血清淀粉樣蛋白A、C反應(yīng)蛋白熒光免疫層析聯(lián)合檢測方法的建立①

賀 沁 周春峰 王云龍 明 亮 李玉林 曹繼宗

(鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院檢驗科，鄭州 450052)

感染性疾病是威脅人類健康的重要病因之一，臨床常以C反應(yīng)蛋白(C-reaction protein，CRP)和血清淀粉樣蛋白A(serum amyloid A，SAA)作為早期診斷感染性疾病的檢測指標。CRP和SAA是反映早期炎癥的敏感指標，當機體發(fā)生細菌感染時，二者含量顯著升高；而在病毒感染早期，SAA顯著升高，CRP不升高或僅小幅升高[1,2]。因此，SAA與CRP聯(lián)合檢測有利于早期鑒別細菌或病毒感染，為臨床用藥提供參考[3,4]。目前，臨床上針對SAA、CRP檢測主要是化學(xué)發(fā)光和免疫比濁法，這些方法主要適用于擁有相對完善檢驗設(shè)備的大中型醫(yī)院，不適用基層或社區(qū)醫(yī)療機構(gòu)床旁快速檢測，限制了其臨床應(yīng)用。

本研究旨在利用熒光免疫層析技術(shù)建立一種可同時聯(lián)合定量檢測血清中CRP、SAA的檢測方法，既滿足社區(qū)基層醫(yī)院常規(guī)檢測的需求，又可提高鑒別細菌、病毒感染的準確度，節(jié)省檢測時間，指導(dǎo)患者合理用藥，為感染性疾病的早期篩查提供了一種便捷、準確的檢測方法。

1 材料與方法

1.1材料 Eu3+羧基熒光微球購自上海微測生物科技有限公司；鼠抗兔IgG單克隆抗體、CRP配對單克隆抗體、SAA配對單克隆抗體、硝酸纖維素膜、PVC板、玻璃纖維素膜、吸水紙、CRP、SAA線性質(zhì)控品，精密性質(zhì)控品均由河南省生物工程技術(shù)研究中心提供。N，N′-二環(huán)己基碳二亞胺(EDC)和N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)購自南京化學(xué)試劑股份有限公司。三維點膜噴金儀、自動斬切機購自上海金標生物；熒光定量分析儀購自杭州峰航科技有限公司；NanoDrop微量紫外分析儀購自Thermo。

1.2方法

1.2.1試紙條的制備 參照文獻[5,6]，采用EDC-NHS兩步法活化熒光微球，取5 μl熒光微球加入500 μl 0.05 mol/L 硼酸緩沖液(pH8.0)漩渦振蕩混勻后，加入50 μl EDC溶液(1 mg/ml)和 50 μl NHS溶液(1 mg/ml) 作為活化劑混勻后，振蕩活化30 min；15 000 r/min離心20 min，棄上清；加入800 μl 0.05 mol/L硼酸緩沖液(pH8.0)復(fù)溶沉淀后，再加入20 μg 抗SAAⅠ抗體，室溫下振蕩偶聯(lián)2 h；15 000 r/min 離心20 min，棄上清；加入1 ml微球保護液復(fù)溶沉淀后，加入10 μl 1%BSA溶液振蕩封閉1 h，置于4℃保存?zhèn)溆?。熒光微球標記抗CRP Ⅰ抗體：加入20 μg 抗CRP Ⅰ抗體，其余步驟同熒光微球標記抗SAA Ⅰ抗體。熒光微球標記兔IgG多克隆抗體：加入10 μg 兔IgG多克隆抗體，其余步驟同熒光微球標記SAA Ⅰ 抗體。將3種免疫微球按照體積比1∶1∶1混勻后，按照5 μl/cm噴涂到微球結(jié)合墊上制備成微球墊，37℃干燥2 h。采用三維平面點膜噴金儀，按1 μl/cm將2 mg/ml 鼠抗兔IgG單克隆抗體、 1.5 mg/ml 抗SAA Ⅱ單克隆包被抗體、1.5 mg/ml 抗 CRPⅡ單克隆包被抗體包被于NC膜上分別作為T1線、T2和C線，37℃干燥2 h。按試紙條組裝方式，組裝好后用切條機切成3.9 mm寬的試紙條如圖1，裝于帶有干燥劑的鋁箔袋中密封，置于2～8℃保存?zhèn)溆谩?/p>

圖1 SAA、CRP二聯(lián)熒光免疫層析試紙條結(jié)構(gòu)示意圖Fig.1 Schematic diagram of combined detection of SAA and CRP fluorescence immunochromatographic test strips

1.2.2試紙條的檢測 采用樣品稀釋液(pH7.8 0.02 mol/L Tris-HCl、0.9%NaCl、0.1%BSA、0.5%T-20，0.1%NaN3)將血清稀釋100倍后，取70 μl樣品加樣，5 min后于熒光定量分析儀中檢測，分析軟件自動計算出待測樣本中的SAA、CRP濃度。

1.2.3最佳標記蛋白量與包被蛋白量的確定 采用二因素多水平實驗確定最佳SAA、CRP標記包被抗體的量,設(shè)計5 μl熒光微球，兔 IgG標記量為10 μg，鼠抗兔IgG單克隆抗體包被量為2.0 mg/ml，SAA、CRP標記抗體梯度為10、20、40 μg，包被抗體濃度梯度為1.0、1.5、2.0 mg/ml。按照1.2.2的方法制備試紙條,用線性參考品檢測試紙條的線性范圍與R2。

1.2.4分析性能評價

1.2.4.1標準曲線的建立 取SAA、CRP線性標準品濃度依次為0.78、1.56、3.125、6.25、12.5、25、50、100、150、200 μg/ml，分別吸取70 μl CRP，SAA線性標準品滴至加樣孔中，5 min后置于熒光定量分析儀檢測，重復(fù)檢測3次，并以T/C均值的對數(shù)為縱坐標，以相應(yīng)濃度的對數(shù)值為橫坐標繪制標準曲線。

1.2.4.3準確度 向陰性樣本中加入已知濃度的CRP和SAA室內(nèi)質(zhì)控品(濃度均為150、50、10 μg/ml)，采用本方法制備的SAA、CRP聯(lián)合檢測免疫層析試紙條檢測，分別計算其回收率(回收率=測定濃度/預(yù)測濃度×100%)。

1.2.4.4交叉反應(yīng) 取濃度分別為50、100 μg/ml僅含SAA抗原的樣品各70 μl加入樣品孔中，5 min后檢測T1、T2、C線熒光強度；同樣將僅含有CRP抗原，濃度分別為50、100 μg/ml的溶液滴加到該檢測卡的加樣孔中，5 min后檢測。

1.3方法學(xué)比對 采用本方法制備的SAA、CRP聯(lián)合檢測免疫層析試紙條與西門子BN ProSpec?特定蛋白分析系統(tǒng)(散射比濁法)同時檢測80份臨床血清標本，并對SAA、CRP定量檢測結(jié)果進行比對分析。

2 結(jié)果

2.1最佳標記蛋白量與包被蛋白量的確定 結(jié)果如表1所示,采用5 μl熒光微球標記時，抗SAA Ⅰ標記量為20 μg,抗SAA Ⅱ包被濃度為2 mg/ml時,試紙條的線性范圍最寬,R2最大,分別為0.78～200 μg/ml，R2=0.985。抗CRPⅠ標記量為20 μg,抗CRP Ⅱ 包被濃度為1.5 mg/ml時,試紙條的線性范圍最寬,R2最大,分別為0.78～200 μg/ml,R2=0.996。

2.2分析性能評價

2.2.1標準曲線的建立 SAA線性質(zhì)控品檢測結(jié)果如圖2，測得SAA在0.78～200 μg/ml范圍內(nèi)線性較好，y=0.644 5x+1.641 5，R2=0.995 8；CRP線性質(zhì)控品檢測結(jié)果如圖3，測得CRP在0.78～200 μg/ml范圍內(nèi)線性較好，y=0.725 9x+1.259 4，R2=0.996 4。SAA、CRP最低檢測限分別為0.35 μg/ml、0.42 μg/ml。

2.2.2精密性 隨機抽取3個不同批次的 SAA、CRP聯(lián)合檢測免疫層析試紙條，分別對濃度為 5、10、50 μg/ml的樣本進行精密性檢測。SAA批內(nèi)精密性依次為9.59%、7.13%、4.49%，批間精密性依次為9.44%、6.92%、5.76%；CRP批內(nèi)精密性依次為9.59%、7.13%、4.49%，批間精密性依次為9.44%、6.92%、5.76%。本方法制備的試紙條其批間和批內(nèi)變異系數(shù)均小于15%，符合精密性要求。

表1 最佳標記蛋白量與包被蛋白量結(jié)果

Tab.1 Best amount of labeling and coating

Coating(mg/ml)Labeling(μg) SAA1.01.52.0CRP1.01.52.0103.125-100 μg/ml3.125-150 μg/ml1.56-150 μg/ml3.125-100 μg/ml3.125-150 μg/ml3.125-150 μg/mlR2=0.933R2=0.928R2=0.943R2=0.949R2=0.951R2=0.939201.56-100 μg/ml0.78-150 μg/ml0.78-200 μg/ml0.78-150 μg/ml0.78-200 μg/ml0.78-200 μg/mlR2=0.961R2=0.981R2=0.995R2=0.977R2=0.996R2=0.961401.56-150 μg/ml1.56-200 μg/ml0.78-200 μg/ml1.56-200 μg/ml1.56-200 μg/ml0.78-200 μg/mlR2=0.957R2=0.965R2=0.971R2=0.963R2=0.987R2=0.955

圖2 SAA標準曲線Fig.2 Sandard curve of SAA

圖3 CRP標準曲線Fig.3 Sandard curve of CRP

Test resultSAAHigh valueMedian valueLow valueCRPHigh valueMedian valueLow valuePredicted concentration(μg/ml)15050101505010Detection concentration(μg/ml)152.5±5.050.4±2.910.3±0.7153.9±5.351.7±3.510.5±0.6Recovery rate(%)101.6100.7102.7102.6103.3104.7

圖4 SAA熒光免疫層析法與散射比濁法的相關(guān)性分析Fig.4 Correlation analysis between SAA fluorescence immunochromatography and scattering nephelometry

圖5 CRP熒光免疫層析法與散射比濁法的相關(guān)性分析Fig.5 Correlation analysis between CRP fluorescence immunochromatography and scattering nephelometry

2.2.3準確度 采用本方法制備的SAA、CRP聯(lián)合檢測免疫層析試紙條回收率檢測結(jié)果如表2所示，SAA高、中、低值回收率分別為101.6%、100.7%、102.7%；CRP高、中、低值回收率分別為102.6%、103.3%、104.7%，均符合回收率85%～115%的要求。

2.2.4交叉反應(yīng) 從實驗結(jié)果可知滴加不同濃度SAA樣品時，只有T1線和C線有熒光條帶，而T2線沒有條帶出現(xiàn)；在滴加僅含有CRP的樣品時，只有T2線和C線出現(xiàn)熒光條帶，而T1線無條帶出現(xiàn)。表明，SAA和CRP兩種抗原進行聯(lián)合檢測時沒有交叉反應(yīng)，互不干擾。

2.3方法學(xué)比對 與西門子BN ProSpec?特定蛋白分析系統(tǒng)對比分析SAA、CRP檢測結(jié)果如圖4、5。兩種方法檢測SAA的相關(guān)方程為： y=0.973 1x+2.074 5，R2=0.985 1；CRP的相關(guān)方程為： y=0.980 7x+1.008 2，R2=0.980 4。表明本方法制備的SAA、CRP聯(lián)合檢測免疫層析試紙條檢測SAA、CRP與西門子BN ProSpec?特定蛋白分析系統(tǒng)相關(guān)性較好。

3 討論

感染性疾病發(fā)病急、進展快，若早期未及時診斷治療，病情進展可能危及生命。臨床上常以CRP作為指標鑒別細菌和病毒感染，指導(dǎo)醫(yī)師有針對性應(yīng)用抗生素[7]，但多項研究表明，其單獨檢測特異性不高[8,9]。SAA是由肝臟合成的急性時相蛋白[10]，在細菌或病毒感染早期均可升高，而CRP在病毒感染時一般不增高[11]。崔海濤等[12]，潘克女等[13]研究發(fā)現(xiàn)SAA和CRP的聯(lián)合檢測相對于單獨檢測CRP對感染性疾病的早期診斷敏感性更高、特異性更好，可為早期細菌和病毒感染的鑒別診斷提供有力的證據(jù)，減少不必要的抗生素應(yīng)用。目前SAA、CRP常用的檢測方法有免疫比濁法、酶聯(lián)免疫吸附法，由于免疫比濁法需配備大型檢測設(shè)備，酶聯(lián)免疫吸附法操作繁瑣，使床旁快速檢測及社區(qū)基層醫(yī)院的推廣應(yīng)用受到限制。

本研究以鑭系稀土元素Eu3+羧基時間分辨熒光微球作為標記物，與葛宇新等[14]以CdTe量子點為標記物建立的C反應(yīng)蛋白熒光免疫層析檢測方法相比，顯著增強了熒光強度，提高了熒光穩(wěn)定性，保證了檢測結(jié)果的靈敏度和特異性。本研究采用EDC、NHS兩步法活化熒光微球，先加入EDC活化微球表面羧基，與蛋白質(zhì)或抗體形成O-?；逯虚g體后，再加入NHS溶液，進一步形成更穩(wěn)定的N-羥基琥珀酰亞胺酯，顯著提高了微球抗體偶聯(lián)物的穩(wěn)定性。此外，在課題組前期技術(shù)積累的基礎(chǔ)上，優(yōu)化了微球復(fù)溶液配方，解決了試紙條研發(fā)中普遍遇到的穩(wěn)定性差的關(guān)鍵問題。通過檢測低、中、高定值SAA、CRP樣本，進行批間、批內(nèi)精密性研究，SAA、CRP批內(nèi)、批間精密性(CV)均<15%，符合精密性要求。經(jīng)優(yōu)化SAA、CRP配對抗體標記、包被比例，使本研究建立的SAA、CRP熒光免疫層析聯(lián)合檢測試紙條檢測CRP的線性范圍可達0.78～200 μg/ml，較葛宇新等[14]建立的C反應(yīng)蛋白熒光免疫層析檢測方法(線性范圍為0.1～1 000 ng/L)寬，檢測SAA靈敏度可達0.35 μg/ml，較李啟欣等[15]建立的血清淀粉樣蛋白A免疫熒光層析法靈敏度(3 mg/L)高。通過篩選特異性優(yōu)良的SAA、CRP配對抗體，使SAA、CRP聯(lián)合檢測時彼此無交叉反應(yīng)，互不干擾，可在滿足急診需求的前提下使CRP和SAA的臨床檢驗更便捷、更精準。

本研究選用80例CRP、SAA含量從低值到高值定值血清作為樣本，使用本研究建立的聯(lián)合檢測方法與西門子BN ProSpec?特定蛋白分析系統(tǒng)(散射比濁法)同時檢測，顯示測定血清中SAA和CRP相關(guān)系數(shù)分別為0.985 1、0.980 4，兩者線性良好。同時由于時間原因，本方法存在檢測樣本量有限等問題，后期需大樣本重復(fù)驗證。綜上所述，本方法精密度、準確性、系統(tǒng)間一致性評價的結(jié)果均滿足臨床使用的要求，可作為國內(nèi)該項目聯(lián)合檢測的新一代快速檢測試劑，值得廣泛推廣和運用，同時也為其他標志物的聯(lián)合檢測提供了借鑒。