熒光染色法和KOH濕片法在頭癬診斷中的應(yīng)用

葉文正，方木平

武漢科技大學(xué)附屬孝感醫(yī)院皮膚科，湖北 孝感 432000

頭癬是由皮膚癬菌感染頭皮和毛發(fā)所引起的疾病，頭癬多累及兒童，成人較少見(jiàn)[1-2]，致病菌只見(jiàn)于毛癬菌屬和小孢子菌屬，頭癬根據(jù)致病菌種類和宿主反應(yīng)不同可以分為黃癬、白癬、黑點(diǎn)癬及膿癬[3]，對(duì)于所有侵及毛發(fā)的皮膚癬菌來(lái)說(shuō)，其入侵形式不同可分為發(fā)內(nèi)型和發(fā)外型感染[4]。準(zhǔn)確可靠的病原學(xué)檢查是診斷頭癬的重要依據(jù)[5]，有利于及時(shí)治療且減少永久性瘢痕性脫發(fā)的發(fā)生，常規(guī)的真菌鏡檢采用的是10%的KOH濕片法，但因背景雜亂，雜質(zhì)及氣泡干擾等導(dǎo)致發(fā)內(nèi)孢子及菌絲鑒別困難，且標(biāo)本溶解需要一定時(shí)間，易出現(xiàn)假陽(yáng)性和假陰性結(jié)果。本研究旨在通過(guò)對(duì)比熒光染色法、KOH濕片法檢出頭癬的陽(yáng)性率和閱片時(shí)間，比較兩種方法的檢測(cè)在頭癬診斷中的優(yōu)越性。

1 材料與方法

1.1 檢測(cè)標(biāo)本 選取2017年2月至2019年1月在武漢科技大學(xué)附屬孝感醫(yī)院皮膚科門(mén)診就診擬診頭癬患者82例，其中兒童69例，成人13例；男性45例，女性37例。取材標(biāo)本同時(shí)采用熒光染色法、KOH濕片法和真菌培養(yǎng)法進(jìn)行檢測(cè)。

1.2 試劑及檢測(cè)儀器 10%KOH(江蘇永華化學(xué)科技有限公司)溶液自配，立特晰真菌熒光染色液(安徽德萊康生物醫(yī)療科技有限公司生產(chǎn))，沙氏培養(yǎng)基(上海博微生物科技有限公司)，儀器采用奧林巴斯顯微鏡和徠卡熒光顯微鏡。

1.3 取材及染色方法

1.3.1 取材 先用75%的酒精消毒患者頭部皮疹，用鑷子拔取斷發(fā)置于載玻片上，如有鱗屑并用鈍頭刀片刮取鱗屑一起置于載玻片上，所有標(biāo)本平均分為3份。

1.3.2 KOH濕片法 隨機(jī)選取一份標(biāo)本置于載玻片上，加10%KOH溶液一滴，蓋上蓋玻片，在酒精燈火焰上方快速通過(guò)2~3次，注意不要沸騰，然后輕壓蓋玻片，用吸水紙吸去多余的溶液，置奧林巴斯顯微鏡下觀察并拍照。

1.3.3 熒光染色法 隨機(jī)選取第二份標(biāo)本滴加一滴熒光染色液，蓋上蓋玻片，輕壓，用吸水紙吸去多余的染色液，置徠卡熒光顯微鏡下觀察，并采集圖像。

1.3.4 真菌培養(yǎng) 將第三份標(biāo)本接種在沙堡培養(yǎng)基上，置26℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)1~2周，觀察菌落形態(tài)特征以及生化反應(yīng)，鑒定菌種。

1.4 觀察指標(biāo) 對(duì)比熒光染色法和KOH濕片法鏡下觀測(cè)效果，分別比較其檢出陽(yáng)性率以及平均閱片時(shí)間，并以培養(yǎng)為參考標(biāo)準(zhǔn)比較兩種方法的靈敏度和特異度。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS16.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差s)表示，兩樣本均數(shù)比較采用配對(duì)設(shè)計(jì)t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料使用χ2檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 鏡下觀察 熒光染色后發(fā)內(nèi)鏈狀孢子清晰可見(jiàn)，在低倍顯微鏡下即顯示出明亮的藍(lán)色輪廓(圖1A)，KOH濕片法則視野昏暗，背景雜亂且對(duì)比度低，在和熒光顯微鏡相同的倍數(shù)下無(wú)法有效辨別發(fā)內(nèi)孢子(圖1B)；在高倍視野下發(fā)內(nèi)鏈狀孢子顯示出更加清晰的熒光輪廓，菌體清晰可辨(圖1C)，在相同高倍顯微鏡下，KOH濕片法孢子則呈現(xiàn)無(wú)色透明或者淡綠色折光，和背景反差小，與雜質(zhì)、氣泡等不易分辨(圖1D)。

圖1 低倍和高倍顯微鏡下發(fā)內(nèi)孢子分別在熒光染色和KOH濕片法中的特點(diǎn)

2.2 兩種方法檢測(cè)頭癬陽(yáng)性率、靈敏度和特異度比較 熒光染色法和KOH濕片法檢測(cè)陽(yáng)性率分別為80.49%(66例)、63.41%(52例)，熒光染色法陽(yáng)性率高于KOH濕片法，陽(yáng)性率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=5.92，P<0.05)。82例頭癬患者中，培養(yǎng)陽(yáng)性61例，其中犬小孢子菌38例、紫色毛癬菌10例、須癬毛癬菌5例、斷發(fā)毛癬菌4例、紅色毛癬菌2例、石膏樣小孢子菌2例，培養(yǎng)陽(yáng)性的61例患者中，熒光染色法陽(yáng)性55例，陰性6例(9.84%)；KOH濕片法陽(yáng)性44例，陰性17例(27.87%)，兩種檢測(cè)方法漏診率比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=6.48，P<0.05)；熒光染色靈敏度90.16%，特異度47.62%，KOH濕片法靈敏度72.13%，特異度61.90%，見(jiàn)表1。

2.3 兩種檢測(cè)方法和閱片時(shí)間比較 熒光染色法和KOH濕片法閱片時(shí)間分別為(69.61±9.28)s、(88.76±7.79)s，熒光染色法閱片時(shí)間低于KOH濕片法，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=-14.13，P<0.05)。

表1 擬診頭癬患者培養(yǎng)結(jié)果及熒光染色法和KOH濕片法檢測(cè)結(jié)果(例)

3 討論

頭癬是指累及頭發(fā)和頭皮的真菌感染，直接鏡檢是檢查淺部真菌形態(tài)學(xué)的最基本方法，其中KOH濕片法是臨床上直接鏡檢最早和最廣泛的方法[6]，該方法不需要特殊儀器，操作簡(jiǎn)單且方便快捷，但缺點(diǎn)是檢測(cè)視野背景雜亂，對(duì)比度低，特別是在頭癬診斷中，由于部分孢子及菌絲寄生在發(fā)內(nèi)，常規(guī)KOH濕片法難以短時(shí)間溶解毛發(fā)，顯露發(fā)內(nèi)菌絲及孢子，此外，在制片過(guò)程中，產(chǎn)生的小氣泡、脂滴和纖維絲等也存在明顯干擾，導(dǎo)致檢出率偏低或造成假陽(yáng)性和假陰性結(jié)果[7]。熒光染色液是一種高純度熒光素和和特定比例的KOH混合溶液，熒光素標(biāo)記下的幾丁質(zhì)重組酶能和真菌細(xì)胞壁中的幾丁質(zhì)以及纖維素特異性結(jié)合，形成強(qiáng)熒光復(fù)合物，在暗視野顯微鏡下，染色后真菌結(jié)構(gòu)發(fā)出亮綠色熒光，和背景反差較大，使菌體的分布位置和數(shù)量清晰可見(jiàn)。該方法操作簡(jiǎn)易，僅需一滴染色液，數(shù)秒鐘即可完成，操作過(guò)程和KOH濕片法一致，但無(wú)需加熱，耗時(shí)短且省時(shí)省力，結(jié)果直觀明了，特別是對(duì)于發(fā)內(nèi)外的真菌感染診斷，能夠迅速區(qū)分氣泡、脂滴、纖維絲以及菌絲和孢子，短時(shí)間內(nèi)做出確切可靠的診斷，指導(dǎo)臨床及時(shí)用藥，防止誤診漏診，造成永久性脫發(fā)以及危害患者身心健康[8-10]。

通過(guò)對(duì)比熒光染色法和KOH濕片法檢測(cè)門(mén)診擬診為頭癬患者的斷發(fā)和鱗屑的陽(yáng)性率，熒光染色法陽(yáng)性率和敏感度均高于KOH濕片法，閱片時(shí)間低于KOH濕片法，熒光染色漏診率亦低于KOH濕片法，在擬診頭癬的82例患者中，培養(yǎng)陰性例數(shù)為21例，在此21例培養(yǎng)陰性患者中，KOH濕片法檢測(cè)陰性13例，檢測(cè)陽(yáng)性8例，熒光染色法檢測(cè)出11例陽(yáng)性患者，陽(yáng)性檢測(cè)率高于KOH濕片法，顯示出熒光檢測(cè)的優(yōu)勢(shì)。對(duì)于較少真菌數(shù)量的標(biāo)本，或者普通KOH濕片法不易發(fā)現(xiàn)發(fā)內(nèi)較少的菌絲和孢子的樣本，熒光染色法也能夠做出快速有效且可靠的診斷，因此，熒光染色法陽(yáng)性檢出率和靈敏度均高于真菌培養(yǎng)和KOH濕片法，閱片時(shí)間也低于KOH濕片法，而且在培養(yǎng)陰性的患者中檢出陽(yáng)性率也高于KOH濕片法，因此熒光染色法在頭癬診斷中有著明顯的優(yōu)勢(shì)。余菁等[11]通過(guò)門(mén)診收集擬診為手足癬、體股癬和甲真菌病患者總計(jì)600例以及馬拉色菌感染的102例患者，通過(guò)熒光染色法和KOH濕片法進(jìn)行比較，得出熒光染色法相比于KOH濕片法可以提高檢出陽(yáng)性率，減少漏診，縮短閱片時(shí)間，岳學(xué)蘋(píng)等[12]通過(guò)運(yùn)用熒光染色法和KOH濕片法對(duì)100例擬診甲真菌病患者進(jìn)行檢測(cè)比較，結(jié)果顯示熒光染色法較KOH濕片法方便、快速、準(zhǔn)確，徐艷等[13]也通過(guò)熒光染色法和KOH濕片法對(duì)105例疑診為淺表真菌感染的患者皮損標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示熒光染色法較KOH濕片法結(jié)果更快速、準(zhǔn)確，可用于淺部真菌感染的快速診斷。本次研究同樣顯示在頭癬診斷中，相比于KOH濕片法和真菌培養(yǎng)，熒光染色法有更高的陽(yáng)性檢出率以及較高靈敏度，減少漏診和閱片時(shí)間，有較高的應(yīng)用價(jià)值。

綜上所述，在頭癬患者直接鏡檢中，熒光染色法檢查陽(yáng)性率和閱片時(shí)間均優(yōu)于KOH濕片法，特別是對(duì)于菌量少、雜質(zhì)多且制片質(zhì)量較低的標(biāo)本，熒光染色法更為快捷、簡(jiǎn)便、高效以及有較高的檢出率和靈敏度，有較好的檢測(cè)優(yōu)勢(shì)，對(duì)于初學(xué)者易于掌握，值得臨床廣泛應(yīng)用。