miR-577通過介導(dǎo)Notch信號(hào)通路抑制肺癌細(xì)胞的增殖、侵襲和耐藥性

華濤 許家玲

肺癌(Lung cancer)是一種侵襲性和異質(zhì)性的疾病。目前，男性肺癌發(fā)病率和死亡率在所有惡性腫瘤均占第一位[1]。肺癌的病因至今尚不完全明確。隨著醫(yī)學(xué)技術(shù)的進(jìn)展，臨床上關(guān)于肺癌的治療有了一定的進(jìn)步，但5年生存率依然很低[2]。目前，對(duì)于肺癌的治療手段多數(shù)以手術(shù)為主藥物為輔，但治療效果仍不容樂觀。

MicroRNA(miRNA)是一類由內(nèi)源基因編碼的長(zhǎng)度約為22個(gè)核苷酸的非編碼單鏈RNA分子，它們通過與靶基因特異性結(jié)合，參與轉(zhuǎn)錄后基因的表達(dá)調(diào)控[3]。據(jù)報(bào)道，miR-577在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤、食管鱗癌和結(jié)直腸癌等多種腫瘤中的表達(dá)量均顯著下調(diào)，因此被認(rèn)為是一種抑癌分子[4]。然而miR-577對(duì)肺癌細(xì)胞增殖、侵襲和耐藥性的作用及其作用機(jī)制目前未見報(bào)道，仍需要進(jìn)一步探究。

Notch信號(hào)通路廣泛存在于脊椎動(dòng)物和非脊椎動(dòng)物中，參與細(xì)胞的多個(gè)生物學(xué)過程，包括細(xì)胞分化、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞增殖等[5]。Notch基因編碼一種膜蛋白受體，由Notch受體、Notch配體(DSL蛋白)及細(xì)胞內(nèi)效應(yīng)器分子三部分組成[6]。目前，以Notch信號(hào)通路為靶點(diǎn)的癌癥治療策略正在研究中。

本實(shí)驗(yàn)旨在探究miR-577對(duì)肺癌細(xì)胞增殖、侵襲及耐藥性的作用及其作用機(jī)制，為臨床上對(duì)肺癌的診斷和治療提供理論依據(jù)。

資料與方法

一、材料和試劑

30對(duì)肺癌患者的癌癥組織和配對(duì)的癌旁的正常組織；人肺癌細(xì)胞A549、H520、H1975和H1299，人正常肺上皮細(xì)胞BEAS-2B(中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)，上海，中國(guó))；Notch、DSL、P-gp和MRP1一抗、HRP標(biāo)記二抗(上海酶聯(lián)生物技術(shù)有限公司，上海，中國(guó))；DMEM培養(yǎng)基和FBS(Gibco，Carlsbad，CA，USA)；RNA提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、RT-PCR試劑盒(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)；引物合成(TransGen Biotech，北京，中國(guó))；CCK-8試劑盒、蛋白定量試劑盒、細(xì)胞裂解液(上海恒遠(yuǎn)生物技術(shù)公司，上海，中國(guó))。

二、細(xì)胞培養(yǎng)

人肺癌細(xì)胞和人正常肺上皮細(xì)胞均用含有10%胎牛血清的DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液，于37 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞數(shù)量達(dá)到80%融合時(shí)，用0.25%胰酶消化處理，以1 ∶3的比例進(jìn)行傳代培養(yǎng)，后將細(xì)胞數(shù)量調(diào)整為2×108個(gè)/mL，計(jì)數(shù)后接種于對(duì)應(yīng)的培養(yǎng)板中，備后續(xù)實(shí)驗(yàn)使用。

三、細(xì)胞轉(zhuǎn)染

將人肺癌細(xì)胞A549，以1×105個(gè)/孔的密度接種于6孔培養(yǎng)板中；細(xì)胞數(shù)量約鋪滿培養(yǎng)板80%時(shí)，將培養(yǎng)基更換為無(wú)血清培養(yǎng)基，饑餓12 h；將25nM NC mimic或miR-577 mimic分別加入50μL無(wú)血清培養(yǎng)基，輕輕混勻，室溫靜置5min；取5μL混合液加入50μL無(wú)血清培養(yǎng)基，輕輕混勻，室溫靜置5 min；將上述脂質(zhì)體和NC mimic或miR-577 mimic混合均勻，靜置20min；將混合液均勻滴加到6孔板中，輕輕搖晃混勻；37 ℃培養(yǎng)4～6 h后，將無(wú)血清培養(yǎng)基更換為完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，收集細(xì)胞，用于檢測(cè)細(xì)胞數(shù)量、細(xì)胞侵襲以及耐藥蛋白的表達(dá)情況。

四、細(xì)胞增殖的測(cè)定

將A549細(xì)胞懸液以1×105個(gè)/孔的密度接種于96孔板中，于37 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h；然后，向培養(yǎng)板中加入不同濃度(5、10、20、40、80、160μg/mL)的WST-8，每個(gè)濃度設(shè)3個(gè)復(fù)孔并設(shè)空白對(duì)照，于37 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h；每孔加入20μL CCK溶液，孵育24 h；最后，酶標(biāo)儀測(cè)定450nm處的OD值；以上實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

五、細(xì)胞侵襲的測(cè)定

將待測(cè)A549細(xì)胞以1×105/孔的密度接種在6孔板中，于37 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，消化、離心細(xì)胞后，按照2.5×104個(gè)/mL用無(wú)血清培養(yǎng)基稀釋細(xì)胞，制成細(xì)胞懸液；按照每孔200 μL將細(xì)胞懸液加入transwell小室，同時(shí)在transwell下室加入10%TBS和500 μL培養(yǎng)基，于37 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；24 h后取出，吸去transwell上室中的多余液體，用PBS清洗3次，用棉棒在上室中輕輕轉(zhuǎn)動(dòng)，吸干水分并擦去膜內(nèi)側(cè)的細(xì)胞；在上室中加入結(jié)晶紫染液，5 min后回收染液，用流水緩緩沖去染液，再次用棉棒在上室中輕輕轉(zhuǎn)動(dòng)，吸干水分；在正置顯微鏡上放置一塊載玻片，將transwell小孔倒置放在上面，拍照；在100倍視野下，計(jì)數(shù)。以上實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

六、熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的A549細(xì)胞，接種于24孔培養(yǎng)板中，繼續(xù)培養(yǎng)16～24 h，待細(xì)胞匯合率達(dá)到70%～80%時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染；將NC mimic或miR-577與雙熒光素酶報(bào)告基因載體野生型或突變型共轉(zhuǎn)染入細(xì)胞。每組設(shè)3個(gè)平行孔，于37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中24 h；棄去培養(yǎng)基，用冰預(yù)冷的PBS洗2次，以除去殘余培養(yǎng)基。每孔細(xì)胞加入100 μL Passive Lysis Buffer，輕微振蕩，室溫15 min；打開ModulusTM微孔板型多功能光度計(jì)，預(yù)熱后，設(shè)置相應(yīng)參數(shù)。自動(dòng)注射器進(jìn)樣體積25 μL；注射后在讀數(shù)前的延遲時(shí)間：2 s；檢測(cè)的積分時(shí)間：10 s；取20 μL裂解產(chǎn)物加入到96孔發(fā)光檢測(cè)板中，放入發(fā)光測(cè)試儀。以上實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

七、RT-PCR

收集轉(zhuǎn)染后的各組細(xì)胞，依照RNA提取試劑盒說明書中的方法，提取待測(cè)細(xì)胞中的總RNA，并用微量分光光度計(jì)(HITACHI，Tokyo，Japan)檢測(cè)總RNA的濃度和純度(A260/A280>1.8為合格)。按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書方法進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄得到cDNA。反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)程序：45℃ 30min(反轉(zhuǎn)錄)；85℃ 15s(終止)；4℃ Forever。實(shí)時(shí)定量PCR以cDNA為模板，按照RT-PCR試劑盒說明書方法檢測(cè)mRNA的表達(dá)。反應(yīng)條件為：95℃ 15min，95℃ 30s，60℃ 90s，擴(kuò)增35個(gè)循環(huán)。引物序列如(表1)所示。溶解曲線程序：以1℃/1min的升溫速度，從55℃升溫至95℃，并終止反應(yīng)。從儀器軟件中輸出Ct值，計(jì)算相對(duì)表達(dá)量采用2-ΔΔCt方法，按照下列公式計(jì)算：ΔCt(test)=Ct target, test-Ct ref, test；ΔCt(calibrator)=Ct target, calibrator-Ct ref, calibrator；ΔΔCt=ΔCT(test) -ΔCT(calibrator)。

表1 RT-PCR引物序列

八、Western blotting

將待測(cè)細(xì)胞A549以1×105個(gè)/孔的密度接種在6孔板中培養(yǎng)24 h吸去上清液，分別轉(zhuǎn)染NC mimic或miR-577 mimic后繼續(xù)培養(yǎng)24 h，收集各組細(xì)胞，用細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞，12,000×g 4℃離心15min，收集上清。用BCA試劑盒測(cè)定提取蛋白濃度，取50μg蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳分離，將分離的蛋白電轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。在抗體孵育盒中加3mL的5%脫脂奶粉封閉液，在室溫條件下于搖床上封閉1h，TBST溶液清洗膜3次，每次10min；加入Notch和DSL的一抗(1:1000)，4℃孵育過夜，回收一抗，TBST溶液清洗膜3次，每次10min；加入HRP標(biāo)記的二抗(1:2000)，室溫孵育1h；TBST洗膜3次，每次10min。最后，取適量發(fā)光液(A和B液等體積混勻)，孵育膜3min，凝膠成像系統(tǒng)中曝光，Quantity-One軟件分析蛋白含量，以GAPDH作為內(nèi)參。

九、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

一、miR-577在肺癌組織和肺癌細(xì)胞中低表達(dá)

利用RT-PCR檢測(cè)肺癌組織和細(xì)胞以及配對(duì)的正常組織和細(xì)胞中miR-577的表達(dá)量。結(jié)果顯示，miR-577在腫瘤組織中的表達(dá)量顯著低于正常組織中的表達(dá)量(圖1-1A)(P<0.05)。類似，如圖1-1B所示，miR-577在肺癌細(xì)胞A549、H520、H1975和H1299中的表達(dá)量顯著低于正常肺上皮細(xì)胞BEAS-2B中的表達(dá)量，尤其在A549細(xì)胞中的表達(dá)差異最為顯著。因此，在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中選擇A549細(xì)胞(圖1-1B)。

圖1 miR-577在肺癌組織和細(xì)胞以及配對(duì)的正常組織和細(xì)胞中的表達(dá)量

A：miR-577在腫瘤組織和正常癌旁組織中的表達(dá)量；B：miR-577在肺癌細(xì)胞和正常肺上皮細(xì)胞BEAS-2B中的表達(dá)量。注：與正常組織和細(xì)胞比較，*P<0.05，**P<0.01

二、過表達(dá)miR-577抑制肺癌細(xì)胞的增殖、侵襲和耐藥性

肺癌細(xì)胞A549分別轉(zhuǎn)染NC mimic和miR-577 mimic，測(cè)定轉(zhuǎn)染效率、細(xì)胞數(shù)量，細(xì)胞侵襲率以及細(xì)胞耐藥性。如(圖2-4A)所示，與對(duì)照組(NC mimic)相比，轉(zhuǎn)染miR-577 mimic后，細(xì)胞中miR-577的表達(dá)量顯著提高(圖2-2A)(P<0.05)；轉(zhuǎn)染miR-577 mimic后，細(xì)胞數(shù)量相較于NC mimic組顯著減少(圖2-2B)(P<0.05)。此外，miR-577 mimic顯著降低細(xì)胞的侵襲率(圖2-2C)(P<0.05)。與對(duì)照組(NC mimic)相比，細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-577 mimic后，對(duì)5-Fu的耐受性顯著降低(圖2-2D)(P<0.05)。

圖2 過表達(dá)miR-577對(duì)肺癌細(xì)胞的增殖、侵襲和耐藥性的影響

A：RT-PCR檢測(cè)miR-577的轉(zhuǎn)染效率；B：miR-577對(duì)A549細(xì)胞增殖的影響；C：miR-577對(duì)A549細(xì)胞侵襲的影響；D：miR-577對(duì)A549細(xì)胞耐受5-Fu的影響。注：與NC mimic組比較，*P<0.05，**P<0.01

三、miR-577靶向結(jié)合Notch

如(圖2-3A)所示，利用預(yù)測(cè)軟件Starbase預(yù)測(cè)miR-577和Notch的結(jié)合序列，并構(gòu)建野生型3'UTR(WT-Notch)和突變型3'UTR(MUT-Notch)熒光素酶報(bào)告載體(圖2-3A)。熒光素酶分析進(jìn)一步證實(shí)miR-577和Notch的靶向結(jié)合。如(圖2-3B)所示，在WT-Notch組，轉(zhuǎn)染miR-577后的相對(duì)熒光素酶活性明顯高于轉(zhuǎn)染NC mimic組，但在MUT-Notch組沒有顯著差異(圖2-3B)。此外，當(dāng)細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-577 mimic后，Notch和DSL蛋白表達(dá)明顯低于NC mimic組(圖2-3C和D)(P<0.05)。

四、miR-577通過調(diào)控Notch通路抑制細(xì)胞增殖、侵襲和耐藥性

A549細(xì)胞分別轉(zhuǎn)染miR-577 mimic和NC mimic以及共轉(zhuǎn)染miR-577 mimic和pcDNA3.1-Notch，測(cè)定細(xì)胞數(shù)量，細(xì)胞侵襲率以及細(xì)胞耐藥性。結(jié)果顯示，與NC mimic組相比，A549細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-577 mimic后，細(xì)胞數(shù)量顯著減少；共轉(zhuǎn)染miR-577 mimic和pcDNA3.1-Notch則增加了細(xì)胞數(shù)量(圖2-4A)(P<0.05)。此外，轉(zhuǎn)染miR-577 mimic顯著降低了細(xì)胞侵襲率，而進(jìn)一步轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-Notch后則顯著提高了細(xì)胞侵襲率(圖2-4B)(P<0.05)。如(圖2-4C和D)所示，miR-577 mimic顯著降低了細(xì)胞對(duì)5-Fu的耐藥性并抑制了P-gp和MRP1的蛋白表達(dá)，而共轉(zhuǎn)染miR-577 mimic和pcDNA3.1-Notch后則顯著增加了細(xì)胞的耐藥性(圖2-4C和D)(P<0.05)。

圖3 雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證miR-577與Notch的結(jié)合活性

A：miR-577與Notch的結(jié)合序列；B：野生組和Notch突變后，各處理組的熒光素酶相對(duì)活性；C：Notch蛋白在NC mimic組和miR-577 mimic組的相對(duì)表達(dá)量；D：DSL蛋白在NC mimic組和miR-577 mimic組的相對(duì)表達(dá)量。注：與NC mimic組比較，*P<0.05。

圖4 miR-577通過調(diào)控Notch通路，抑制細(xì)胞增殖、侵襲和耐藥性

A：miR-577和Notch對(duì)細(xì)胞增殖的影響；B：miR-577和Notch對(duì)細(xì)胞侵襲的影響；C：miR-577和Notch對(duì)細(xì)胞耐受5-Fu的影響；D：miR-577和Notch對(duì)P-gp、MRP1的蛋白表達(dá)量的影響。注：與對(duì)照組比較，*P<0.05，與miR-577 mimic組比較，#P<0.05。

討 論

肺癌是發(fā)病率和死亡率增長(zhǎng)最快，對(duì)人群健康和生命威脅最大的惡性腫瘤之一，在男性中的發(fā)病率和死亡率均位居第一位[7]。目前，臨床上治療肺癌的主要手段是手術(shù)和化療并輔以藥物治療，然而，近年來隨著抗癌藥物的不斷開發(fā)和對(duì)藥物的大量且不合理使用，使肺癌細(xì)胞不斷獲得對(duì)藥物的抵抗能力，許多肺癌患者均表現(xiàn)出化療的無(wú)效性[8]。因此，有必要尋找一種新的有效的治療肺癌的方法。

miRNA是一類非編碼小分子RNA，其在基因的表達(dá)調(diào)控中起著非常重要的作用，因此，是近年來的研究熱點(diǎn)[9]。據(jù)報(bào)道，miRNA的異常表達(dá)可能會(huì)促進(jìn)或抑制腫瘤的發(fā)生發(fā)展，即有些miRNA表現(xiàn)出促癌作用，如miR-155、miR-21以及miR-146a等，而有些miRNA則表現(xiàn)出抑癌作用，如miR-192-5p，miR-129-5p，miR-577等[10]。miR-577作為多種惡性腫瘤的抑癌因子，參與多種惡性腫瘤的生物學(xué)過程[11]。例如，miR-577的低表達(dá)與肝癌組織的惡性臨床病理特征有關(guān)，并通過下調(diào)β-連環(huán)蛋白抑制肝癌的生長(zhǎng)[12]。此外，miR-577靶向Rab25抑制乳腺癌上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)移[13]。同時(shí)，miR-577抑制結(jié)腸癌腫瘤的生長(zhǎng)，促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞的化學(xué)敏感性[14]。迄今為止，miR-577在肺癌細(xì)胞及組織中的表達(dá)量以及對(duì)其發(fā)生發(fā)展是否有抑制作用尚不清楚，需要進(jìn)一步探究。因此，本研究的目的是探究miR-577在肺癌中的作用及作用機(jī)制。

近年來，Notch信號(hào)通路在癌癥發(fā)生發(fā)展過程中的作用受到了廣泛關(guān)注。Notch信號(hào)通路的激活能夠促進(jìn)癌癥的發(fā)生，包括促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖、遷移、侵襲以及對(duì)化療藥物產(chǎn)生耐藥性等[15]。據(jù)報(bào)道，Notch信號(hào)級(jí)聯(lián)通路對(duì)細(xì)胞增殖、分化、發(fā)育和體內(nèi)平衡至關(guān)重要。Notch信號(hào)失調(diào)存在于多種疾病中，如白血病、乳腺癌、前列腺癌、結(jié)直腸癌和肺癌以及中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)惡性腫瘤[16]。最近的證據(jù)表明Notch信號(hào)與食管癌和乳腺癌干細(xì)胞有關(guān)[17]。該信號(hào)途徑的激活是導(dǎo)致肺癌患者預(yù)后不良的主要原因之一[18]。目前，Notch信號(hào)通路在肺癌發(fā)生發(fā)展過程中的作用及其作用機(jī)制需要進(jìn)一步完善，因此，本研究通過探究激活Notch信號(hào)通路miRNA在肺癌中的作用，進(jìn)一步完善Notch信號(hào)通路在肺癌中的研究，為臨床上對(duì)肺癌的治療提供理論依據(jù)。

本研究首先通過RT-PCR方法對(duì)30對(duì)肺癌患者的癌癥組織和配對(duì)的癌旁的正常組織以及肺癌細(xì)胞和正常肺上皮細(xì)胞BEAS-2B中miR-577的表達(dá)量進(jìn)行分析。研究發(fā)現(xiàn)，與癌旁正常組織相比，miR-577的表達(dá)量在癌癥組織中顯著降低，且其在肺癌細(xì)胞中的表達(dá)量也顯著低于在正常肺上皮細(xì)胞BEAS-2B中的表達(dá)量；此外，肺癌細(xì)胞A549中轉(zhuǎn)染miR-577mimic后，細(xì)胞的增殖和侵襲被抑制，同時(shí)，對(duì)5-Fu的敏感性顯著增加；熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，miR-577能夠靶向結(jié)合Notch并抑制其表達(dá)。最后，機(jī)制分析發(fā)現(xiàn)，miR-577通過結(jié)合Notch信號(hào)通路中的Notch蛋白，阻斷Notch信號(hào)通路的信號(hào)傳遞，進(jìn)一步抑制細(xì)胞增殖、侵襲和耐藥性的產(chǎn)生。

綜上所述，本研究證明miR-577能夠抑制肺癌細(xì)胞A549的增殖、侵襲，并降低其對(duì)5-Fu的耐藥性，其作用機(jī)制通過介導(dǎo)Notch信號(hào)通路來實(shí)現(xiàn)的。