時(shí)它們合成并釋放的炎癥因子(TNF-α、IL-1β、IL-6、TGF-β、IL-8等)迅速增多,加重神經(jīng)元的凋亡和血脊髓屏障的破壞,導(dǎo)致脊髓組織進(jìn)一步損傷[36]。Kim等[37]在大鼠自身免疫性腦脊髓炎模型中發(fā)現(xiàn),體外應(yīng)用的HSP27具有抗炎作用。在巨噬細(xì)胞中,HSP27可以通過上調(diào)核轉(zhuǎn)錄抑制因子來(lái)抑制核因子κB(nuclear factor kappa B,NF-κB)的表達(dá),進(jìn)而阻止巨噬細(xì)胞的活化[38]。在單核細(xì)胞中,沉默HSP27可以使IL-1的表達(dá)增多,這表明HSP27可以通過抑制單核細(xì)胞表達(dá)IL-1來(lái)抑制炎癥反應(yīng)[39]。Chamney等[40]研究表明,小鼠脊髓損傷后,HSP70的上調(diào)可以顯著降低肌肉中IL-6和TNF-α的表達(dá)。Huan等[41]發(fā)現(xiàn),寶珍丸可以誘導(dǎo)HSP27的表達(dá),從而降低SCI大鼠Treg細(xì)胞比例,進(jìn)一步減少TGF-β的表達(dá)。因此,脊髓損傷后活化的HSPs可通過抑制炎癥因子的表達(dá)減緩脊髓組織的進(jìn)一步受損。

2.2.4 抑制細(xì)胞凋亡

脊髓損傷后可以通過激活多個(gè)信號(hào)通路引起細(xì)胞凋亡。胱天蛋白酶(caspase)在細(xì)胞凋亡過程中起著關(guān)鍵作用,其在細(xì)胞內(nèi)以非活性前體酶原的形式存在。凋亡啟動(dòng)后,線粒體膜間隙的細(xì)胞色素c穿過線粒體膜到達(dá)胞質(zhì),與dATP和凋亡蛋白酶激活因子1(apoptosis protease-activating factor-1,Apaf1)形成凋亡體,凋亡體募集pro-caspase-9并將其激活,活化的caspase-9通過自身的caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)激活caspase-3和caspase-7,進(jìn)而使蛋白質(zhì)水解,導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。此外,細(xì)胞外的損害因子(如TNF-α等)可與細(xì)胞膜表面受體結(jié)合并募集胞內(nèi)的Mort1(一種死亡域蛋白)形成復(fù)合體,激活caspase-8,進(jìn)而激活caspase-3,引起細(xì)胞凋亡[3]。研究表明,海藻糖可以通過上調(diào)HSP27和HSP70抑制細(xì)胞色素c的釋放,并降低caspase-3的表達(dá),從而起到保護(hù)脊髓的作用,使其免受損傷[42]。在線粒體外,HSP70與Apaf1結(jié)合,從而阻止pro-caspase-9募集到凋亡小體[15]。此外,HSP70還可以通過結(jié)合腫瘤壞死因子相關(guān)的凋亡誘導(dǎo)配體1和2(TNF-related apoptosis inducing ligand-receptor 1/2,TRAIL-R1/2)來(lái)阻止細(xì)胞凋亡[43]。Bcl-2家族蛋白中的Bcl-2是細(xì)胞凋亡的負(fù)調(diào)控因子,它可以阻斷細(xì)胞色素c和凋亡誘導(dǎo)因子在線粒體的釋放。在神經(jīng)元缺血的模型中,HSP70可通過增加Bcl-2的水平抑制凋亡[44]。Chang等[45]通過運(yùn)動(dòng)預(yù)處理SCI大鼠發(fā)現(xiàn),受損的脊髓灰質(zhì)中神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細(xì)胞可以通過過表達(dá)HSP72來(lái)抑制凋亡,促進(jìn)SCI大鼠神經(jīng)功能恢復(fù)。

2.2.5 抗氧化應(yīng)激作用

如前所述,脊髓損傷后神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞線粒體功能的喪失,以及小膠質(zhì)細(xì)胞和中性粒細(xì)胞的激活,使得ROS產(chǎn)生增加。而ROS的積累能夠分解蛋白質(zhì)、過氧化脂質(zhì)和損傷DNA,進(jìn)而誘發(fā)神經(jīng)元凋亡[46]。相關(guān)研究表明,HSP70能夠促進(jìn)抗氧化劑過氧化氫酶、超氧化物歧化酶和谷胱甘肽等的表達(dá)。在膠質(zhì)細(xì)胞中,HSP70的過表達(dá)可以使細(xì)胞免受葡萄糖剝奪和H2O2的損傷,這與谷胱甘肽的產(chǎn)生增加有關(guān)[47]。Wang等[48]研究發(fā)現(xiàn),采用低頻脈沖電磁場(chǎng)治療SCI大鼠時(shí)可以上調(diào)HSP70的表達(dá),并能增加過氧化氫酶和超氧化物歧化酶的產(chǎn)生,降低誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase,iNOS)和ROS的水平。此外,HSP70可以阻止ROS誘發(fā)的DNA碎片化,保護(hù)細(xì)胞使其免受H2O2誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激[5]。因此,脊髓損傷后HSPs表達(dá)增加可以通過促進(jìn)抗氧化劑蛋白質(zhì)的產(chǎn)生和阻止DNA碎片化等來(lái)提高脊髓神經(jīng)元的抗氧化應(yīng)激能力。

2.3 熱休克蛋白治療脊髓損傷的研究現(xiàn)狀

近年來(lái),國(guó)內(nèi)外學(xué)者在通過誘導(dǎo)HSPs產(chǎn)生來(lái)治療SCI方面進(jìn)行了大量研究。如上所述,Huan等[41]發(fā)現(xiàn),寶珍丸可以通過誘導(dǎo)HSP27的表達(dá)來(lái)抑制脊髓損傷后的炎癥反應(yīng)。Nasouti等[42]研究表明,海藻糖可以通過上調(diào)HSP27和HSP70的表達(dá)抑制神經(jīng)元凋亡。Chang等[45]通過運(yùn)動(dòng)預(yù)處理SCI大鼠發(fā)現(xiàn),過表達(dá)HSP72能夠抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元凋亡。此外,Tanabe等[49]發(fā)現(xiàn),苦參堿可以直接激活細(xì)胞外HSP90,進(jìn)而促進(jìn)急性SCI小鼠軸突的生長(zhǎng)和功能恢復(fù)。Huang等[50]研究表明,高壓氧治療可以促進(jìn)HSP32的表達(dá),進(jìn)而增加大鼠原代脊髓神經(jīng)元抵抗氧化或糖氧剝奪損傷的能力?？偟膩?lái)講,雖然HSPs在SCI治療方面的研究已經(jīng)取得了一些進(jìn)展,但由于HSPs保護(hù)機(jī)制的多樣性和SCI疾病的復(fù)雜性,當(dāng)前誘導(dǎo)HSPs產(chǎn)生的機(jī)制并不是十分清楚。因此,探索HSPs產(chǎn)生及作用的深層機(jī)制,并研發(fā)HSPs誘導(dǎo)效率高、毒副作用小、經(jīng)濟(jì)成本低的藥物將是今后研究的重要方向。

3 展望

綜上所述,HSPs與脊髓損傷后神經(jīng)功能的恢復(fù)密切相關(guān)。脊髓損傷后,HSPs作為保護(hù)性分子表達(dá)增高,發(fā)揮分子伴侶、促進(jìn)血管生成、抑制炎癥反應(yīng)、抑制細(xì)胞凋亡、抗氧化應(yīng)激等作用,從而減緩脊髓損傷的進(jìn)一步加重,這為基于HSPs治療SCI提供了一條新的思路?，F(xiàn)階段,如何誘導(dǎo)脊髓損傷后HSPs的表達(dá),進(jìn)而促進(jìn)神經(jīng)功能的恢復(fù)是SCI領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)之一。雖然有關(guān)藥物、運(yùn)動(dòng)、高壓氧等誘導(dǎo)HSPs表達(dá)的研究已有一定的進(jìn)展,但仍未有臨床應(yīng)用的報(bào)道。因此,探索促進(jìn)HSPs表達(dá)的機(jī)制及其對(duì)SCI的保護(hù)機(jī)理仍是今后研究的重點(diǎn)。