吡喃糖氧化酶法檢測血清1,5-脫水葡萄糖醇的方法學性能評價

陳穎，李莎，索明環(huán)，王偉佳

中山大學附屬中山醫(yī)院檢驗醫(yī)學中心，廣東 中山 528403

1,5-脫水葡萄糖醇又稱1,5-脫水-D-山梨醇(1,5-anhydroglucitol，1,5-AG)，是自然界存在的多元醇，可反映檢測前1~2周內的平均血糖水平。機體在高糖狀態(tài)下，葡萄糖會競爭性地抑制1,5-AG在腎小管的重吸收，從而使血清1,5-AG的含量顯著降低[1-2]。近年來，1,5-AG反映餐后高血糖和短期血糖波動的優(yōu)勢受到廣泛的關注[3-4]。1,5-AG可作為糖尿病患者診斷和預測常見并發(fā)癥的必要補充，其準確測定有著重要意義。本研究參考CLSIEP文件和相關文獻[5-8]，評價吡喃糖氧化酶法檢測血清1,5-AG的主要分析性能，使其更好地應用于臨床，現(xiàn)將結果報道如下：

1 材料與方法

1.1 實驗樣本 選取2019年4~6月來自廣東省中山大學附屬中山醫(yī)院就診人員樣本，無溶血、乳糜、黃疸等干擾物；其中生物參考區(qū)間驗證樣本，男性10例，年齡20~62歲；女性10例，年齡19~62歲，均無任何疾病史。

1.2 試劑與儀器 1,5-AG測定試劑盒、校準品及質控品均由北京九強生物技術股份有限公司提供。儀器為德國西門子ADVIA2400生化分析儀。

1.3 方法

1.3.1 精密度實驗 參考EP5-A2文件進行確認。批內精密度：選取低值、高值新鮮血清1,5-AG樣本，重復檢測20次。批間精密度：選取低值、高值質控品，分成5份，每天測4次，連續(xù)測5 d，分別計算其平均值()、標準偏差(SD)和變異系數(shù)(CV)。

1.3.2 正確度驗證 測定另一個批號1,5-AG校準品低值(7.0μg/mL)和高值(25μg/mL)三次，計算測定均值與配套校準品標示值的相對偏倚。

1.3.3 抗干擾實驗 參考EP7-A2文件進行確認，選擇低高值1,5-AG新鮮血清樣品作為基礎樣本。干擾物試劑盒和空白對照由北京九強公司提供，以添加不同濃度干擾物之后的血清1,5-AG測定均值超過同一濃度下空白對照管的±5%為產生干擾作用。

1.3.4 分析測量范圍(AMR)實驗 即線性范圍，參考EP6-A文件，分別收集血清1,5-AG濃度接近廠家聲明的分析測量范圍下限和上限的低值樣本(L)和高值樣本(H)，將L和H樣本按：7L、6L+1H、5L+2H、4L+3H、3L+4H、2L+5H、1L+6H、7H混合，配置成1,5-AG系列濃度血清，每個濃度重復測量兩次，在一個分析批次內完成。

1.3.5 臨床可報告范圍(CRR)實驗 選擇分析范圍內高濃度標本3份，配套稀釋液做2、4、8、16、32倍稀釋，計算稀釋回收率，確定可靠測量低限及最大稀釋倍數(shù)，以回收率(100±10)%為可接受范圍；CRR上限=AMR上限×最大稀釋倍數(shù)。

1.3.6 生物參考區(qū)間驗證 參考C28-A2文件，對20個參考個體測定血清1,5-AG濃度，與廠家給定的參考區(qū)間比較(>14μg/mL)。

1.4 統(tǒng)計學方法 所有資料應用Microsoft Excel 2003及SPSS16.0軟件進行統(tǒng)計學分析。精密度、正確度和抗干擾分析采用x-、SD和CV表示；分析測量和臨床可報告范圍的評價應用多項式回歸分析；生物參考區(qū)間驗證應用“1/3”規(guī)則進行離群值檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 精密度 吡喃糖氧化酶法檢測血清1,5-AG的批內精密度為1.58和0.76%，批間精密度為3.37%和1.22%，見表1。

2.2 正確度 另一個批號校準品測定均值分別是7.1μg/mL和25.32μg/mL，與配套校準品標示值相對偏倚分別為1.42%和1.27%。

2.3 抗干擾評價 低值和高值血清1,5-AG濃度基礎樣本重復10次測定，均值為7.1μg/mL和25.2μg/mL。當TG≤500 mg/dL、Bil≤50 mg/dL、Hb≤20 mg/dL、VitC≤50 mg/dL時，吡喃糖氧化酶法檢測血清1,5-AG基本無干擾，見表2。

表2 吡喃糖氧化酶法檢測血清1,5-AG干擾評價結果

2.4 AMR評價 8個系類濃度血清1,5-AG樣本的重復測量結果的均值分別為49.82μg/mL、42.99μg/mL、35.99μg/mL、28.86μg/mL、21.71μg/mL、14.75μg/mL、7.23μg/mL、0.16μg/mL，重復測量誤差變異系數(shù)<2.0%，小于設定的允許誤差目標5%。以理論值為X軸，測定均值為Y軸，進行多項式回歸分析，結果見表3。二次多項回歸式中非線性系數(shù)b2(-3.391)具有顯著性，三次回歸中的非線性系數(shù)b2(0.090)、b3(-0.660)均不具顯著性，二次多項式有較小的回歸標準誤，所以最合適多項式為二次，最佳擬合方程為二元一次多項式，則認為存在線性關系。本項目在0.16~49.82μg/mL的線性范圍內，為臨床可接受線性范圍。

表3 吡喃糖氧化酶法檢測血清1,5-AG多項式回歸分析結果

2.5 CRR評價 標本經(jīng)2~32倍稀釋后，確定樣本最大稀釋倍數(shù)是32倍及確定稀釋后的可靠低限是0.35μg/mL?；厥章示湓?0%~110%的最大稀釋倍數(shù)值，故其可報告的臨床范圍為0.35~1 594.24μg/mL，可以滿足臨床的需求，見表4。

表4 吡喃糖氧化酶法檢測血清1,5-AG稀釋回收率測定結果

2.6 生物參考區(qū)間驗證 20名健康個體血清1,5-AG濃度除了一個檢測值(12.68μg/mL)低于商家提供的參考區(qū)間外，其余均在廠家提供的參考區(qū)間內。

3 討論

血清1,5-AG作為一個新的糖尿病診斷指標，其刷查糖尿病的臨床價值初露端倪，適于臨床推廣。1,5-AG測定方法有很多種，如質譜分析法、高效液相色譜法、微柱層析法等，這些方法雖然較靈敏，但是操作繁瑣、費時、設備要求高。吡喃糖氧化酶法檢測血清1,5-AG可在生化分析儀上實現(xiàn)全自動化操作，微量簡單快速，符合臨床檢測的要求[4，9]。實驗室在使用新的儀器設備或檢測方法時，應對其方法學主要性能參數(shù)進行初步評估。結合本實驗室具體實際，本研究評價國內常用生化分析儀德國西門子ADVIA2400采用吡喃糖氧化酶法檢測血清1,5-AG的主要分析性能。

本研究參照EP5-A2文件，驗證廠商聲明的精密度性能。結果顯示批內和批間的精密度均低于廠商的聲明和基于生物學變異的精密度質量規(guī)范，說明吡喃糖氧化酶法檢測血清1,5-AG重復性好、結果穩(wěn)定，能夠滿足臨床檢測的要求。正確度驗證采用北京九強公司提供另一個批號校準物，其校準物具有可靠的溯源性，結果顯示相對偏倚分別為1.42%和1.27%，均小于基于生物學變異設定質量規(guī)范中的允許誤差，正確度性能得到驗證，說明吡喃糖氧化酶法檢測血清1,5-AG正確度高可滿足質量要求?？垢蓴_評估顯示吡喃糖氧化酶法檢測血清1,5-AG具有良好的抗脂血、黃疸和溶血等干擾能力。AMR驗證對數(shù)據(jù)進行多項式回歸分析，則認為血清1,5-AG濃度在0.16~49.82μg/mL范圍內存在線性關系，該范圍在廠家提供的范圍內并且涵蓋了臨床醫(yī)學決定水平。CRR范圍為0.35~1 594.24μg/mL，最大稀釋倍數(shù)為32倍，能夠滿足臨床的要求。廠家提供的參考區(qū)間得到驗證，說明該范圍有效，適合本實驗室所在地區(qū)。

綜上所述，吡喃糖氧化酶法檢測血清1,5-AG的各項性能均符合臨床檢測要求。目前1,5-AG在國內外未有標準參考方法和參考物質可供選擇，其檢測方法的標準化和質量評價沒有建立統(tǒng)一的標準，各生產廠商試劑盒的檢測標準各異，實驗室間的結果差異仍將存在。1,5-AG的檢測仍有其局限性和諸多方面需要更多的研究。1,5-AG作為近年來開始在臨床逐步推廣應用的新項目，本室將繼續(xù)參考相關評價文件進行后續(xù)方法學和臨床應用的研究，為實現(xiàn)1,5-AG標準化和一致性提供必要的基礎。