谷氨酰胺對灌服大豆分離蛋白仔豬肝臟和肌肉抗氧化功能的影響

■彭 夢 王惠云 李誠誠 趙 迪 王 蕾 吳 濤 丁斌鷹 易 丹

（動(dòng)物營養(yǎng)與飼料科學(xué)湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 武漢輕工大學(xué)動(dòng)物科學(xué)與營養(yǎng)工程學(xué)院，湖北武漢430023）

蛋白質(zhì)是動(dòng)物飼料的重要組成部分，高質(zhì)量的飼料蛋白質(zhì)會促進(jìn)動(dòng)物機(jī)體的生長和健康[1]。動(dòng)物性蛋白是最常見的高蛋白質(zhì)來源之一，但考慮到飼養(yǎng)成本，在飼料過程中通常都是添加植物性蛋白質(zhì)（如大豆蛋白）。大豆分離蛋白（Soy Protein Isolate，SPI）具有氨基酸種類有近20 種，并含有人體必需氨基酸。其營養(yǎng)豐富，不含膽固醇，是植物蛋白中為數(shù)不多的可替代動(dòng)物蛋白的品種之一[2]，是一種組分復(fù)雜、蛋白質(zhì)含量不低于90%的大豆蛋白混合物[3]。大豆分離蛋白中含有許多大豆抗原蛋白，大豆抗原蛋白是指大豆及其制品中可引起人畜禽產(chǎn)生過敏反應(yīng)的一些大分子蛋白質(zhì)或糖蛋白[4]，會影響營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收，容易引起人和幼齡動(dòng)物的大豆過敏反應(yīng)，造成不良的生理反應(yīng)[5]。大量的研究表明，大豆抗原蛋白會導(dǎo)致仔豬產(chǎn)生過敏反應(yīng)[6]，使仔豬腸道形態(tài)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變[7]、產(chǎn)生腹瀉[8]、生長受阻[9]等負(fù)面影響。而大豆抗原蛋白對仔豬抗氧化以及肝臟形態(tài)結(jié)構(gòu)方面的研究資料較少。功能性氨基酸如谷氨酰胺（glutamine，Gln）是體內(nèi)含量最豐富的游離氨基酸，它不僅是組織間氮運(yùn)輸載體、核苷酸和其它氨基酸合成前體[10]，還是快速分化細(xì)胞的主要能源物質(zhì)[11]。而早期斷奶仔豬遭受來自各方面的應(yīng)激且喪失母源Gln時(shí)，由于其體內(nèi)尚不能合成足夠的Gln 供機(jī)體需要，組織結(jié)構(gòu)和功能會發(fā)生變化。而外源添加Gln 可緩解腸組織結(jié)構(gòu)變化[12]。動(dòng)物試驗(yàn)表明，Gln 能通過增加谷胱甘肽的生物合成及其在肝臟的貯存來保護(hù)肝臟功能[13]。本試驗(yàn)旨在探究營養(yǎng)素Gln 對灌服大豆分離蛋白仔豬抗氧化功能以及肝臟形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響，為谷氨酰胺在早期斷奶仔豬生產(chǎn)中的應(yīng)用提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

谷氨酰胺（Gln）：購自Sigma公司，貨號G3126；L-丙氨酸（L-Alanine，Ala）：購自MACKLIN（麥克林）公司，貨號A6198；酪蛋白（Casein）：購自Sigma 公司，貨號C7078；大豆分離蛋白（SPI）：購自MACKLIN（麥克林）公司，貨號S832685。

1.2 試驗(yàn)動(dòng)物與試驗(yàn)設(shè)計(jì)

24頭7日齡仔豬隨機(jī)分為3個(gè)組：對照組、SPI 組和SPI+Gln組。每個(gè)組8個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)1頭豬。試驗(yàn)1～5 d，所有仔豬飼喂人工乳。試驗(yàn)第6～7 d，對照組灌服7.8 g/kg BW酪蛋白，其它2組均灌服10 g/kg BW大豆分離蛋白（粗蛋白含量為78%），灌服2 d。試驗(yàn)第8～10 d，SPI+Gln 組灌服250 mg/kg BW 的Gln，Gln劑量根據(jù)研究文獻(xiàn)Wang 等[14]確定。對照組和SPI 組仔豬均灌服305 mg/kg BW 的丙氨酸，以保證各組等氮平衡。

1.3 基礎(chǔ)日糧

試驗(yàn)基礎(chǔ)日糧為人工乳，購自武漢安佑飼料有限公司。

1.4 飼養(yǎng)管理

飼養(yǎng)期間需保持良好的通風(fēng)環(huán)境，室溫維持在28～30 ℃；各豬欄舍配備保溫?zé)艉筒讳P鋼料盤；每天早晚各清掃并消毒豬舍一次。每天在8:00、12:00、15:00、18:00與21:00按照溫白開水∶奶粉=4∶1的比例沖泡人工乳，水溫控制在45～55 ℃，并于8:00、12:00與21:00增喂一次水。

1.5 樣品采集

試驗(yàn)豬屠宰后迅速取出肝臟，去除膽囊，在肝臟中切取0.5 cm3的組織塊，用冷生理鹽水沖洗肝臟2～3 次，放入40%的多聚甲醛溶液中固定。經(jīng)石蠟包埋、蘇木素-伊紅（H.E）染色后制成肝臟病理切片。此外，將肝臟組織、腓腸肌、背最長肌剪成小塊包于錫箔紙中置于液氮中速凍，后轉(zhuǎn)入-80 ℃冰箱中保存待測。

1.6 檢測指標(biāo)與方法

使用南京建成生物工程研究所試劑盒檢測肝臟、腓腸肌和背最長肌等組織的抗氧化能力與氧化產(chǎn)物相關(guān)指標(biāo)，包括：過氧化氫酶（Catalase，CAT）、超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（Glutathione peroxidase，GSH-Px）、過氧化氫（Hydrogen peroxide，H2O2）和 丙 二 醛（Malondialdehyde，MDA）。具體操作步驟按照試劑盒說明書進(jìn)行。利用HPIAS-1000高清晰度彩色病理圖文分析系統(tǒng)觀察肝細(xì)胞密度和規(guī)則程度等形態(tài)特征。

1.7 統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”（Mean±SEM）表示。試驗(yàn)各組間的差異采用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 17.0 中的Duncan's 法進(jìn)行多重比較。當(dāng)P＜0.05 時(shí)認(rèn)為各組間差異顯著。

2 結(jié)果

2.1 Gln對灌服SPI仔豬肝臟組織形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響

圖1 Gln對灌服SPI仔豬肝臟組織形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響

如圖1 所示，對照組肝細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)正常，大小一致，肝細(xì)胞以中央靜脈為軸心呈放射狀排列呈索狀，肝細(xì)胞界限清楚，核圓而大；而SPI 組肝細(xì)胞細(xì)胞形態(tài)失常，排列錯(cuò)亂，出現(xiàn)大面積的細(xì)胞空泡化，脂肪變性，部分細(xì)胞細(xì)胞核變形、溶解；與SPI組相比，SPI+Gln組肝細(xì)胞空泡化程度減輕，細(xì)胞大小一致，形態(tài)結(jié)構(gòu)正常，界限清晰，肝細(xì)胞排列正常。

2.2 Gln對灌服SPI仔豬肝臟抗氧化能力的影響

表1 Gln對灌服SPI仔豬肝臟抗氧化能力的影響

表1可見，與對照組相比，SPI組顯著降低了仔豬肝臟H2O2含量（P＜0.05），但顯著升高了仔豬肝臟MDA的含量（P＜0.05）。與SPI組相比，SPI+Gln顯著降低了仔豬肝臟MDA 含量（P＜0.05），并顯著提高了GSH-Px的活性（P＜0.05）。

2.3 Gln對灌服SPI仔豬腓腸肌抗氧化能力的影響

表2 Gln對灌服SPI仔豬腓腸肌抗氧化能力的影響

表2可見，與對照組相比，灌服SPI顯著升高了仔豬腓腸肌H2O2含量（P＜0.05），顯著降低了腓腸肌CAT和GSH-Px 活性（P＜0.05）。SPI+Gln 可緩解SPI 仔豬腓腸肌H2O2含量的上升（P＜0.05）。

2.4 Gln對灌服SPI仔豬背最長肌抗氧化能力的影響

與對照組相比，灌服SPI 顯著升高了仔豬背最長肌MDA含量（P＜0.05），顯著降低了仔豬背最長肌CAT與GSH-Px 活性（P＜0.05）。與SPI 組相比，SPI+Gln 組顯著升高了仔豬背最長肌MDA 含量，降低了仔豬背最長肌T-SOD活性（P＜0.05），結(jié)果如表3。

表3 Gln對灌服SPI仔豬背最長肌抗氧化能力的影響

3 討論

3.1 Gln對灌服SPI仔豬肝臟組織形態(tài)結(jié)構(gòu)和抗氧化功能的影響

大豆分離蛋白中含有的大豆抗原蛋白會導(dǎo)致新生仔豬發(fā)生一些不良的生理反應(yīng)[6-9]。Gln在機(jī)體的許多組織中都能被合成，但在劇烈運(yùn)動(dòng)、創(chuàng)傷、感染等應(yīng)激和高分解狀態(tài)下，Gln 的代謝發(fā)生改變[15]，肝臟對Gln 的攝取顯著增加，并由Gln 釋放器官變成消耗器官，此時(shí)補(bǔ)充Gln 對機(jī)體具有重要的保護(hù)作用[16]。肝臟是脂肪代謝的重要器官，它對脂肪的攝取，氧化，脂肪酸的代謝，膽固醇的生成，磷脂和脂蛋白的合成及脂蛋白的分泌均起著中樞性作用[17]，在整個(gè)機(jī)體中起著至關(guān)重要的作用。Ascencio等[18]發(fā)現(xiàn)大豆蛋白可能通過改變血液胰島素水平，進(jìn)而降低了肝臟內(nèi)轉(zhuǎn)泌調(diào)控因子SREBP（sterol-regulatory element binding protein，固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白）的表達(dá)，從而導(dǎo)致肝臟內(nèi)脂肪的合成降低。Takamatsu 等[19]應(yīng)用基因芯片技術(shù)檢測了攝食大豆蛋白日糧對大鼠肝臟基因表達(dá)譜的影響，發(fā)現(xiàn)與酪蛋白相比，大豆蛋白改變了約33%的定量基因的表達(dá)，其中與脂質(zhì)代謝有關(guān)的基因集顯著變化。于健春等[13]的研究表明，Gln 能夠通過增加谷胱甘肽的生物合成及其在肝臟的貯存來保護(hù)肝臟功能。本試驗(yàn)仔豬肝臟病理切片顯示，SPI 導(dǎo)致肝細(xì)胞出現(xiàn)嚴(yán)重的細(xì)胞空泡化，脂肪變性，且部分細(xì)胞細(xì)胞核變形、溶解，而Gln 的添加緩解了肝細(xì)胞空泡化程度，使細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)和肝細(xì)胞索排列趨于正常。表明大豆分離蛋白使仔豬肝臟受到損傷，可能與大豆分離蛋白組仔豬肝臟脂質(zhì)代謝出現(xiàn)異常有關(guān)，而補(bǔ)充谷氨酰胺能夠改善機(jī)體代謝異常的情況[16]，在一定程度上緩解仔豬因大豆分離蛋白處理而導(dǎo)致的肝臟損傷。

肝臟是氧化應(yīng)激的易發(fā)器官，張相倫[20]的研究表明氧化大豆抑制肉雞肝臟和腸道抗氧化酶系統(tǒng)的發(fā)育，吳秋萍等[21]研究發(fā)現(xiàn)大豆蛋白小鼠肝臟自由基水平升高，組織抗氧化酶活力顯著下降，MDA大量積累，使小鼠進(jìn)入氧化應(yīng)激狀態(tài)。Gonzales等[22]的研究表明Gln可能通過清除體內(nèi)的氧自由基，減輕肝臟解毒負(fù)擔(dān)，從而保護(hù)肝細(xì)胞并提高機(jī)體抗氧化能力。王偉強(qiáng)[23]的研究表明，在CCl4誘導(dǎo)大鼠急性肝損傷的模型中，補(bǔ)充Gln可以增加肝細(xì)胞線粒體中GSH的合成，維持肝組織及血漿中GSH的濃度，從而保護(hù)肝臟并提高機(jī)體抗氧化的能力。MDA是重要的脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物之一，測定MDA的含量常能反映機(jī)體的脂質(zhì)過氧化水平，間接反映細(xì)胞受損傷的程度[24]。本試驗(yàn)條件下，大豆分離蛋白使仔豬肝臟MDA活性顯著上升，破壞了氧化還原狀態(tài)的平衡。谷氨酰胺的添加使仔豬肝臟MDA含量下降與GSH-Px活性增強(qiáng)，谷氨酰胺可能通過提高抗氧化相關(guān)酶活性和降低氧化產(chǎn)物的含量來增強(qiáng)仔豬的抗氧化能力，進(jìn)而緩解SPI仔豬肝臟抗氧化功能的降低。這也可能是Gln改善SPI仔豬肝臟細(xì)胞形態(tài)的一種作用機(jī)制。

3.2 Gln 對灌服SPI 仔豬腓腸肌、背最長肌抗氧化功能的影響

大豆作為主要植物蛋白質(zhì)飼料，其所含的大豆蛋白易引發(fā)仔豬腹瀉、生長受阻等負(fù)面影響[6-9]。另外有研究表明，大豆蛋白會導(dǎo)致小鼠血液及消化器官自由基顯著增加、組織抗氧化能力降低[21]。氧化還原反應(yīng)是機(jī)體最重要的生理活動(dòng)之一，氧化與抗氧化系統(tǒng)的失衡會導(dǎo)致機(jī)體各方面的功能出現(xiàn)異常。正常情況下，機(jī)體的氧化和抗氧化系統(tǒng)存在動(dòng)態(tài)平衡，SOD、GSH-Px和CAT能通過清除超氧陰離子，維持機(jī)體氧化和抗氧化系統(tǒng)平衡，從而保護(hù)組織細(xì)胞免受損傷[25-26]。而早期斷奶仔豬由于營養(yǎng)、環(huán)境、心理等的不適應(yīng)，容易發(fā)生應(yīng)激進(jìn)而產(chǎn)生大量的自由基，而過量自由基生成MDA 等脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物及新的自由基，并可進(jìn)一步通過鏈?zhǔn)椒磻?yīng)放大損害作用，引起細(xì)胞代謝功能障礙和死亡[27]。本試驗(yàn)條件下，大豆分離蛋白使仔豬腓腸肌H2O2含量、背最長肌MDA含量顯著升高，且使仔豬腓腸肌和背最長肌CAT 與GSH-Px 酶活性顯著降低。說明大豆分離蛋白破壞力機(jī)體氧化與抗氧化系統(tǒng)的平衡，使得仔豬腓腸肌、背最長肌抗氧化能力降低。添加谷氨酰胺使仔豬腓腸肌H2O2含量下降，在一定程度上緩解了大豆分離蛋白對腓腸肌造成的氧化損傷。

4 結(jié)論

大豆分離蛋白誘導(dǎo)仔豬肝臟組織形態(tài)異常并降低肝臟和肌肉的抗氧化能力。而谷氨酰胺可有效緩解大豆分離蛋白仔豬肝細(xì)胞損傷，并提高仔豬肝臟與腓腸肌的抗氧化能力。