PERK介導(dǎo)細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)的分子機(jī)制研究進(jìn)展

張沖沖 ，宋倫

1.軍事科學(xué)院 軍事醫(yī)學(xué)研究院 軍事認(rèn)知與腦科學(xué)研究所，北京 100850；2.河南大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，河南 開封 475004

機(jī)體代謝網(wǎng)絡(luò)需要對攝入的各種形式的能量（脂肪、糖和蛋白質(zhì)）做出適應(yīng)性反應(yīng)，以保證生命活動的正常進(jìn)行，否則往往會引發(fā)炎癥效應(yīng)和細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)[1]。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（endoplasmic reticulum，ER）在維持細(xì)胞和生物體穩(wěn)態(tài)、協(xié)調(diào)機(jī)體代謝網(wǎng)絡(luò)適應(yīng)性中具有關(guān)鍵作用[2]。

1 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和PERK

作為真核生物細(xì)胞內(nèi)承載重要生命活動的細(xì)胞器，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)不但在蛋白質(zhì)合成、折疊和加工分泌方面發(fā)揮不可替代的作用，還介導(dǎo)鈣離子的儲存。在正常生理條件下，蛋白質(zhì)合成、加工等過程在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)部有條不紊地進(jìn)行著[3]。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上3個感應(yīng)蛋白——蛋白激酶R樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶（protein kinase R-like ER kinase，PERK）、活化轉(zhuǎn)錄因子 6（activating transcription factor 6，ATF6）和需肌醇酶 1（inositol requiring enzyme 1，IRE1）——與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔的葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78（glucose-regulated protein，GRP-78；又稱binding immunoglobulin protein，BiP）處于結(jié)合狀態(tài)。然而，當(dāng)遭到損傷刺激時，許多錯誤折疊和未折疊的蛋白質(zhì)在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)堆集，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)部失去平衡，引發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（ER stress，ERS）。常見損傷刺激，如營養(yǎng)缺乏、缺氧、pH失衡或受到毒性物質(zhì)刺激等，均能使蛋白質(zhì)的加工處理功能減弱或造成鈣離子平衡的破壞。

PERK基因全長約70 kb，含有19個外顯子，位于人類染色體2p11.2，編碼的PERK蛋白由1116個氨基酸殘基構(gòu)成，相對分子質(zhì)量125×103。PERK又稱真核翻譯起始因子2α激酶3，是一種具有管腔結(jié)構(gòu)域和胞質(zhì)激酶結(jié)構(gòu)域的Ⅰ型跨膜蛋白。其官腔結(jié)構(gòu)域是一個二聚域，在未折疊蛋白反應(yīng)（unfolded protein response，UPR）中起著翻譯調(diào)控核心的作用。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激發(fā)生后，PERK的N端管腔結(jié)構(gòu)域的低聚能促進(jìn)其C端胞質(zhì)激酶結(jié)構(gòu)域在多個殘基上的磷酸化，包括Thr982、Tyr619、Ser715和Ser1094位點(diǎn)。C端結(jié)構(gòu)域具備絲/蘇氨酸（Ser/Thr）激酶活性，能把γ磷酸化基團(tuán)從三磷酸腺苷催化轉(zhuǎn)移到蛋白底物的Ser/Thr殘基上。真核生物翻譯起始因子2α亞基（eukaryotic initiation factor 2α，eIF-2α）是PERK最重要的靶分子，其磷酸化修飾反應(yīng)可導(dǎo)致蛋白質(zhì)合成下調(diào)進(jìn)而緩解ERS可能引發(fā)的損傷。另外，PERK還能誘導(dǎo)磷酸化核因子E2相關(guān)因子2（nuclear factor erythroid-2-related factor 2，Nrf2）的產(chǎn)生。Nrf2是一種亮氨酸拉鏈型轉(zhuǎn)錄因子，可調(diào)節(jié)細(xì)胞氧化還原狀態(tài)，并在UPR期間對細(xì)胞的存活發(fā)揮促進(jìn)作用。

2 PERK介導(dǎo)基因毒應(yīng)激的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制

基因毒應(yīng)激（genotoxic stress）是指生物體暴露于各種有害的理化和內(nèi)外環(huán)境因素之下，基因組DNA發(fā)生損傷進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的反應(yīng)。當(dāng)細(xì)胞經(jīng)受過強(qiáng)或持續(xù)的有害因素刺激時，為維持機(jī)體穩(wěn)態(tài)，ERS可激活細(xì)胞內(nèi)凋亡信號進(jìn)而引起細(xì)胞凋亡。PERK通路誘導(dǎo)凋亡時，涉及eIF2α、轉(zhuǎn)錄激活因子4（activating transcriptional factor 4，ATF4）、T細(xì)胞死亡相關(guān)基因 51（T-cell death-associated gene 51，TDAG51）、tribbles同源基因 3（tribbles homolog3，TRIB3）和鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶（calcineurin，CN），介導(dǎo)促凋亡效應(yīng)，而凋亡抑制蛋白（inhibitor of apoptosis proteins，IAP）、Nrf2介導(dǎo)拮抗凋亡的保護(hù)效應(yīng)。其中，PERK通過下游eIF2α/ATF4/CHOP信號介導(dǎo)凋亡反應(yīng)的發(fā)生。其作用機(jī)制是：C/EBP同源蛋白（C/EBP-homologous protein，CHOP）一方面阻止介導(dǎo)凋亡保護(hù)效應(yīng)蛋白Bcl-2、Bcl-xl等的表達(dá)，另一方面上調(diào)促凋亡蛋白Bax、Bid等的表達(dá)，誘導(dǎo)線粒體凋亡途徑活化[4]；同時，CHOP還能提高TRIB3水平，抑制抗凋亡的蛋白激酶B（PKB/Akt）發(fā)生磷酸化，導(dǎo)致PKB失活進(jìn)而觸發(fā)細(xì)胞凋亡[5]。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，TRIB3可以負(fù)反饋調(diào)節(jié)方式促進(jìn)細(xì)胞恢復(fù)正常功能，即與CHOP及ATF4反向結(jié)合進(jìn)而對其轉(zhuǎn)錄活性加以抑制。然而條件改變，TRIB3水平在長期損傷刺激下卻會反應(yīng)性增高，導(dǎo)致凋亡的發(fā)生。

TDAG51是具有促凋亡特征的類普列克底物蛋白（pleckstrin）同源結(jié)構(gòu)域家族成員。ERS信號激活后，PERK通過eIF2α的磷酸化修飾，實(shí)現(xiàn)對TDAG51的激活，提高Fas水平，導(dǎo)致T細(xì)胞走向凋亡。

此外，PERK還能與CN結(jié)合，促進(jìn)FK506結(jié)合蛋白12.6（FK506-binding protein 12.6，F(xiàn)KBP12.6）與萊恩素（ryanodine）受體2（RyR2）復(fù)合物的分離，ER中Ca2+釋放，由于膜電勢梯度，Ca2+迅速移位至線粒體，破壞線粒體中Ca2+的平衡，從而引起凋亡反應(yīng)[6]。

另一方面，PERK也能抑制凋亡，促進(jìn)細(xì)胞生存。胱冬酶（caspases）是介導(dǎo)細(xì)胞凋亡反應(yīng)的重要分子，它能與IAP結(jié)合進(jìn)而導(dǎo)致凋亡被阻斷。ERS期間，當(dāng)細(xì)胞達(dá)到臨界應(yīng)激水平時，PERK能選擇性誘導(dǎo)IAP家族蛋白，從而抑制細(xì)胞凋亡的發(fā)生。另外，PERK還可通過誘導(dǎo)磷酸化Nrf2（p-Nrf2）保護(hù)細(xì)胞存活[7]。氧化應(yīng)激反應(yīng)發(fā)生時，PERK可直接誘導(dǎo)p-Nrf2的產(chǎn)生，打破Nrf2和Keap1（Keleh-like ECH-associated protein 1）的結(jié)合狀態(tài)[8]。隨后Nrf2激活抗氧化反應(yīng)元件（antioxidant response element，ARE）依賴基因，編碼產(chǎn)生一系列抗氧化和細(xì)胞保護(hù)蛋白，如血紅素氧合酶1（heme oxygenase-1，HO-1），發(fā)揮抵抗炎癥和細(xì)胞凋亡保護(hù)效應(yīng)[9-11]。研究表明，Nrf2的抑制加重了ERS和凋亡，而Nrf2的過表達(dá)降低了CHOP的水平，保護(hù)細(xì)胞不發(fā)生凋亡，這揭示了Nrf2除了激活下游分子抑制凋亡外，還有可能影響介導(dǎo)凋亡發(fā)生相關(guān)蛋白的表達(dá)，發(fā)揮凋亡保護(hù)作用[12]。

3 PERK介導(dǎo)代謝應(yīng)激的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制

3.1 PERK對脂類代謝應(yīng)激的調(diào)節(jié)

PERK可參與調(diào)控脂類合成、分解氧化以及分泌和轉(zhuǎn)運(yùn)，調(diào)節(jié)脂類的代謝進(jìn)程。

ATP-檸檬酸裂解酶（ATP-citratelyase，ACLY）、乙酰輔酶A羧基化酶（acetyl-CoA carboxylase，ACC）和脂肪酸合成酶（fatty acid synthase，F(xiàn)ASN）等在脂肪酸的合成反應(yīng)中起著重要的催化作用，PERK可通過調(diào)節(jié)FASN、ACLY的表達(dá)參與調(diào)控脂肪酸合成過程[13]。

固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白（sterol regulating element binding protein，SREBP）位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，不僅調(diào)控胞內(nèi)膽固醇濃度，也能對脂肪酸及甘油三酯的合成進(jìn)行控制。它的3個成員（SREBP2、SREBP1c和SREBP1a）分別調(diào)節(jié)膽固醇合成關(guān)鍵酶羥甲戊二酰輔酶A還原酶（hydroxymethylglutaryl coenzyme A reductase，HMGCR）、低密度脂蛋白受體（low density lipoprotein receptor，LDLR）、FASN等脂代謝相關(guān)基因的表達(dá)[14-18]。ERS對脂類代謝的影響主要是通過鏈接SREBP而實(shí)現(xiàn)的[14]。Pro-SREBP不具備活性，其激活反應(yīng)在高爾基體內(nèi)進(jìn)行，而轉(zhuǎn)運(yùn)SREBP的過程必須與SREBP裂解活化蛋白（SREBP-cleavageactivating protein，SCAP）結(jié)合形成復(fù)合體，由SCAP承擔(dān)轉(zhuǎn)運(yùn)的作用[19]。而當(dāng)細(xì)胞中膽固醇過量時，過量膽固醇優(yōu)先與ER膜的SCAP蛋白以及駐留分子胰島素誘導(dǎo)因子（insulin induced gene，Insig）結(jié)合，致使SREBP駐留在ER中。ERS可以激活PERK-eIF2α途徑進(jìn)而抑制Insig-1蛋白合成，SCAP得到解離，重新轉(zhuǎn)運(yùn)SREBP至高爾基體中發(fā)生水解反應(yīng)，影響脂肪酸和膽固醇的生成[13,20]。

除此之外，PERK-eIF2α途徑可通過促進(jìn)C/EBPα/β蛋白的翻譯，上調(diào)脂肪代謝因子PPARγ的水平和脂肪生成，導(dǎo)致肝內(nèi)脂質(zhì)累積[21-22]。另有對小鼠的研究指出，在白色脂肪組織中，ATF4介導(dǎo)脂肪生成基因的表達(dá)，不僅促進(jìn)脂肪酸的合成，還能負(fù)向調(diào)節(jié)脂肪動員，揭示了PERK可能經(jīng)由ATF4介導(dǎo)脂肪代謝的新機(jī)制[23]。

PERK也能參與脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)和分泌。內(nèi)源性甘油三酯主要依靠極低密度脂蛋白（very low density lipoprotein，VLDL）參與轉(zhuǎn)運(yùn)。而PERK能直接抑制后者的重要成分ApoB100的合成反應(yīng)，導(dǎo)致脂肪無法被轉(zhuǎn)運(yùn)而滯留于肝細(xì)胞，誘發(fā)肝脂肪變性[24]。有趣的是，Jo等發(fā)現(xiàn)PERK-ATF4還能介導(dǎo)VLDL受體VLDLR的表達(dá)，刺激細(xì)胞內(nèi)甘油三酯的積累，引起肝臟脂質(zhì)沉積。

3.2 PERK對糖代謝應(yīng)激的調(diào)節(jié)

胰島素抵抗是指多種因素引起的胰島素提高葡萄糖攝取和利用效率的降低，主要表現(xiàn)在肝、肌肉與脂肪組織等靶器官或靶組織對胰島素的反應(yīng)能力下降。ERS與代謝疾病密切相關(guān)，是引起胰島素抵抗和Ⅱ型糖尿病的重要誘因[25-26]。PERK/eIF2α途徑活化可上調(diào)C/EBP水平，進(jìn)而激活Forkhead轉(zhuǎn)錄因子FoxO1并上調(diào)糖異生反應(yīng)限速酶磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶（phosphoenolpyruvate carboxykinase，PEPCK）和葡萄糖-6-磷酸酶（glucose-6-phosphatase，G6Pase）表達(dá)，使葡萄糖含量升高，這是Ⅱ型糖尿病的常見原因。現(xiàn)已證實(shí)，肥胖可以導(dǎo)致脂肪組織和肝臟內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，進(jìn)而誘發(fā)Ⅱ型糖尿病[2]。

肥胖狀態(tài)下,肝臟中PERK-eIF2α-ATF4通路活化并上調(diào)TRIB3表達(dá),后者可與肝臟p70 S6激酶（hepatic p70 S6 kinase，S6K1）聯(lián)合作用，通過胰島素受體底物1-磷脂酰肌醇3激酶途徑抑制AKT的磷酸化，致使胰島素抵抗的發(fā)生[27-28]。有實(shí)驗(yàn)表明，對小鼠進(jìn)行高脂飼料喂養(yǎng)誘導(dǎo)肥胖效應(yīng)后，PERK和CHOP蛋白表達(dá)顯著增高，致使血清胰島素水平和肝臟脂質(zhì)沉積增加。

然而，PERK也能通過eIF2α參與調(diào)控肝臟的糖異生過程，改善胰島素抵抗和糖代謝水平。這是由于小鼠肝臟中特異性過表達(dá)GADD34，形成的GADD34-PP1c復(fù)合物促進(jìn)了p-eIF2α的去磷酸化反應(yīng)[29-30]。

4 PERK介導(dǎo)炎性應(yīng)激的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激與多種炎性因子的產(chǎn)生具有密切聯(lián)系。核因子κB（nuclear factor kappa B，NF-κB）在近乎所有類型細(xì)胞中廣泛存在，在炎性反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。其靶基因包括腫瘤壞死因子α（tumor nccrosis factor，TNF-α）、多種白細(xì)胞介素（interleukin，IL）和黏附分子等60多種。經(jīng)典途徑的NF-κB活化反應(yīng)須經(jīng)歷p65∶p50異二聚體與NF-κB抑制因子IκB（inhibitor of NF-κB）之間的解離反應(yīng)，此后NF-κB快速移至細(xì)胞核，與靶基因啟動子區(qū)的特異性κB序列發(fā)生結(jié)合反應(yīng)，促進(jìn)炎性應(yīng)激相關(guān)分子的轉(zhuǎn)錄。在此過程中，PERK活化能抑制包括IκB在內(nèi)的蛋白質(zhì)的翻譯反應(yīng)，解除IκB對NF-κB的抑制作用，促進(jìn)NF-κB移位至核內(nèi)進(jìn)而發(fā)生激活。另外，PERK能引起TRIB3等與應(yīng)激有關(guān)蛋白的過表達(dá)，直接作用于NF-κB并促進(jìn)其活化[31]。另有研究表明，CHOP敲除后，小鼠白色脂肪組織中的巨噬細(xì)胞極化成M2型，炎癥因子的表達(dá)減少，慢性炎癥反應(yīng)被抑制，說明PERK也能通過下游CHOP促進(jìn)炎性因子的產(chǎn)生，進(jìn)而介導(dǎo)炎性反應(yīng)[32]。

細(xì)胞質(zhì)中炎性因子IL-1β、IL-18未經(jīng)修飾的前體形式是無活性的，需要借助炎性小體，使得Caspase-1自我剪切并活化，裂解Pro-IL-1β、Pro-IL-18，才能成熟和分泌。而PERK能通過誘導(dǎo)硫氧還蛋白相互作用蛋白（thioredoxin-interacting protein，TXNIP），促進(jìn) NLRP3 炎性小體的表達(dá)[33]；也有研究指出，PERK通路的下游產(chǎn)物ATF4能直接與炎性小體NLRP1的啟動子結(jié)合，促進(jìn)其表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)炎性相關(guān)分子的成熟和分泌[34]。

5 結(jié)語

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是最為精細(xì)和復(fù)雜的膜系統(tǒng)，蛋白質(zhì)合成加工、糖脂合成及轉(zhuǎn)運(yùn)等生命活動均需依托于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)才能正常進(jìn)行。作為ER應(yīng)激三大感應(yīng)蛋白之一，PERK在介導(dǎo)細(xì)胞凋亡、參與機(jī)體營養(yǎng)和代謝調(diào)節(jié)以及調(diào)控炎癥反應(yīng)方面具有重要意義。但有關(guān)PERK的細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)調(diào)節(jié)機(jī)制的研究還遠(yuǎn)遠(yuǎn)不足。目前，有關(guān)ER應(yīng)激偶聯(lián)自噬反應(yīng)機(jī)制是PERK領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)，這一方向的新發(fā)現(xiàn)將為解釋PERK介導(dǎo)基因毒應(yīng)激、代謝應(yīng)激和炎性應(yīng)激功能提供更多依據(jù)。同時，PERK信號網(wǎng)絡(luò)的研究也在逐步深入。尤其是PERK不依賴內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激條件發(fā)揮代謝調(diào)節(jié)功能的發(fā)現(xiàn)，體現(xiàn)了PERK本身作為調(diào)節(jié)因子，能獨(dú)立發(fā)揮調(diào)控作用，這也將成為未來解釋PERK多功能性的新視角[35]。