利用EST-SSR標(biāo)記評(píng)價(jià)羽扇豆屬(Lupinus L.)遺傳多樣性

張紅巖 楊 濤 劉 榮 晉 芳 張力科 于海天胡錦國(guó) 楊 峰王 棟 何玉華,* 宗緒曉,*

利用EST-SSR標(biāo)記評(píng)價(jià)羽扇豆屬(L.)遺傳多樣性

張紅巖1,5,**楊 濤1,**劉 榮1,**晉 芳2張力科2于海天3胡錦國(guó)4楊 峰3王 棟1何玉華3,*宗緒曉1,*

1中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所/ 國(guó)家農(nóng)作物基因資源與基因改良重大科學(xué)工程, 北京 100081;2全國(guó)農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣服務(wù)中心, 北京 100125;3云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院糧食作物研究所, 云南昆明 650205;4USDA-ARS Western Regional Plant Introduction Station (WRPIS), Pullman, WA 99164, USA;5青海大學(xué), 青海西寧 810016

利用基于窄葉羽扇豆轉(zhuǎn)錄組開(kāi)發(fā)并篩選出的95對(duì)多態(tài)性EST-SSR標(biāo)記, 對(duì)羽扇豆屬的22個(gè)種133份資源進(jìn)行全基因組掃描, 初步探究羽扇豆屬下種間的進(jìn)化關(guān)系, 分析來(lái)源于“舊世界”羽扇豆種間的遺傳多樣性, 為羽扇豆優(yōu)異資源的挖掘和創(chuàng)新利用提供理論依據(jù)。結(jié)果表明, 用95對(duì)SSR標(biāo)記共檢測(cè)出1318個(gè)等位變異, 每對(duì)標(biāo)記平均檢測(cè)出3~37個(gè)等位變異, 平均為13.87個(gè); 多態(tài)性信息量(PIC)變化范圍0.39~0.91, 平均為0.75; 基因多樣性變化范圍0.41~0.92, 平均為0.78?；卩徑臃?NJ)的系統(tǒng)發(fā)育初步探究了羽扇豆種間的進(jìn)化關(guān)系, 22個(gè)羽扇豆種分別來(lái)源于“舊世界”和“新世界”, 與之前研究結(jié)果相對(duì)一致。聚類分析、群體結(jié)構(gòu)分析和主成分分析結(jié)果均表明, 來(lái)源于“舊世界”的7個(gè)羽扇豆種被劃分為4個(gè)組群, 各組群所包含的參試資源沒(méi)有種間交叉重疊。

EST-SSR; 羽扇豆屬; 轉(zhuǎn)錄組; 遺傳多樣性

羽扇豆(lupin或lupine), 俗稱“魯冰花”, 是一種富含蛋白, 能夠固定大氣游離氮、有效吸收土壤磷, 且具重要觀賞價(jià)值的豆科植物。羽扇豆擁有悠久的栽培歷史, 但尚未在中國(guó)發(fā)現(xiàn)原始栽培種。羽扇豆屬是一個(gè)相對(duì)較大的屬, 世界上約有300個(gè)種[1], 包括一年生和多年生種, 廣泛分布于世界各地, 大部分來(lái)自“新世界”(New World, 簡(jiǎn)稱NW), 只有13個(gè)種(L.、L.、var.Boiss. & Sprun.、L.、L. subsp.Desv.、Gladst.、Guss.、Forsk.、Boiss. & Reuter.、L.、Guss.、Boiss.、Murr.)來(lái)自歐洲、北非和東非[2]。遺傳相似性研究表明, 羽扇豆多樣性中心可分為: (1)美洲北部和中部, 安第斯美洲南部; (2)美洲南部(大西洋); (3)地中海沿岸地區(qū)及北非和東非地區(qū)[3]。由于喹啉類生物堿和抗?fàn)I養(yǎng)化合物的存在, 大多數(shù)野生羽扇豆都具有苦味和毒性。目前, 栽培種羽扇豆均為一年生, 包括來(lái)源于“舊世界” (Old World, 簡(jiǎn)稱OW)的窄葉羽扇豆(2= 40,L.)、白羽扇豆(2= 50,Forsk.)、沙質(zhì)平原羽扇豆(2= 32,Guss.)、黃羽扇豆(2= 52,L.)等羽扇豆以及來(lái)源于“新世界”的南美羽扇豆(2= 48,Sweet.)。

在以往的研究中, 大多利用形態(tài)和農(nóng)藝性狀[4]、同工酶[5]、核糖體RNA ITS1和ITS2[6-7]、葉綠體基因[8]以及AFLP、ISSR、RAPD、DART和SSR[9-11]分析羽扇豆屬(genus)的系統(tǒng)發(fā)育和遺傳多樣性。Drummond等[12]利用5個(gè)核基因、2個(gè)葉綠體基因和4個(gè)葉綠體非編碼區(qū)完成了羽扇豆屬的系統(tǒng)發(fā)育和遺傳多樣性分析。Nevado等[13]利用RNA-seq技術(shù)分析了來(lái)源于新世界的55個(gè)羽扇豆種中的67份材料, 結(jié)果表明, 蛋白質(zhì)序列和基因表達(dá)水平的不同是造成羽扇豆屬具有豐富遺傳多樣性的重要原因。

SSR (simple sequence repeats)是一種以特異引物PCR為基礎(chǔ)的分子標(biāo)記, 具有共顯性、多態(tài)性高、分布廣泛、重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn), 目前已廣泛應(yīng)用于主要農(nóng)作物的分子遺傳學(xué)研究, 然而尚未見(jiàn)規(guī)模性開(kāi)發(fā)EST-SSR引物并用于羽扇豆屬下種間遺傳多樣性和親緣關(guān)系分析的報(bào)道。本研究利用基于窄葉羽扇豆(L.)轉(zhuǎn)錄組開(kāi)發(fā)篩選得到的95對(duì)多態(tài)性EST-SSR標(biāo)記, 初步分析了羽扇豆屬(genus)的系統(tǒng)發(fā)育; 深入研究了來(lái)源于“舊世界”羽扇豆屬內(nèi)主要栽培種以及其他類型種質(zhì)資源的群體結(jié)構(gòu)、遺傳變異及遺傳進(jìn)化關(guān)系, 剖析了種間的遺傳關(guān)系, 以期為今后羽扇豆種質(zhì)資源的搜集與利用、主要種的系統(tǒng)學(xué)研究以及挖掘優(yōu)良品種等提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 植物材料

供試羽扇豆材料133份, 22個(gè)種, 分布于六大洲, 其中7個(gè)種(77份材料)來(lái)源于“舊世界”。參試材料均來(lái)源于美國(guó)西部地區(qū)植物引種站(Western Regional Plant Introduction Station, Pullman, WA)(附表1), 2017年種植于云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院試驗(yàn)場(chǎng)(25°12′N, 102°77′E), 常規(guī)大田管理。

利用DIVA-GIS[14](http://diva-gis.org/)繪制供試材料原始來(lái)源地(圖1)。

1.2 DNA提取

大田播種后40 d, 選擇每份參試材料生長(zhǎng)良好的5個(gè)單株, 取幼嫩葉片混合, 利用改良CTAB法[15-16]提取DNA, 提取緩沖液中加入一定量的水溶性PVP和β-羥基乙醇, 可以有效防止酚類物質(zhì)的氧化作用。用1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)其質(zhì)量, NanoDrop 2000檢測(cè)DNA濃度, 根據(jù)檢測(cè)結(jié)果將其稀釋到工作液濃度50 ng μL-1后于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 SSR開(kāi)發(fā)及多態(tài)性標(biāo)記篩選

基于窄葉羽扇豆轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)(http://www.lupin------ express.org/node/16), 利用SSR Locator software[17]檢測(cè)SSR位點(diǎn), 隨機(jī)設(shè)計(jì)800對(duì)EST-SSR引物。SSR引物設(shè)計(jì)參數(shù)為, 兩核苷酸至少重復(fù)4次, 三核苷酸至少重復(fù)3次, 引物長(zhǎng)度18~22 bp, GC含量40%~55%, 引物退火溫度55~65℃, 擴(kuò)增片段長(zhǎng)度100~400 bp。

從22個(gè)羽扇豆種中隨機(jī)各選一份材料(附表1), 利用8%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳共篩選出95對(duì)多態(tài)性SSR標(biāo)記(附表2)。委托北京梓熙生物科技有限公司合成SSR引物及熒光檢測(cè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。

1.4 PCR擴(kuò)增反應(yīng)及產(chǎn)物檢測(cè)

擴(kuò)增反應(yīng)總體積為10 μL, 包含1.5 μL基因組DNA (50 ng μL-1)、5 μL 2×PCR Master Mix (Genstar, 北京, 中國(guó))、0.5 μL正向引物(2 μmol L-1)[5￠端標(biāo)記熒光素FAM (藍(lán)色)或Hex (綠色)]、0.5 μL反向引物(2 μmol L-1)和2.5 μL ddH2O。PCR 40 s, 程序?yàn)?5℃預(yù)變性5 min; 95℃變性35 s, 54℃退火72℃延伸45 s, 34個(gè)循環(huán); 72℃延伸5 min, 10℃保溫7 min。將FAM (藍(lán)色)和HEX (綠色)熒光標(biāo)記的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用超純水稀釋10~30倍, 分別取等體積的上述2種稀釋液混合形成混合液, 吸取1 μL混合液, 分別加0.1 μL LIZ500分子量?jī)?nèi)標(biāo)和8.9 μL去離子甲酰胺于DNA分析儀專用深孔板孔中; 然后將其在PCR儀上95℃變性5 min, 取出后立即置碎冰上, 冷卻15 min左右; 瞬時(shí)離心10 s, 在ABI3700 DNA遺傳分析儀上檢測(cè)。

圖1 基于不同地理來(lái)源的羽扇豆資源分布圖

1.5 數(shù)據(jù)分析

1.5.1 數(shù)據(jù)收集和標(biāo)記定位 利用DNA Collection和Gene Mapper軟件收集和分析原始數(shù)據(jù), 建立相應(yīng)數(shù)值數(shù)據(jù)庫(kù)。在統(tǒng)計(jì)和收集數(shù)據(jù)時(shí), 若在某個(gè)種的所有材料中均不存在某個(gè)位點(diǎn)的任何等位基因,則表明該羽扇豆種不存在相應(yīng)的SSR位點(diǎn), 則記錄為“9999”。通過(guò)BLAST比對(duì)獲得95對(duì)多態(tài)性EST-SSR標(biāo)記在窄葉羽扇豆(L.)染色體上的詳細(xì)位置(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/ genome/11024)。

利用MapInspect (http://mapinspect.software. informer.com/)繪制標(biāo)記在染色體上的位置(圖2)。

1.5.2 標(biāo)記多態(tài)性及羽扇豆系統(tǒng)發(fā)育分析 采用PowerMarker 3.25軟件[18]計(jì)算基于133份羽扇豆材料(附表1)的各引物對(duì)的等位基因數(shù)(No. of allele)、基因多樣性(gene diversity)和多態(tài)性信息量(polymorphism information content, 簡(jiǎn)稱PIC)(表1)。從133份羽扇豆材料中隨機(jī)選取93份資源(附表1)用于初步分析羽扇豆屬系統(tǒng)發(fā)育, 若某個(gè)種內(nèi)材料份數(shù)很少, 則分析該種的全部材料; 若某個(gè)種內(nèi)材料份數(shù)較多, 則隨機(jī)選取幾份?；?2個(gè)羽扇豆種的93份材料的等位基因頻率和遺傳距離, 利用鄰接法(Neighbor-Joining)構(gòu)建羽扇豆屬的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)(bootstrap設(shè)為1000), 用MEGA v5[19]繪制樹(shù)圖。

1.5.3 77份羽扇豆資源的遺傳多樣性分析 羽扇豆栽培種主要來(lái)源于“舊世界”, 為了探究羽扇豆栽培種的群體結(jié)構(gòu)、遺傳變異及遺傳進(jìn)化關(guān)系, 本研究選取來(lái)源于“舊世界”的7個(gè)羽扇豆種(包括4個(gè)主要栽培種和其他3個(gè)非栽培種)的77份(附表1)資源, 剖析參試種間的遺傳關(guān)系, 為今后主要栽培種的遺傳多樣性研究以及挖掘優(yōu)良品種等提供理論依據(jù)。利用PopGen version 1.32軟件[20]計(jì)算7個(gè)羽扇豆種的Nei’s遺傳一致度和遺傳距離, 采用MEGA v5, 基于UPGMA (Unweighted Pair Group Method with Arithmetic Means)繪制聚類圖。用Power Marker v3.25計(jì)算77份資源間的Nei’s遺傳距離, FigTree v1.4.3 (http://tree.bio.ed.ac.uk/software/figTree/)繪制基于鄰接法(Neighbor-Joining)的樹(shù)形圖。利用Structure 2.2軟件[21]進(jìn)行群體遺傳結(jié)構(gòu)分析, Burnin Period和after Burnin各為10,000,值為1~10, 每個(gè)值各運(yùn)行15次, 利用在線軟件Structure Harvester確定最佳組群數(shù)()。通過(guò)GenALEX V6.5[22]進(jìn)行羽扇豆種間分子方差分析(AMOVA)、遺傳分化系數(shù)(st)和主成分分析(PCA)。

圖2 95對(duì)EST-SSR標(biāo)記在窄葉羽扇豆染色體上分布情況

表1 95多態(tài)性標(biāo)記遺傳參數(shù)

(續(xù)表1)

PIC表示多態(tài)性信息量。PIC means polymorphism information content.

2 結(jié)果與分析

2.1 SSR標(biāo)記多態(tài)性分析

篩選出95對(duì)擴(kuò)增穩(wěn)定、多態(tài)性較好的EST-SSR標(biāo)記, 它們分布在20條染色體上, 每條染色體平均4.75個(gè)標(biāo)記(圖2)。NLL-09標(biāo)記數(shù)最多(9), 其次是NLL-01和NLL-12, 均有8個(gè)標(biāo)記, NLL-20標(biāo)記數(shù)最少(1)。133份羽扇豆資源在95個(gè)SSR位點(diǎn)共檢測(cè)出1318個(gè)等位變異, 平均每對(duì)引物5~37個(gè)等位變異, 平均為13.87個(gè)。PIC指數(shù)在0.39~0.91之間, 平均值為0.75; 基因多樣性在0.41~0.92之間, 平均值為0.78。其中, lup-est 3649獲得的等位基因數(shù)目最多(37), PIC值為0.91, 基因多樣性為0.90; 其次是lup-est 6567(31)和lup-est 2531(30), PIC值分別為0.91和0.89, 基因多樣性分別為0.91和0.88; 等位基因數(shù)目最少的是lup-est 3576(5), PIC值為0.66, 基因多樣性為0.71 (表1)。上述結(jié)果表明, 本研究所用的EST-SSR標(biāo)記滿足遺傳多樣性分析的基本要求。

2.2 羽扇豆屬系統(tǒng)發(fā)育分析

系統(tǒng)發(fā)育(bootstrap = 1000)關(guān)系表明, 22個(gè)羽扇豆種大致分為兩類, 一類來(lái)源于“舊世界”, 包括; 另一類來(lái)源于“新世界”(NW), 包括。除外, 其他種的分類結(jié)果與前人研究結(jié)論一致[2,12](圖3)。

2.3 77份羽扇豆資源聚類分析

利用PopGen version 1.32軟件計(jì)算來(lái)源于舊世界的7個(gè)羽扇豆種間的遺傳距離和遺傳一致度, MEGA v5繪制物種聚類圖。

基于UPGMA聚類方法, 7個(gè)羽扇豆種在遺傳距離值為0.720時(shí)被明顯劃分為4個(gè)組群(圖4), 組群I ()含; 組群II ()含; 組群III ()含、和; 組群IV ()含和。由表2可知, 7個(gè)羽扇豆種間平均遺傳距離為0.411~1.845, 遺傳一致度為0.158~0.633。其中和間的遺傳距離最大(1.845), 遺傳一致度最低(0.158);和間的遺傳距離最小(0.411), 遺傳一致度最高(0.663)。

基于遺傳一致度分析來(lái)源于舊世界的4個(gè)栽培種之間親緣關(guān)系表明, 白羽扇豆()和黃羽扇豆()(0.263)>黃羽扇豆()和窄葉羽扇豆()(0.254)>窄葉羽扇豆()和白羽扇豆()(0.244)>白羽扇豆()和沙質(zhì)平原羽扇豆()(0.199)>黃羽扇豆()和沙質(zhì)平原羽扇豆()(0.167)>窄葉羽扇豆()和沙質(zhì)平原羽扇豆()(0.158)?；卩徑臃?Neighbor-Joining), 77份羽扇豆資源同樣被明顯地劃分為4個(gè)組群(圖5-d), 與基于種子類型劃分的組群完全一致。

2.4 77份羽扇豆資源群體結(jié)構(gòu)分析

為了探討參試個(gè)體間的群體結(jié)構(gòu)關(guān)系, 利用Structure軟件分析77份羽扇豆種質(zhì)資源的遺傳結(jié)構(gòu), 因后驗(yàn)概率值(ln())隨亞群數(shù)的增大而增大, 故采用基于D的最大似然估計(jì)確定最適組群數(shù)()(圖5-a)。當(dāng)某個(gè)材料的Q值大于0.75時(shí), 將該材料劃分到相應(yīng)的組群, 此時(shí)該材料的血緣關(guān)系相對(duì)單一。77份參試材料在= 4時(shí),D出現(xiàn)峰值(圖5-b), 即參試材料可被劃分為4個(gè)組群(圖5-c)。進(jìn)一步分析群體結(jié)構(gòu)的各組群成分, 表明各組群所包含的羽扇豆種類與聚類結(jié)果完全一致。白羽扇豆、黃羽扇豆、窄葉羽扇豆、沙質(zhì)平原羽扇豆分屬4個(gè)不同的群組, 表明4個(gè)栽培種之間有明顯的種間隔離。

2.5 77份羽扇豆資源主成分分析(PCA)

為了更好地反映羽扇豆資源間的遺傳關(guān)系, 利用GenALEX軟件對(duì)77份羽扇豆種質(zhì)資源進(jìn)行主成分分析, 根據(jù)第一、第二維主成分繪制出二維主成分結(jié)構(gòu)圖(圖5-e), 前三位特征向量PC1 (38.93%)、PC2 (26.10%)和PC3 (17.48%)占遺傳變異的82.51%。PC1~PC2二維主成分結(jié)構(gòu)圖顯示, 77份材料被明顯地劃分為4個(gè)組群, 4個(gè)組群之間具有明顯的分界, 沒(méi)有重疊部分。這一結(jié)果與聚類分析和群體結(jié)構(gòu)分析結(jié)果完全一致, 進(jìn)一步說(shuō)明了組群分類結(jié)論的可靠性。

2.6 77份羽扇豆資源分子方差分析(AMOVA)

為了全面、準(zhǔn)確地評(píng)價(jià)7個(gè)羽扇豆種間與種內(nèi)的遺傳變異, 利用GenALEX軟件對(duì)77份參試材料進(jìn)行分子方差(AMOVA)和遺傳分化(st)分析。7個(gè)羽扇豆種在可信度= 0.01條件下, 羽扇豆種間和種內(nèi)的遺傳變異分別占總變異的80.00%和20.00% (表3), 羽扇豆種間存在明顯的遺傳結(jié)構(gòu), 種間遺傳變異是總遺傳變異的主要來(lái)源。

羽扇豆種間的遺傳分化系數(shù)(st)在0.320~ 0.743之間, 存在較大差異, 說(shuō)明羽扇豆種群的遺傳分化較大。由表4可知,和遺傳分化程度最大(0.743);和遺傳分化程度最小(0.320)。上述結(jié)果與基于遺傳距離得到聚類結(jié)果(圖4)一致性較高, 說(shuō)明羽扇豆屬的遺傳變異主要由種間遺傳差異引起。

圖4 基于7個(gè)羽扇豆不同種間(“舊世界”)的UPGMA 聚類圖

表2 7個(gè)羽扇豆種間(“舊世界”)的Nei’s (1978)遺傳距離和遺傳一致度

對(duì)角線以上表示遺傳一致度; 對(duì)角線以下表示遺傳距離。

The genetic identity is shown above diagonal and genetic distance below diagonal.

圖5 77份羽扇豆資源(“舊世界”)遺傳多樣性分析

(a)基于ln()平均值, 繪制散點(diǎn)圖; (b)基于ln (D)值, 繪制散點(diǎn)圖; (c)當(dāng)= 4時(shí), 77份羽扇豆資源遺傳結(jié)構(gòu); (d)基于Nei’s遺傳距離, 77份羽扇豆資源NJ樹(shù); (e) 77份羽扇豆資源主成分分析。

(a) the scatter plot of mean ln() from 1 to 10; (b) ln (D) values plotted from 1 to 10; (c) structure of the 77 accessions based on Structure software when= 4; (d) NJ tree of the 77 accessions based on Nei’s genetic distances; (e) principal component analysis of the 77 accessions based on 95 EST-SSR markers.

表3 7個(gè)羽扇豆種之間的分子方差分析

Est. Var. 表示具體變異數(shù)值; %表示各項(xiàng)變異占總變異的比例;-value表示可信度。

Est. Var. means estimates of variance components; % means percentage of total variance contributed by each component;-value means probability value.

表4 7個(gè)羽扇豆種間遺傳分化分析

3 討論

3.1 羽扇豆屬分類

羽扇豆屬是一個(gè)相對(duì)較大而多樣的屬, 一年生或多年生, 主要為草本植物, 少數(shù)由柔軟的灌木和小喬木組成, 適應(yīng)廣泛的生態(tài)地理?xiàng)l件, 世界上約有300個(gè)種。核糖體DNA內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)ITS1和ITS2序列在羽扇豆屬內(nèi)趨于保守, 受到的選擇壓力較小, 常用于該屬較低分類研究?；趓DNA 基因間隔序列(ITS)的研究[23], 羽扇豆屬是一個(gè)單獨(dú)的屬, 不同種間染色體數(shù)目(2= 24到52不等)差異很大?；诜N子球蛋白模式、蛋白質(zhì)血清學(xué)、原位雜交技術(shù)和基于葉綠體的基因研究[8,24], 羽扇豆屬被劃分為“新世界” (“New World”)羽扇豆和“舊世界”(Old World)羽扇豆。除依據(jù)地理來(lái)源(“新世界”-“舊世界”)劃分外, 還可以根據(jù)葉的特征將羽扇豆分離開(kāi)來(lái), 一種具有單葉特征(約26個(gè)種), 另一種具有典型的掌狀葉。通過(guò)類黃酮、同工酶、種子球蛋白模式、細(xì)胞學(xué)、外殼結(jié)構(gòu)比較等研究, 羽扇豆屬可被劃分為粗糙種子類型和光滑種子類型, 其中“舊世界”主要以光滑種子類型為主, 包括4種類型、、和[25]。本研究通過(guò)95對(duì)SSR標(biāo)記對(duì)羽扇豆屬內(nèi)22個(gè)種系統(tǒng)發(fā)育分析表明, 19個(gè)羽扇豆種分別被劃分到舊世界種群和新世界種群; 另外3個(gè)種()未歸屬到新世界種群, 分析原因可能是本研究選擇的羽扇豆種較少或者沒(méi)有選擇外源群, 但整體結(jié)果與前人研究結(jié)論相對(duì)一致。

開(kāi)展全面、系統(tǒng)的羽扇豆屬分類和起源進(jìn)化的研究, 利用基因組、轉(zhuǎn)錄組、葉綠體基因組, 結(jié)合形態(tài)學(xué)數(shù)據(jù)以及抽取具有更廣泛遺傳基礎(chǔ)的材料, 對(duì)我們深入理解羽扇豆屬的系統(tǒng)發(fā)育重建和進(jìn)化史具有重要意義。

3.2 舊世界羽扇豆種間遺傳多樣性分析

種質(zhì)資源遺傳多樣性研究是作物遺傳改良的重要理論基礎(chǔ)。舊世界羽扇豆主要分布在地中海區(qū)域、非洲北部和東北部地區(qū), 均為一年生草本植物, 表現(xiàn)為自花授粉, 該地理生態(tài)區(qū)已成功馴化的栽培種包括白羽扇豆、黃羽扇豆、窄葉羽扇豆和沙質(zhì)平原羽扇豆。栽培種作為人類和動(dòng)物重要的植物蛋白質(zhì)來(lái)源和土壤氮肥供給者, 其果實(shí)和種子一般都很大, 生物產(chǎn)量較高, 葉子為掌狀葉。依據(jù)種皮紋理特征可將舊世界羽扇豆分為光滑種子類型和粗糙種子類型2個(gè)類群[26]。光滑種子類型包括、、和[25], 主要分布在地中海周圍區(qū)域, 染色體數(shù)目從2= 40到52不等; 粗糙種子類型僅有, 主要分布在北非和地中海地區(qū)的東部, 染色體數(shù)目從2= 32到42不等?；贗TS序列分析, 可將沙質(zhì)平原羽扇豆()與和區(qū)分開(kāi), 但與后者關(guān)系更為密切[6]。細(xì)胞學(xué)研究表明,與遺傳關(guān)系最近, 與有一定程度的親緣關(guān)系[27-28]。與和的DNA含量非常相似[29], 表明三者遺傳關(guān)系較為親近。Talhinas等[30]利用多種分子標(biāo)記研究了s和-之間的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系, 表明s與后兩者存在明顯生殖隔離。?wi?cicki等[31]培育出和可育種間后代, 說(shuō)明和親緣關(guān)系較近。

本研究基于95對(duì)SSR標(biāo)記對(duì)來(lái)源于舊世界的7個(gè)羽扇豆種進(jìn)行遺傳多樣性分析, 聚類分析、群體結(jié)構(gòu)分析、主成分分析均得到一致的結(jié)論, 即7個(gè)羽扇豆種的77份材料歸屬為4個(gè)組群(、、和), 與前人研究結(jié)果完全一致。

4 結(jié)論

22個(gè)羽扇豆種分別來(lái)源于舊世界和新世界。來(lái)源于舊世界的7個(gè)羽扇豆種被劃分為4個(gè)組群(、、和), 各組群所包含的參試資源沒(méi)有種間交叉重疊。本研究為羽扇豆優(yōu)異資源的挖掘和創(chuàng)新利用提供理論依據(jù)。

附表 請(qǐng)見(jiàn)網(wǎng)絡(luò)版: 1) 本刊網(wǎng)站http://zwxb.chinacrops. org/; 2) 中國(guó)知網(wǎng)http://www.cnki.net/; 3) 萬(wàn)方數(shù)據(jù)http://c.wanfangdata.com.cn/Periodical-zuowxb.aspx。

[1] 鄭卓杰. 中國(guó)食用豆類學(xué). 北京: 中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社, 1997. pp 352–353. Zheng Z J. Food Legumes in China. Beijing: China Agriculture Press, 1997. pp 352–353 (in Chinese).

[2] Eastwood R J, Drummond C S, Schifino-Wittmann M T, Hughes C E. Diversity and evolutionary history of lupins-insights from new phylogenies. In: Palta J A, Berger J B, eds. Proceedings of the 12th international lupin conference. Western Australia: Fremantle, 2008. pp 346–354.

[3] Wolko B, Clements J C, Naganowska B, Nelson M N, Yang H A.. In: Kole C, eds. Wild crop relatives: genomic and breeding resources, legume crops and forages. Berlin: Springer-Verlag, 2011. pp 153–206.

[4] Gladstones J S. Lupins as crop plants., 1970, 23: 123–148.

[5] Wolko B, Weeden N F. Isozyme number as an indicator of phylogeny in., 1990, 31: 179–187.

[6] A?nouche A, Bayer R J. Phylogenetic relationships in(Fabaceae: Papilionoideae) based on internal transcribed spacer sequences (ITS) of nuclear ribosomal DNA., 1999, 86: 590–607.

[7] A?nouche A, Bayer R J, Misset M T. Molecular phylogeny, diversification and character evolution in(Fabaceae) with special attention to Mediterranean and African lupines., 2004, 246: 211–222.

[8] K?ss E, Wink M. Molecular phylogeny and phylogeography of(Leguminosae) inferred from nucleotide sequences of the rbcL gene and ITS1 + 2 regions of rDNA.,1997, 208: 139–167.

[9] Talhinhas P, Neves-Martins J, Leitao J. AFLP, ISSR and RAPD markers reveal high levels of genetic diversity amongspp., 2010, 122: 507–510.

[10] Sbabou L, Brhada F, Alami I T, Maltouf A F. Genetic diversity of Moroccangermplasm investigated using ISSR and AFLP markers., 2010, 12: 26–32.

[11] Atnaf M, Yao N, Martina K, Dagne K, Wegary D, Tesfaye K. Molecular genetic diversity and population structure of Ethiopian white lupin landraces: Implications for breeding and conservation., 2017, 12: e0188696.

[12] Drummond C S, Eastwood R J, Hughes M C E. Multiple continental radiations and correlates of diversification in(Leguminosae): testing for key innovation with incomplete taxon sampling., 2012, 61: 443–460.

[13] Nevado B, Atchison G W, Hughes C E, Filatov D A. Widespread adaptive evolution during repeated evolutionary radiations in New World lupins., 2016, 7: 12384.

[14] Arenascastro S, Fernándezhaeger J, Jordanobarbudo D. A method for tree-ring analysis using Diva-Gis freeware on scanned core images., 2015, 71: 118–129.

[15] Doyle J J, Doyle J L. A rapid total DNA preparation procedure for fresh plant tissue., 1990, 12: 13–15.

[16] Verhoeven K J F, Jansen J J, Biere D A. Stress-induced DNA methylation changes and their heritability in asexual dandelions., 2010, 185: 1108–1118.

[17] da Maia L C, Palmieri D A, de Souza V Q, Kopp M M, de Carvalho F I F, de Oliveira A C. SSR locator: tool for simple sequence repeat discovery integrated with primer design and PCR simulation., 2008, 2008: 412696.

[18] Liu K, Muse S V. PowerMarker: an integrated analysis environment for genetic marker analysis., 2005, 21: 2128–2129.

[19] Tamura K, Peterson D, Peterson N, Stecher G, Nei M, Kumar S. MEGA5: molecular evolutionary genetics analysis using maximum likelihood, evolutionary distance, and maximum parsimony methods., 2011, 28: 2731–2739.

[20] Yeh F C, Boyle T J. Population genetic analysis of co-dominant and dominant markers and quantitative traits., 1997, 129: 157.

[21] Falush D, Stephens M, Pritchard J K. Inference of population structure using multilocus genotype data: linked loci and correlated allele frequencies., 2003, 164: 1567–1587.

[22] Peakall R, Smouse P E. GenAlEx 6.5: genetic analysis in Excel. Population genetic software for teaching and research: an update., 2012, 28: 2537–2539.

[23] Mahé F, Markova D, Pasquet R, Misset M-T, A?nouche A. Isolation, phylogeny and evolution of thegene in the legume genusL., 2011, 60: 49–61.

[24] Cristofolini G. A serological contribution to the systematics of the genus(Fabaceae)., 1989, 166: 265–278.

[25] Gladstones J S. Present situation and potential of Mediterranean/African lupins for crop rotation. In: Proceedings of the 3rd international lupin conference. La Rochelle, France, 1984. pp 18–37.

[26] Gladstones J S. Lupins of the Mediterranean region and Africa. South Perth, Australia: Tech Bull, 1974. pp 1–48.

[27] Gupta S, Buirchell B J, Cowling W A. Interspecific reproductive barriers and genomic similarity among the rough-seededspecies., 1996, 115: 123–127.

[28] Gladstones J S. Distribution, origin, taxonomy, history and importance. In: Gladstones J S, Atkins C, Hamblin J, eds. Lupins as Crop Plants: Biology, Production and Utilization. Wallingford, United Kingdom: CAB International, 1998. pp 1–39.

[29] Ghrabi G Z, Puech S, Zouaghi M. Flow cytometry DNA assay of Mediterranean lupins., 1999, 54: 45–56.

[30] Talhinas P, Sreenivasprased S, Neves-Martins J, Oliveira H. Genetic and morphological characterization ofcausing anthracnose of lupins.,2003, 92: 986–996.

[31] ?wi?cickii W K, ?wi?cicki W, Nijaki T.: an interspecific hybrid of Old World lupins., 1999, 68: 217–220.

Assessment of genetic diversity by using EST-SSR markers in

ZHANG Hong-Yan1,5,**, YANG Tao1,**, LIU Rong1,**, JIN Fang2, ZHANG Li-Ke2, YU Hai-Tian3, HU Jin-Guo4, YANG Feng3, WANG Dong1, HE Yu-Hua3,*, and ZONG Xu-Xiao1,*

1Institute of Crop Sciences, Chinese Academy of Agricultural Sciences / The National Key Facility for Crop Gene Resources and Genetic Improvement, Beijing 100081, China;2National Agro-Tech Extension & Service Centre, Beijing 100125, China;3Institute of Food Crops, Yunnan Academy of Agricultural Sciences, Kunming 650205, Yunnan, China;4USDA-ARS Western Regional Plant Introduction Station (WRPIS), Pullman, WA 99164, USA;5Qinghai University, Xining 810016, Qinghai, China

In order to explore the evolutionary relationship ofpreliminarily as well as to excavate and utilize lupin resources from the “Old World” effectively, the genetic diversity among the species undergenus was analyzed. Ninety-five polymorphic pairs of EST-SSR markers developed based on the transcriptome of narrow-leaved lupin (L.) were used to scan 133 lupin accessions from 22 species. A total of 1318 alleles were detected with 13.87 alleles per locus on average, ranging from 3 to 37 alleles; the polymorphism information content (PIC) ranged from 0.39 to 0.91 with the mean value of 0.63; the genetic diversity ranged from 0.41 to 0.92 with the mean value of 0.78. This study showed evolutionary relations among the 22 species undergenus from the “Old World” and the “New World” based on Neighbor-Joining (NJ) method, which is consistent with previous studies. Moreover, seventy-seven lupin accessions of sevenspecies from the “Old World” were divided into 4 groups; there was no overlap of accession from different species contained in each identified group, detected by all the three analysis methods like population structure, cluster analysis based on UPGMA and principal component analysis (PCA).

EST-SSR;genus; transcriptome; genetic diversity

2019-05-21;

2019-09-26;

2019-11-11.

10.3724/SP.J.1006.2020.94077

宗緒曉, E-mail: zongxuxiao@caas.cn; 何玉華, E-mail: trbio@163.com

**同等貢獻(xiàn)(Contributed equally to this work)

張紅巖, E-mail: 1006248823@qq.com; 楊濤, E-mail: yangtao02@caas.cn; 劉榮, E-mail: liurong@caas.cn

本研究由國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目(2017YFE0105100), 農(nóng)作物種質(zhì)資源保護(hù)與利用專項(xiàng)(2019NWB036-07), 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院科技創(chuàng)新工程項(xiàng)目和中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所中央級(jí)公益性科研院所基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)(S2018XC04)資助。

This study was supported by the National Key Research and Development Program of China (2017YFE0105100), the Crop Germplasm Resources Protection (2019NWB036-07), the Agricultural Science and Technology Innovation Program (ASTIP) in CAAS, and the Fundamental Research Funds for Central Non-Profit of Institute of Crop Sciences, CAAS.

URL: http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20191108.1915.002.htm