CD200與CD4+CD25+CD127lowTreg在強(qiáng)直性脊柱炎中的意義①

宋 琛 孫亞洲 李 強(qiáng) 宋旭恒 馮 龍 王志銀 張晨光

(新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院血液學(xué)實(shí)驗(yàn)室，衛(wèi)輝 453100)

強(qiáng)直性脊柱炎(ankylosing spondylitis，AS)是一種慢性的自身免疫性疾病，主要影響脊柱、骶髂關(guān)節(jié)及踝關(guān)節(jié)等，可產(chǎn)生多種并發(fā)癥狀[1]。AS的發(fā)病與遺傳、自身免疫、感染、外源性損傷等因素較為密切。國(guó)內(nèi)外已有研究發(fā)現(xiàn)[2]，在疾病進(jìn)展過程中，AS患者T淋巴細(xì)胞亞群數(shù)量和活性出現(xiàn)失衡，調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(regulatory T-cell，Treg)主要通過抑制T淋巴細(xì)胞的增殖來調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫抑制功能，介導(dǎo)機(jī)體自身免疫損傷的發(fā)生。Ox-2膜糖蛋白，也稱CD200，是由CD200基因編碼的糖蛋白，具有免疫抑制功能，近年來逐漸被發(fā)現(xiàn)且應(yīng)用于臨床及基礎(chǔ)研究。相關(guān)研究表明，CD200參與了多種風(fēng)濕性疾病的發(fā)病機(jī)制，并被用來作為風(fēng)濕性疾病的獨(dú)立預(yù)測(cè)因子[3,4]。CD200在腫瘤免疫治療方面的研究也逐漸深入，并取得了一定的進(jìn)展[5,6]。目前有關(guān)CD200在AS中的應(yīng)用及其影響機(jī)體免疫應(yīng)答的認(rèn)識(shí)還十分有限。IL-6主要由內(nèi)皮細(xì)胞、單核細(xì)胞產(chǎn)生，參與機(jī)體的炎癥反應(yīng)和免疫應(yīng)答[7]。血清淀粉樣蛋白A(serum amyloid A protein，SAA)作為一項(xiàng)指示炎癥的檢測(cè)指標(biāo)，在AS炎癥處于急性期時(shí)，SAA可迅速升高[8]。因此，探討CD200與Treg以及IL-6、SAA等炎癥指標(biāo)在AS中的意義具有一定的臨床價(jià)值。

1 資料與方法

1.1資料

1.1.1一般資料 選擇2018年2月至2019年2月在新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院診治的74例AS患者為觀察組，其中男50例，女24例，年齡(33.28±11.91)歲。入選的所有患者均根據(jù)2010年中華醫(yī)學(xué)會(huì)風(fēng)濕病學(xué)分會(huì)制定的《強(qiáng)直性脊柱炎診斷及治療指南》[9]的診斷標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行篩查，并且在樣本收集前的三個(gè)月內(nèi)沒有使用免疫抑制療法。根據(jù)2009年國(guó)際脊柱關(guān)節(jié)炎協(xié)會(huì)(ASAS)指定的AS疾病活動(dòng)度(ASDAS)對(duì)患者進(jìn)行評(píng)分，超過或等于1.3分為活動(dòng)性的AS患者，低于1.3分為穩(wěn)定性的AS患者[10]，其中活動(dòng)組50例，穩(wěn)定組24例。不包括入院前半年內(nèi)接受糖皮質(zhì)激素治療的患者；排除合并急性感染及腫瘤患者；排除合并風(fēng)濕病及其他自身免疫病患者；排除嚴(yán)重的肝腎功能障礙；排除妊娠婦女。選取50例健康志愿者，作為對(duì)照組，男30例，女20例，年齡(32.00±11.80)歲。兩組研究對(duì)象的性別、年齡等差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.1.2標(biāo)本處理 無菌采集兩組外周血5 ml，一管2 ml，EDTA-K2抗凝，4℃保存，流式檢測(cè)；另一管3 ml，枸櫞酸鈉促凝，分離血清(3 000 r/min，10 min)，保存于-80℃，檢測(cè)血清CD200、IL-6、SAA的含量。

1.1.3主要試劑和儀器 CD3-ECD、CD3-PE、CD4-PC7、CD4-FITC、CD8-FITC、CD19-ECD、CD25-ECD、CD127-PC5.5及同型對(duì)照IgG1-FITC、IgG2a-PE、IgG1-ECD、IgG1-PC5.5、IgG1-PC7均為Beckman產(chǎn)品，CD200-PE為BD產(chǎn)品，人CD200為武漢博士德產(chǎn)品，IL-6試劑盒和上轉(zhuǎn)發(fā)光免疫分析儀(型號(hào)：UPT-3A-1800)購(gòu)自北京熱景生物公司，血清淀粉樣蛋白A試劑盒購(gòu)自重慶中元生物公司，酶標(biāo)儀購(gòu)自美國(guó)美谷分子公司(型號(hào)：SpectraMax Plus384)，流式細(xì)胞儀(型號(hào)：DxFLEX)、全自動(dòng)生化儀(型號(hào)：AU5800)購(gòu)自Beckman Coulter。

1.2方法

1.2.1流式細(xì)胞術(shù)(Flow cytometry，F(xiàn)CM)檢測(cè)外周血Treg的比例和淋巴亞群中CD200的表達(dá)率 取3支12 mm×75 mm流式樣品管，標(biāo)記為1～3，1號(hào)為同型對(duì)照管，加入IgG1-FITC/IgG2a-PE/IgG1-ECD/IgG1-PC5.5/IgG1-PC7，2、3號(hào)為實(shí)驗(yàn)管，加入抗體CD8-FITC/CD200PE/CD3-ECD/CD19-PC5.5/CD4-PC7、CD4-FITC/CD3-PE/CD25-ECD/CD127-PC5.5各10 μl，每管加入100 μl抗凝血，在渦旋振蕩儀上混勻后，室溫避光反應(yīng)20 min，加入500 μl溶血素，混勻，室溫避光反應(yīng)10 min，1 100 r/min離心10 min后去上清，加入500 μl PBS溶液，混勻，1 100 r/min離心10 min，棄上清，重復(fù)洗滌2次，加入500 μl PBS溶液，渦旋振蕩后用FCM檢測(cè)。

1.2.2ELISA檢測(cè)血清中CD200濃度 按照試劑說明書進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋，進(jìn)行以下步驟：設(shè)空白孔、標(biāo)準(zhǔn)孔、待測(cè)樣品孔，分別加入樣品稀釋液、標(biāo)準(zhǔn)品及待測(cè)樣品，在室溫下孵育90 min，棄去液體；每孔加入生物素化抗體，在室溫下孵育60 min，洗板3次；每孔加酶結(jié)合物，在室溫下孵育30 min，洗板3次；每孔加入顯色液，在室溫下孵育30 min；將終止溶液加入各孔中，用酶標(biāo)儀在450 nm波長(zhǎng)下，測(cè)量其光密度(OD值)。

1.2.3上轉(zhuǎn)發(fā)光法檢測(cè)血清中IL-6含量 在檢測(cè)卡上注明編號(hào)，取樣本100 μl，加入150 μl樣本稀釋液，渦旋震蕩；取稀釋好的樣品100 μl，加入加樣孔，室溫孵育15 min；在分析儀上校參后測(cè)量。

1.2.4乳膠增強(qiáng)免疫比濁法檢測(cè)血清中SAA含量 采用貝克曼全自動(dòng)生化儀AU5800檢測(cè)SAA含量。

2 結(jié)果

2.1AS活動(dòng)組患者中存在淋巴細(xì)胞亞群紊亂 活動(dòng)組CD4+T細(xì)胞、CD19+B細(xì)胞均高于對(duì)照組(P<0.05)，CD8+T細(xì)胞百分率低于對(duì)照組(P<0.05)，活動(dòng)組與對(duì)照組比較，CD3+T細(xì)胞百分率無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；穩(wěn)定組淋巴細(xì)胞亞群各組分與對(duì)照組均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見圖1、表1。

圖1 各組淋巴細(xì)胞亞群的表達(dá)率Fig.1 Expression rate of lymphocyte subsets in each groupNote:*.P<0.05,**.P<0.01,***.P<0.001.

GroupsnCD3+T cellCD3+CD4+T cellCD3+CD8+T cellCD19+B cellControl5073.25±3.1339.23±3.9929.45±3.699.91±2.95Stable2474.00±4.8639.36±5.3931.04±2.969.73±2.98Active5072.39±5.6646.22±6.591)22.58±3.512)14.48±4.411)

Note：1)P<0.01,2)P<0.001,with control.

圖2 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)CD4+CD25+CD127lowTreg細(xì)胞Fig.2 Flow cytometry for detection of CD4+CD25+CD127lowTregNote:A.Flow cytometry pictures;B.The percentage of Tregs in each group.***.P<0.001.

2.2活動(dòng)組CD4+CD25+CD127lowTreg的百分率顯著減低 根據(jù)FSC(細(xì)胞體積大小)和SSC(細(xì)胞內(nèi)容物)對(duì)外周血淋巴細(xì)胞圈門，分析CD4+CD25+CD127low占CD3+CD4+T細(xì)胞的比例，即為Treg的百分率，見圖2A。結(jié)果顯示，活動(dòng)組Treg的比例明顯低于對(duì)照組(P<0.001)，而穩(wěn)定組Treg的百分率與對(duì)照組相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。見圖2B、表2。

表2 CD4+CD25+CD127lowTreg細(xì)胞增殖情況(%)

Tab.2 Proliferation of CD4+CD25+CD127lowTregs(%)

GroupsnCD4+CD25+CD127lowTregsPControl507.82±1.00-Stable247.58±1.070.360Active505.24±1.11<0.001

圖3 淋巴細(xì)胞亞群中CD200表達(dá)率的流式圖Fig.3 Flow pattern of CD200 expression in lymphocyte subsets

圖4 各組淋巴細(xì)胞亞群中CD200的表達(dá)Fig.4 Expression of CD200 in lymphocyte subsets of each groupNote:A.Represents the expression of CD200 in CD3+T cells;B.Represents the expression of CD200 in CD4+T cells;C.Represents the expression of CD200 in CD8+T cells;D.Represents the expression of CD200 in CD19+B cells.**.P<0.01,***.P<0.001.

2.3CD200在T淋巴細(xì)胞上的表達(dá)下調(diào) 與對(duì)照組相比，活動(dòng)組CD3+、CD4+、CD8+T細(xì)胞中CD200的表達(dá)率顯著減低(P<0.001)，CD19+B細(xì)胞中CD200的表達(dá)率無差異；穩(wěn)定組CD3+、CD4+T細(xì)胞上CD200的表達(dá)率減低(P<0.01)，CD8+T細(xì)胞、CD19+B細(xì)胞中CD200的表達(dá)率無差異。見圖3、4、表3。

2.4血清中CD200、IL-6、SAA的含量(pg/ml) 活動(dòng)組血清CD200的濃度低于對(duì)照組(P<0.01)，IL-6、SAA的濃度高于對(duì)照組(P<0.01、P<0.001)；穩(wěn)定組血清CD200的濃度低于對(duì)照組(P<0.05)，IL-6的濃度高于對(duì)照組(P<0.05)，SAA的濃度與對(duì)照組沒有差異。見表4。

2.5AS活動(dòng)組CD3+T淋巴細(xì)胞中CD200的表達(dá)率以及Treg細(xì)胞與IL-6、SAA的相關(guān)性分析 活動(dòng)組CD3+T細(xì)胞上CD200表達(dá)率與Treg正相關(guān)(r=0.345，P<0.05)，與IL-6負(fù)相關(guān)(r=-0.352，P<0.05)，與SAA不相關(guān)；活動(dòng)組Treg的百分率與IL-6負(fù)相關(guān)(r=-0.592，P<0.01)，與SAA不相關(guān)。見表5。

2.6CD200、Treg、IL-6及SAA的診斷效能分析 CD200、Treg、IL-6及SAA的曲線下面積(AUC)分別為0.921、0.751、0.883、0.734。比較CD200與Treg、IL-6、SAA在預(yù)測(cè)AS炎癥活動(dòng)時(shí)的診斷效能得出，CD200的診斷價(jià)值優(yōu)于Treg、SAA(Z值分別為3.596、3.446，P<0.001)，但與IL-6比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Z=1.046，P>0.05)，但在預(yù)測(cè)AS疾病炎癥活動(dòng)時(shí)，CD200的敏感度較高，其診斷界值為6.30%時(shí)，敏感度為88.5%，特異度為90.9%。見圖5、表6。

表3 淋巴細(xì)胞亞群中CD200的表達(dá)率(%)

Tab.3 Expression rate of CD200 in lymphocyte subsets(%)

GroupsnCD200+/CD3+CD200+/CD4+CD200+/CD8+CD200+/CD19+Control507.29±1.229.49±1.362.46±0.4763.39±6.37Stable245.35±1.301)7.01±1.871)2.32±0.6959.68±5.61Active502.68±0.872)3.89±1.402)1.07±0.572)59.42±5.88

Note：Compared with control，1)P<0.01,2)P<0.001.

表4 各組血清中CD200、IL-6、SAA的濃度(pg/ml)

Tab.4 Concentrations of CD200,IL-6 and SAA in serum of each group(pg/ml)

GroupsnCD200IL-6SAAControl5088.86±26.414.04±1.695.32±2.52Stable2471.23±23.751)5.84±1.061)5.05±2.32Active5068.00±25.172)12.14±2.912)87.83±83.783)

Note：Compared with control，1)P<0.05,2)P<0.01,3)P<0.001.

表5 AS活動(dòng)組CD3+T淋巴細(xì)胞中CD200的表達(dá)率和Treg與IL-6、SAA的相關(guān)性

Tab.5 Correlation between expression of CD200 in CD3+T cells and Treg and IL-6,SAA in active group

Inflammatory factorCD200rPTregrPIL-6-0.3521)0.028-0.5922)0.000SAA-0.1090.509-0.1120.497

Note：1)P<0.05,2)P<0.001.

表6 ROC曲線分析數(shù)據(jù)

Tab.6 Analysis data of ROC curves

ItemAUC95%CIStandard errorCut offSensitivity(%)Specificity(%)CD2000.9210.861-0.9810.0266.30%88.590.9Treg0.7510.636-0.8660.0496.87%67.989.9IL-60.8830.792-0.9730.0366.44 pg/ml69.290.9SAA0.7340.606-0.8620.0526.05 pg/ml80.854.5

圖5 ROC曲線分析圖Fig.5 Analysis chart of ROC curves

3 討論

作為一種慢性自身免疫性炎性疾病，AS主要發(fā)生在16～40歲的男性中，其發(fā)病較為隱匿，隨著病情的發(fā)展，患者逐漸由最初的腰背及外周關(guān)節(jié)的疼痛，進(jìn)展為腰椎活動(dòng)受限，甚至脊柱的畸形及強(qiáng)直[11]。

盡管AS的發(fā)病機(jī)制尚不完全清楚，但是AS患者機(jī)體的免疫功能受到影響較為明顯，免疫系統(tǒng)的調(diào)節(jié)與拮抗作用在AS疾病中起重要作用。我們對(duì)體內(nèi)抗原特異性Treg反應(yīng)的理解大部分是由于T細(xì)胞受體(TCR)轉(zhuǎn)基因Treg的生成。這使得在活體內(nèi)跟蹤具有特定特異性的Treg，有助于分析遇到同源抗原如何影響Treg的穩(wěn)態(tài)和功能[12]。Treg被TCR介導(dǎo)的信號(hào)通路激活后，會(huì)抑制T淋巴細(xì)胞增殖和特異性免疫調(diào)節(jié)，同時(shí)分泌抑制性細(xì)胞因子，抑制效應(yīng)細(xì)胞的功能[13]。Treg細(xì)胞的表面標(biāo)志為CD4+CD25+Foxp3+，由于Foxp3表達(dá)于細(xì)胞內(nèi)，運(yùn)用FCM技術(shù)檢測(cè)時(shí)需要破膜，較易引起抗體效價(jià)的減弱及細(xì)胞碎片的產(chǎn)生。研究發(fā)現(xiàn)Foxp3的高表達(dá)與CD127的低表達(dá)之間相關(guān)性良好。由于操作比較簡(jiǎn)單，因此選擇CD127來檢測(cè)Treg細(xì)胞[14]。研究發(fā)現(xiàn)Treg細(xì)胞與各種炎癥疾病、風(fēng)濕性疾病和腫瘤的發(fā)病機(jī)理密切相關(guān)[15]。針對(duì)Treg細(xì)胞比例和恢復(fù)Treg細(xì)胞功能治療風(fēng)濕性疾病的研究已深入開展，并取得了進(jìn)展[16,17]，如SLE患者注射小劑量rhIL-2后，機(jī)體Treg細(xì)胞的比例出現(xiàn)了不同程度的升高；間充質(zhì)干細(xì)胞經(jīng)過瘦素預(yù)處理，可破壞Treg的上調(diào)作用，使SLE患者異常升高的瘦素減低，患者Treg活性及數(shù)量得以恢復(fù)[18,19]。

CD200是免疫球蛋白超家族的成員，也是在B細(xì)胞、活化的T細(xì)胞和濾泡樹突細(xì)胞等表面表達(dá)的Ⅰ型跨膜糖蛋白[20]。CD200與其受體(CD200R)相互作用，主要用傳遞免疫抑制信號(hào)的方式來維持免疫穩(wěn)態(tài)。CD200主要通過TCR與MHC分子復(fù)合物結(jié)合或與抗TCRmAb結(jié)合兩種方式來介導(dǎo)共刺激信號(hào)，可以促進(jìn)T細(xì)胞的增殖和活化。Coles等[21]指出，CD200與急性髓性白血病的T細(xì)胞免疫抑制有關(guān)，CD200與其受體的結(jié)合可以提升Treg的數(shù)量和活性，使機(jī)體免疫功能恢復(fù)正常。Xu等[22]發(fā)現(xiàn)，CD200的表達(dá)下調(diào)可以導(dǎo)致子癇前期胎盤滋養(yǎng)層中Th1細(xì)胞因子的增加與Th2細(xì)胞因子的減少。Song等[23]指出，類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者單核細(xì)胞巨噬細(xì)胞CD200R表達(dá)降低與Th17/Treg失衡和疾病活動(dòng)有一定的關(guān)聯(lián)。

本研究在檢測(cè)外周血(CD3+、CD4+、CD8+)T細(xì)胞和CD19+B淋巴細(xì)胞中CD200的表達(dá)發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，活動(dòng)組外周血(CD3+、CD4+、CD8+)T細(xì)胞中CD200的表達(dá)明顯減少，血清CD200濃度降低，而CD200在CD19+B細(xì)胞上的表達(dá)沒有顯著差異。這表明CD200的異常表達(dá)在AS患者免疫紊亂中有重要作用，并且，CD200在T細(xì)胞上異常表達(dá)，而在B細(xì)胞上的表達(dá)與對(duì)照組沒有差異，可能是因?yàn)镃D200主要在B細(xì)胞和活化的T細(xì)胞中表達(dá)，而CD200R在T細(xì)胞上表達(dá)較多，在B細(xì)胞上表達(dá)很少，這種CD200與CD200R分布的差異，使得AS患者B淋巴細(xì)胞中CD200的表達(dá)無明顯改變。AS患者活動(dòng)期外周血Treg的比例減低，這說明與許多自身免疫性疾病一樣，Treg百分率的減低在AS的發(fā)病過程中發(fā)揮著相關(guān)作用，這與有關(guān)報(bào)道一致[24]。IL-6、SAA等炎癥指標(biāo)在活動(dòng)期明顯升高，而在穩(wěn)定期IL-6輕度升高，SAA無明顯變化，指示IL-6、SAA可以反映AS疾病活動(dòng)。CD3+T細(xì)胞中CD200的百分率與Treg正相關(guān)，與IL-6負(fù)相關(guān)，我們推測(cè)，AS患者CD200的表達(dá)下調(diào)，影響了Th1/Th2細(xì)胞因子的產(chǎn)生，干預(yù)T細(xì)胞的生成、分化，抑制Treg增殖，增加了AS疾病的易感性及感染概率，造成機(jī)體疾病活動(dòng)度增加，從而參與AS患者體內(nèi)免疫功能調(diào)節(jié)。AS患者IL-6的含量升高，促進(jìn)初始CD4+T細(xì)胞轉(zhuǎn)化為Treg的能力降低，抗原提呈能力增強(qiáng)，激活T細(xì)胞，減少對(duì)T細(xì)胞的抑制功能，淋巴細(xì)胞亞群出現(xiàn)紊亂。因此，提示AS患者CD200的異常下調(diào)可能影響T淋巴細(xì)胞的分化，同時(shí)抑制Treg細(xì)胞的生成，對(duì)AS的易感性增加。同時(shí)，研究發(fā)現(xiàn)，CD200的診斷價(jià)值優(yōu)于Treg、SAA，但與IL-6的輔助診斷價(jià)值相當(dāng)，故CD200在輔助AS的診斷及評(píng)估AS患者機(jī)體免疫功能等方面具有一定的潛力。

綜上所述，AS活動(dòng)期CD3+T淋巴細(xì)胞中CD200的表達(dá)水平及血清中CD200的濃度均下調(diào)，其可能影響Treg的生成及活化，并引起機(jī)體炎癥的發(fā)生。研究提示AS患者CD200和Treg的表達(dá)異常可能參與AS疾病的發(fā)生及發(fā)展，兩者在輔助AS疾病的診斷及免疫功能的評(píng)估等方面具有一定的參考價(jià)值。