吸血動物和蛇毒半胱氨酸蛋白酶抑制劑功能研究進展

朱明儒，吳若男，肖蓉

遼寧師范大學 生命科學學院，遼寧 大連 116081

半胱氨酸蛋白酶抑制劑（cystatin）是一類普遍存在于病毒、細菌、原生動物、植物和哺乳動物體內(nèi)的蛋白酶抑制因子，能夠與半胱氨酸蛋白酶可逆地競爭性結(jié)合并抑制其活性，從而參與調(diào)節(jié)機體多種生理和病理過程，如蛋白質(zhì)分解代謝、感染與免疫、腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移等[1-2]。早在1968年，F(xiàn)ossum和Whitaker兩位學者從雞蛋清中分離得到一種能夠抑制無花果蛋白酶、木瓜蛋白酶及二肽酶活性的半胱氨酸蛋白酶抑制劑[3]；隨后，Anastasi等首次采用親和層析法分離得到該蛋白酶抑制劑的純品，將其命名為cystatin[4]。此后，陸續(xù)有學者相繼從不同物種中分離得到多種cys-tatin成員，從而構(gòu)成一個龐大的cystatin超家族。

根據(jù)序列相似性、對蛋白酶活性抑制強弱以及是否存在二硫鍵，cystatin超家族成員可分為3類，即Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ型[5]。Ⅰ型又稱stefin（胱抑蛋白）家族，主要為細胞內(nèi)蛋白質(zhì)。每個成員約由98個氨基酸殘基組成，相對分子質(zhì)量（Mr）約11 000，無二硫鍵和糖基化側(cè)鏈，分布于上皮細胞和多形核白細胞內(nèi)，代表成員如人類stefin A和B。Ⅱ型又稱cystatins家族，是cystatin超家族的主要代表，為分泌性蛋白質(zhì)。每個成員約由120個氨基酸殘基組成，Mr約為14 000，含有2個鏈內(nèi)二硫鍵，并且含有1個在胞外定位的信號肽，主要存在于體液中。該家族成員能抑制木瓜蛋白酶樣超家族的半胱氨酸蛋白酶，如木瓜蛋白酶、組織蛋白酶B、H和L[6]。另外，有些Ⅱ型cystatins成員，如cystatin C、E/M和F還能抑制哺乳動物的天冬酰胺內(nèi)肽酶（asparaginyl endopeptidase，AEP）活性，并在機體免疫過程中阻礙AEP參與抗原的加工與呈遞[7]。Ⅲ型又稱為kininogens（激肽原）家族，為分泌性單鏈蛋白質(zhì)，主要存在于血漿及分泌液中。kininogens家族成員由多個Ⅱ型cystatin樣結(jié)構(gòu)域組成，含有多個二硫鍵及糖基，Mr為60 000～120 000[8]。cystatin超家族成員在空間結(jié)構(gòu)上高度相似，都含有保守的疏水結(jié)構(gòu)域，即靠近N端的甘氨酸（Gly）、第一個發(fā)夾環(huán)Q-X-V-X-G區(qū)域（有些成員為Q-X-X-X-G序列），以及第二個發(fā)夾環(huán)脯氨酸和色氨酸（P-W）。cystatin超家族成員通過這3個基序以非共價鍵結(jié)合蛋白酶，從而阻斷蛋白酶活性位點與其作用底物的結(jié)合。由于cystatin并不直接嵌入酶的活性中心，因此最終形成可逆的、緊密結(jié)合的酶-抑制劑復合物[9-10]。

1 吸血動物cystatin超家族成員功能研究進展

1.1 蜱蟲cystatin超家族成員功能研究進展

已有研究顯示cystatin在蜱蟲的生長發(fā)育、吸血、血紅蛋白消化以及對宿主免疫系統(tǒng)的調(diào)節(jié)過程中起著非常重要的作用。目前，研究發(fā)現(xiàn)蜱蟲主要含有2種類型的cystatin超家族成員，分別屬于Ⅰ型和Ⅱ型。近年來，已經(jīng)有大量研究對來自不同硬蜱和軟蜱的多種cystatin分子進行了鑒定分析，并探究了其在蜱蟲生理中的作用。

蜱蟲Ⅰ型stefin家族成員缺乏信號肽，為細胞內(nèi)蛋白質(zhì)，參與調(diào)節(jié)蜱蟲的生長發(fā)育及細胞內(nèi)血紅蛋白的消化過程。2006年，Lima等從微小牛蜱（Boophilus microplus）的脂肪體cDNA文庫中鑒定出一種Ⅰ型stefin家族成員，命名為Bmcystatin。半定量PCR和Western印跡分析表明Bmcystatin不僅存在于微小牛蜱的脂肪體中，還存在于其唾液腺及卵巢中[11]。序列分析表明Bmcystatin與來自肩突硬蜱（Ixodes scapularis）唾液的Ⅰ型stefin家族成員具有70%的序列一致性。除了能夠抑制組織蛋白酶L，Bmcystatin還對微小牛蜱中半胱氨酸內(nèi)肽酶的活性具有抑制作用。由于該半胱氨酸內(nèi)肽酶可降解卵黃素，因此作者推測Bmcystatin在蜱蟲胚胎發(fā)育過程中具有重要作用[11-12]。

2009年，Zhou等從長角血蜱（Haemaphysalis longicornis）腸上皮細胞中鑒定出一種Ⅰ型stefin家族成員，并經(jīng)原核表達得到重組蛋白Hlcyst-1（cystatin from tickH.longicornis）。序列分析表明Hlcyst-1與Bmcystatin具有79%的序列一致性。Hlcyst-1對組織蛋白酶B和H表現(xiàn)出較小的抑制活性[13-14]。但是，Yamaji等發(fā)現(xiàn)Hlcyst-1在長角血蜱中可以抑制一類組織蛋白酶L樣的半胱氨酸蛋白酶（H.longicorniscathepsin L-like，HlCPL-A）。由于HlCPL-A能夠降解牛血紅蛋白，因此Hlcyst-1可有效抑制HlCPL-A的血紅蛋白分解活性。在長角血蜱的吸血過程中，Hlcyst-1和HlCPL-A的轉(zhuǎn)錄水平不斷上調(diào)，并在48 h達到最高水平。因此，Yamaji等推測Hlcyst-1可以協(xié)同HlCPL-A調(diào)控蜱蟲血液消化的過程[15-16]。

近年來，對蜱蟲Ⅱ型cystatins家族成員的研究較多。通常，Ⅱ型cystatins家族成員在蜱蟲的中腸和唾液腺組織中分泌表達。2010年，Yamaji和Zhou等陸續(xù)從長角血蜱的中腸和唾液腺組織中鑒定出3種Ⅱ型cystatins家族成員，即Hlcyst-2、Hlcyst-3和HlSC-1[15-17]。其中Hlcyst-2、Hlcyst-3主要源自長角血蜱的中腸組織，而HlSC-1則是在長角血蜱的唾液腺中被鑒定出來。酶活測定結(jié)果表明Hlcyst-2、Hlcyst-3和HlSC-1都對木瓜蛋白酶和組織蛋白酶L具有抑制活性，且Hlcyst-2還可抑制組織蛋白酶H的活性。長角血蜱經(jīng)血液喂養(yǎng)后，Hlcyst-2轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物不僅主要存在于長角血蜱所有發(fā)育階段的中腸組織中，還存在于其血細胞和唾液腺中，且表達水平隨著長角血蜱的發(fā)育階段而不斷增加[15]。與Hlcyst-1一樣，Hlcyst-2可以通過抑制HlCPL-A的活性來阻止其對血紅蛋白的降解，這表明Hlcyst-2也可參與調(diào)控長角血蜱的血液消化及發(fā)育過程[15]。此外，將細菌脂多糖（lipopolysaccharides，LPS）注射到成年長角血蜱后，Hlcyst-2轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物上調(diào)。這意味著Hlcyst-2還可能參與調(diào)節(jié)蜱蟲的天然免疫過程[13]。

迄今，在蜱蟲中發(fā)現(xiàn)較早且研究最多的Ⅱ型cystatins成員是來自肩突硬蜱唾液腺的sialostatin L和L2。這2種蛋白具有75%的序列相似性，且二者都可抑制組織蛋白酶L和S的活力[18]。在角叉菜膠誘導的小鼠爪水腫模型中，sialostatin L可通過抑制小鼠細胞毒性T淋巴細胞系CTLL-2的增殖進而降低小鼠爪水腫的程度。這表明sialostatin L具有抗炎活性[19]。另外，sialostatin L還可強烈抑制Th9淋巴細胞產(chǎn)生白細胞介素2（interleukin-2，IL-2）和IL-9。通常，宿主在遭受到寄生蟲感染時，可產(chǎn)生IL-9，同時，產(chǎn)生的IL-9可通過進一步促進肥大細胞生長來促使宿主產(chǎn)生免疫應答反應以保護宿主免受寄生蟲的入侵。如果IL-9在宿主體內(nèi)的產(chǎn)生減少，寄生蟲在宿主體內(nèi)就更易存活。這就意味著在肩突硬蜱的寄生過程中，sialostatin L可通過抑制IL-9的產(chǎn)生來有效阻止宿主的免疫反應以保證其在宿主體內(nèi)的存活[20]。因此，在不久的將來，sialostatin L的這一特性可用來開發(fā)治療過敏性和自身免疫疾病的新藥。此外，還有研究報道IL-9主要參與誘導哮喘的形成。在小鼠實驗性哮喘模型中，sialostatin L還可通過抑制IL-9的產(chǎn)生進而幾乎完全消除了小鼠的氣道高反應性（airway hyper reactivity，AHR）以及嗜酸性粒細胞增多的癥狀[21]。這表明sialostatin L還具有治療哮喘疾病的作用，這也為今后研發(fā)治療哮喘疾病的新策略及新藥篩選提供了線索。

盡管有效抑制宿主的免疫反應對蜱蟲的攝食成功至關(guān)重要，但是，在抑制宿主免疫反應的同時，蜱蟲還可在宿主體內(nèi)大肆傳播病原體。Ⅰ型干擾素（interferon，IFN）主要由樹突狀細胞（dendritic cells，DC）產(chǎn)生，在宿主防御蜱蟲傳播病原體的過程中至關(guān)重要。目前研究發(fā)現(xiàn)sialostatin L2可通過抑制信號傳導及轉(zhuǎn)錄激活因子1/2（signaltransducersand activatorsoftranscription-1/2，STAT-1/2）的磷酸化進而干擾IFN觸發(fā)的信號轉(zhuǎn)導。這樣，伯氏包柔螺旋體（Borrelia burgdorferi）便在sialostatin L2的保護下在宿主體內(nèi)傳播，最終可引起萊姆病。因此，sialostatin L2不僅是蜱蟲攝食成功的關(guān)鍵因素，同時也是病原體在宿主體內(nèi)傳播的關(guān)鍵靶點[22]。同時，還有報道稱sialostatin L2可通過抑制巨噬細胞還原型輔酶（nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH）來促進其細胞內(nèi)活性氧（reactive oxygen species，ROS）的產(chǎn)生，從而抑制caspase-1的激活及其介導的炎癥反應，最終在阻斷宿主免疫應答方面發(fā)揮重要作用[23]。

2006年，Grunclová等從來自非洲鈍緣蜱（Ornithodoros moubata）的cDNA文庫中分離鑒定出2種Ⅱ型cystatins成員，分別是Om-cystatin 1和Om-cystatin 2。經(jīng)原核表達后，重組蛋白Om-cystatin 1和Om-cystatin 2均可有效抑制木瓜蛋白酶及組織蛋白酶B、C、H的活性[24]。LPS刺激DC后，重組蛋白Om-cystatin 1和Om-cystatin 2均可抑制DC分泌促炎細胞因子，如腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）和 IL-12，并減少由 DC誘導的抗原特異性CD4+T細胞的增殖，從而參與機體的免疫應答反應[25]。與sialostatin L相似，Om-cystatin 2還能夠強烈抑制組織蛋白酶L和S的活性。不過，Om-cystatin 2對組織蛋白酶B、C、H的抑制效率比sialostatin L更高[26]。此外，Omcystatin 2和sialostatin L還可與組織蛋白酶S發(fā)生相互作用，即通過抑制組織蛋白酶S的活性進而抑制DC的成熟，阻斷宿主的免疫反應，從而使蜱蟲能夠輕松寄生在宿主體內(nèi)，吸食血液。此外也有研究報道，降低Om-cystatin 2和sialostatin L2的表達會顯著抑制蜱蟲的攝食能力[27]。這表明Om-cystatin 2可協(xié)同sialostatin L2參與調(diào)控蜱蟲的進食過程。

2015年，Wei等先后從鐮形扇頭蜱（Rhipicephalus haemaphysaloides）的cDNA文庫中鑒定出2種cystatin成員，分別是Ⅰ型stefin成員RHcyst-1和Ⅱ型cystatins成員RHcyst-2。在蜱蟲的不同發(fā)育階段，實時熒光定量PCR（quantitative real-time PCR，qRT-PCR）結(jié)果顯示RHcyst-1在卵中的表達量最高，且RHcyst-1經(jīng)基因沉默后會顯著降低蜱蟲的產(chǎn)卵率。這表明RHcyst-1可能參與調(diào)控蜱蟲的早期胚胎發(fā)育過程。此外，與未吸血的蜱蟲相比，RHcyst-2在吸血蜱蟲所有組織中的表達均明顯上調(diào)。這表明RHcyst-2參與調(diào)節(jié)蜱蟲的吸血過程。原核表達的RHcyst-1和RHcyst-2重組蛋白都對組織蛋白酶L、B、C、H、S以及木瓜蛋白酶等半胱氨酸蛋白酶的活性具有明顯的抑制作用[28-29]。由于目前研究證實組織蛋白酶L、S在腫瘤細胞的侵襲和遷移中發(fā)揮關(guān)鍵作用[30-31]，是控制腫瘤細胞轉(zhuǎn)移的有效靶點，因此，組織蛋白酶L和S的抑制劑，如RHcyst-1，應具有潛在的抗腫瘤轉(zhuǎn)移活性。隨后，Wei等發(fā)現(xiàn)RHcyst-1可有效抑制人宮頸癌HeLa、肺癌A549、卵巢癌SKOV-3和小鼠黑色素瘤B16F10等4種不同腫瘤細胞的增殖、遷移和侵襲。在體內(nèi)動物實驗中，將小鼠黑色素瘤B16F10細胞移植入C57BL/6小鼠體內(nèi)，同時將RHcyst-1直接注射至黑色素瘤內(nèi)部后，荷瘤小鼠腫瘤的生長被顯著抑制。同時，RHcyst-1不僅對小鼠體內(nèi)其他組織器官無毒性，還可提高荷瘤小鼠的存活率[32]。因此，RHcyst-1將有可能成為治療人宮頸癌、肺癌、卵巢癌和小鼠黑色素瘤等腫瘤疾病的重要候選藥物。

2017年Rangel等從全溝硬蜱（Ixodes persulcatus）中分離出3種新型cystatin家族成員，分別命名為JpIpcys2a、JpIpcys2b和JpIpcys2c。序列分析表明JpIpcys2b基序保守，具有Ⅱ型cystatins家族成員的典型特征，而在JpIpcys2a和JpIpcys2c序列中則存在不同于Ⅱ型家族成員典型特征的突變。蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)對接模擬實驗進一步揭示了JpIpcys2a、JpIpcys2b和JpIpcys2c與人組織蛋白酶L的結(jié)合位點保守，并且，該結(jié)合位點均覆蓋了活性位點裂口，可以有效阻止底物進入蛋白酶催化區(qū)域。其中，JpIpcys2a與人組織蛋白酶L結(jié)合可形成較為穩(wěn)定的復合物，而JpIpcys2b和JpIpcys2c與人組織蛋白酶L結(jié)合形成的復合物穩(wěn)定性則較低。同時，活性檢測結(jié)果表明JpIpcys2a對組織蛋白酶B、C、L均具有抑制作用，其中對組織蛋白酶B和L的抑制效果較為明顯。此外，RT-PCR結(jié)果表明JpIpcys2a、JpIpcys2b和JpIpcys2c轉(zhuǎn)錄本存在于全溝硬蜱的不同組織和幼蟲發(fā)育時期中，這表明JpIpcys2a、JpIpcys2b和JpIpcys2c廣泛參與全溝硬蜱的發(fā)育過程[33]。系統(tǒng)發(fā)育樹表明JpIpcys2a與肩突硬蜱的sialostatins L和L2親緣關(guān)系較近。這表明JpIpcys2a可能同樣具有抗炎活性以及抑制細胞毒性T淋巴細胞增殖的功能。Parizi發(fā)現(xiàn)抗重組 BrBmcystatin2b（rBrBmcys2b）、重組 BrBmcystatin2c（rBrBmcys2c）或重組 JpIpcys2a（rJpIpcys2a）的血清能夠識別微小牛蜱的唾液、唾液腺、卵巢、腸道、脂肪體以及幼蟲中的天然cystatin，但程度不同。其中，抗rBrBmcys2c血清能識別部分充血雌性微小牛蜱腸道、卵巢、唾液腺和脂肪體組織中的cystatin，抗JpIpcys2a血清可以識別部分充血和完全充血的雌性微小牛蜱唾液腺中的cystatin以及rBrBmcys2b，而抗rBrBmcys2b可以識別以上所有組織中的天然cystatin[34-35]。上述結(jié)果證明這些重組cystatin與天然cystatin之間存在交叉抗原性。借此，JpIpcys2a、BrBmcys2b和BrBmcys2c可作為抗蜱疫苗的抗原，具有潛在應用前景。

綜上所述，蜱蟲cystatin家族成員不僅具有cystatin超家族典型的生物學功能，既可抑制半胱氨酸類蛋白酶的活性，還在蜱蟲的生長發(fā)育、寄生吸血、血液消化、應對宿主免疫調(diào)節(jié)以及抗腫瘤等方面發(fā)揮重要作用。因此，對蜱蟲cystatin家族成員作用機制的深入研究，不僅可為今后有效防治寄生蟲奠定理論基礎(chǔ)，還可為開發(fā)新型的抗炎以及抗腫瘤藥物提供線索。

1.2 水蛭cystatin超家族成員功能研究進展

水蛭又名螞蟥，主要以吸食動物血液為生。不過遺憾的是，迄今關(guān)于環(huán)節(jié)動物先天性免疫調(diào)控作用機制的研究還相對較少。2004年，Lefebvre等首次采用大腸桿菌和藤黃微球菌（Micrococcus luteus）混合菌刺激整嵌晶蛭（Theromyzon tessulatum），并對其進行轉(zhuǎn)錄組學研究，以鑒定挖掘免疫應答反應的相關(guān)功能基因。在鑒定出來的64種功能基因中，Lefebvre等克隆并表達了與哺乳動物stefin B具有較高同源性的半胱氨酸蛋白酶抑制劑B，并將其命名為Tt-cysb。分析表明Tt-cysb與人類stefin B具有54%的序列一致性。原位雜交和免疫細胞化學結(jié)果表明Tt-cysb僅在水蛭的大型體腔細胞中表達，且其表達量在經(jīng)混合細菌處理后的24 h內(nèi)持續(xù)上調(diào)[36-37]。這表明Ttcysb可能參與調(diào)節(jié)水蛭內(nèi)組織蛋白酶的活性，并在水蛭的免疫應答調(diào)節(jié)中起重要作用。

1.3 七鰓鰻cystatin家族成員功能研究進展

七鰓鰻隸屬于圓口綱，具有獨特的半寄生生活習性。2016～2018年，李博文和Zhu等對不同進食時間的中國東北七鰓鰻（Lampetra morii）口腔腺分泌液進行比較蛋白質(zhì)組學研究，從中鑒定出半胱氨酸蛋白酶抑制劑F（L.moriicystatin F，Lmcystatin F）基因。由于Lm-cystatin F僅存在于進食后東北七鰓鰻的口腔腺分泌液中，因此推測Lm-cystatin F可能參與調(diào)控了東北七鰓鰻的吸血進食以及免疫防御等過程[38-39]。序列分析表明來自東北七鰓鰻口腔腺的Lm-cystatin F含有信號肽和二硫鍵等特征，隸屬于Ⅱ型cystatins家族。前21位氨基酸為信號肽（MSRVASLSLLLCGLCYFCCEA），29（P）～139（Q）位氨基酸為cystatin樣功能結(jié)構(gòu)域。三維模擬結(jié)果表明Lm-cystatin F含有L1和L2等2個成環(huán)結(jié)構(gòu)，2對二硫鍵，包含1個α螺旋和5個β折疊[38-39]。

重組Lm-cystatin F以劑量依賴性的方式抑制木瓜蛋白酶的活性，因此，李博文和Zhu等推測Lm-cystatin F具有cystatin超家族成員典型的生物學功能。此外，重組Lm-cystatin F能夠抑制人臍靜脈內(nèi)皮細胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVECs）增殖、黏附于多種細胞外基質(zhì)蛋白質(zhì)、遷移、浸潤以及體外小管形成，因而具有抗血管新生功能[39]。

2 蛇毒cystatin超家族成員功能研究進展

cystatins是存在于蛇毒中的一類具有多種生物活性的小分子蛋白質(zhì)[40]。目前，蛇毒來源的cystatin超家族成員均隸屬于Ⅱ型cystatins家族。1987年，Evans等首次從鼓腹咝蝰（Bitis arietans）蛇毒中分離得到cystatin超家族成員，將其名命為puff-adder[41]。隨后，Michele等從臺灣眼鏡蛇（Naja naja atra）毒液中分離出一種新的Ⅱ型cystatins家族成員，命名為眼鏡蛇半胱氨酸蛋白酶抑制劑（cobra cystatin）[42]。序列分析表明cobra cystatin與puff-adder具有73%的同源性。酶活實驗表明puff-adder和cobra cystatin均能抑制木瓜蛋白酶和組織蛋白酶B的活性[41-42]。由于前期研究證實抑癌基因cystatin M（人源）也可以同樣特異性地抑制半胱氨酸蛋白酶中組織蛋白酶B的活性，且其表達若發(fā)生下調(diào)則會通過增強組織蛋白酶B的活性進而促進癌細胞的浸潤和轉(zhuǎn)移[43]，因此研究人員推測蛇毒cystatin超家族成員也很有可能參與調(diào)控腫瘤的發(fā)生及發(fā)展進程。

2002年，陳兵發(fā)現(xiàn)來自中華眼鏡蛇（Naja atra）蛇毒的小分子cystatin（snake venom cystatin，sv-cystatin）可顯著競爭性抑制木瓜蛋白酶和組織蛋白酶B的活性。氨基酸序列分析結(jié)果提示svcystatin與人源cystatin M具有高度相似性，因此陳兵推測sv-cystatin可能具有抗腫瘤侵襲及轉(zhuǎn)移的潛在功能[44]。由于蛇毒中sv-cystatin的含量相對較少，且其分離提純步驟過于繁瑣，因此宋軍及萬榕等先后通過構(gòu)建pET-42a/GST-cystatin原核表達載體，并經(jīng)大腸桿菌原核表達獲得可溶性重組sv-cystatin；構(gòu)建pcDNA3.1/sv-cystatin真核表達載體，并經(jīng)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染導入相關(guān)癌細胞；以及運用巴斯德畢赤酵母真核表達體系表達重組svcystatin等方法來大批量生產(chǎn)、純化該蛋白，從而進一步了解sv-cystatin的多種生物學功能和潛在的作用機制[45-47]。除了能夠抑制半胱氨酸蛋白酶中木瓜蛋白酶和組織蛋白酶B的活性，體外及體內(nèi)實驗均證實利用以上2種表達方法（大腸桿菌原核表達和巴斯德畢赤酵母真核表達）而得到的重組sv-cystatin均可有效抑制小鼠黑色素瘤B16F10及肝癌MHCC97H細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。與重組sv-cystatin結(jié)果相似，sv-cystatin轉(zhuǎn)染至B16F10及MHCC97H細胞后均可在體外及體內(nèi)抑制上述腫瘤細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移[48-51]。目前大量研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤細胞可分泌多種蛋白水解酶，如半胱氨酸蛋白酶，并通過對細胞外基質(zhì)以及基底膜的降解，從而在腫瘤的侵襲及轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮非常重要的作用[52]。因此，侵襲和轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤的主要生物學特征，同樣也是導致腫瘤患者死亡的主要原因。而sv-cystatin作為半胱氨酸蛋白酶的有效抑制劑，可能通過阻礙半胱氨酸蛋白酶對細胞外基質(zhì)和基底膜的降解，從而有效抑制腫瘤的侵襲與轉(zhuǎn)移。因此，謝群等提出sv-cystatin可作為抗癌治療的潛在候選藥物[48-51]。

研究發(fā)現(xiàn)腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因NM23（non-metastasis 23）可編碼生成核苷二磷酸激酶（nucleoside diphosphate kinases，NDPK）。作為目前研究較多的抑制腫瘤轉(zhuǎn)移的蛋白質(zhì)，NDPK最早從小鼠黑色素瘤細胞中篩選得到，其在低轉(zhuǎn)移細胞株中的表達強度是高轉(zhuǎn)移細胞株內(nèi)的10倍。目前研究證實NDPK可以結(jié)合多種小G蛋白和三聚體G蛋白，并抑制G蛋白水解三磷酸鳥苷（guanosine triphosphate，GTP）為二磷酸鳥苷（guanosine diphosphate，GDP），從而抑制蛋白激酶 C（protein kinase C，PKC）膜轉(zhuǎn)位，由此發(fā)揮其抑制腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移的作用。另外，NDPK還可與微管蛋白結(jié)合，通過調(diào)節(jié)微管結(jié)構(gòu)而影響細胞結(jié)構(gòu)和遷移，進而抑制腫瘤細胞侵襲和轉(zhuǎn)移[53-54]。2011年，齊元麟等發(fā)現(xiàn)sv-cystatin能夠顯著上調(diào)小鼠黑色素瘤細胞中NM23的表達，并由此推斷sv-cystatin可能通過調(diào)控NM23的表達來抑制腫瘤的侵襲及轉(zhuǎn)移[55]。

2013年，謝群等在體外實驗中發(fā)現(xiàn)重組svcystatin處理人肝癌MHCC97H細胞后，可下調(diào)MHCC97H細胞內(nèi)轉(zhuǎn)化生長因子β2（transforming growth factor-β2，TGF-β2）和腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）的轉(zhuǎn)錄水平及蛋白表達。由于TGF-β2是一類多功能的細胞因子，在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要的促進作用，因此sv-cystatin處理MHCC97H細胞后，可通過抑制TGF-β2的轉(zhuǎn)錄和表達，進而阻礙TGF-β2與其受體的結(jié)合，最終阻斷其胞內(nèi)下游Smads信號轉(zhuǎn)導通路，從而抑制腫瘤的轉(zhuǎn)移；同時，sv-cystatin還可通過抑制TGF-β2介導的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT），從而抑制腫瘤的發(fā)生發(fā)展[56-57]。此外，TNF-α可與細胞內(nèi)血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）以及血小板衍生生長因子（platelet derived growth factor，PDGF）等細胞生長因子協(xié)同作用來誘導腫瘤形成新血管。并且，目前TNF-α已經(jīng)成為抗血管生成作用的有效靶點而用于腫瘤治療[58]。因此，sv-cystatin還可通過下調(diào)TNF-α的轉(zhuǎn)錄和表達來發(fā)揮其抗血管新生作用，從而抑制腫瘤的生長。

目前，研究發(fā)現(xiàn)血管在腫瘤生長和轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮了非常重要的作用。不過，僅僅依賴于內(nèi)皮細胞形成的血管是無法滿足腫瘤生長過程中所需要的血液供應。最近研究發(fā)現(xiàn)，在惡性腫瘤組織中，腫瘤細胞可通過自身變形，并與細胞外基質(zhì)相互作用，以模擬血管壁結(jié)構(gòu)而形成由一層腫瘤細胞而不是由內(nèi)皮細胞構(gòu)成的擬態(tài)血管（血管生成擬態(tài)，vasculogenic mimicry，VM）。由于VM為腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移提供了更為充足的血液供應，因此VM在多種惡性腫瘤組織中均有發(fā)現(xiàn)，如卵巢癌、肝癌及胃癌等[59]。與未出現(xiàn)VM的腫瘤細胞相比，在VM周圍的多種腫瘤細胞中，基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）2與MMP9的含量都相對較高。MMPs是一組Zn2+依賴性肽酶，能夠降解多種細胞外基質(zhì)以及基底膜中多種膠原成分，包括層粘連蛋白、纖維連接蛋白、彈力蛋白及蛋白聚糖等，因此MMPs在腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移及血管生成中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用[60-62]。2010年，Robertson等發(fā)現(xiàn)在形成VM的乳腺癌細胞中，MMP2和MMP9的蛋白含量明顯高于未出現(xiàn)VM的乳腺癌細胞[63]。由此表明MMP2和MMP9與VM的形成有緊密關(guān)系。2011年，Tang等發(fā)現(xiàn)sv-cystatin基因轉(zhuǎn)染至肝癌MHCC97H細胞后可以抑制MMP2與MMP9的活性，因此推測sv-cystatin可能是通過抑制肝癌MHCC97H細胞內(nèi)MMP2和MMP9的活性從而減少其對細胞外基質(zhì)的降解，進而減少VM的形成，最終抑制腫瘤細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移[50]。除了形成VM，腫瘤細胞還可分泌大量血管生長因子，通過激活血管內(nèi)皮細胞信號傳導通路，導致血管內(nèi)皮細胞的異常增殖，最終形成提供營養(yǎng)供給的新生血管。例如，VEGF和堿性成纖維細胞生長因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）是2種重要的血管生長刺激因子，可同內(nèi)皮細胞上血管內(nèi)皮生長因子受體（fms-like tyrosine kinase，flt-1）結(jié)合，通過激發(fā)內(nèi)皮細胞信號轉(zhuǎn)導途徑，從而促進內(nèi)皮細胞的增殖、遷移、細胞外基質(zhì)的降解以及侵襲基底膜，最終形成新的血管。2013年，Xie等研究表明重組sv-cystatin還能明顯抑制小鼠黑色素瘤B16F10細胞和肝癌MHCC97H細胞分泌VEGF和bFGF，并顯著抑制內(nèi)皮細胞HUVECs中flt-1的表達，從而最終抑制腫瘤內(nèi)新血管的生成[64]。

此外，謝群等還發(fā)現(xiàn)重組sv-cystatin可以通過誘導肝癌MHCC97H和小鼠黑色素瘤B16F10細胞發(fā)生凋亡來抑制腫瘤的生長。重組sv-cystatin促使MHCC97H及B16F10細胞釋放活性氧，并通過活化caspase-2來破壞線粒體功能，即將線粒體內(nèi)的細胞色素C（cytochrome C）釋放至細胞質(zhì)中。細胞色素C的釋放是線粒體凋亡路徑的重要一環(huán)。被釋放入細胞質(zhì)的細胞色素C通過自我剪切可以活化并啟動caspase級聯(lián)反應，從而激活其下游的凋亡執(zhí)行者caspase-3，最終引起細胞凋亡。另外，Western印跡分析表明重組sv-cystatin還能抑制抗凋亡基因BCL2的表達，并同時促進促凋亡基因BAX的表達。BCL2和BAX作為線粒體凋亡途徑上的重要調(diào)控蛋白，相互結(jié)合、彼此抑制，共同影響細胞凋亡的發(fā)生與發(fā)展[48]。因此，上述結(jié)果意味著sv-cystatin可通過線粒體途徑誘導MHCC97H和B16F10細胞凋亡。

到目前為止，sv-cystatin是研究相對較多且較為深入的來自蛇毒的cystatin超家族成員。綜上所述，sv-cystatin抑制腫瘤細胞轉(zhuǎn)移機制為：svcystatin首先通過抑制半胱氨酸蛋白酶的活性從而抑制其對細胞外基質(zhì)及基底膜的降解，最終抑制腫瘤細胞的遷移和侵襲。其次，sv-cystatin還可通過上調(diào)NM23的表達，抑制腫瘤的侵襲及轉(zhuǎn)移。第三，sv-cystatin通過下調(diào)TGF-β2轉(zhuǎn)錄水平及蛋白的表達，抑制腫瘤細胞的轉(zhuǎn)移及上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化。此外，sv-cystatin還可通過抑制腫瘤內(nèi)VM及血管新生來阻斷腫瘤細胞的營養(yǎng)供給，其作用機制為：首先sv-cystatin可通過抑制MMP2和MMP9的活性，減少其對細胞外基質(zhì)的降解，進而減少VM的形成；其次，sv-cystatin可通過下調(diào)TNF-α、VEGF、bFGF及flt-1受體的表達來抑制腫瘤內(nèi)新生血管的形成。最后，sv-cystatin還可通過線粒體途徑誘導腫瘤細胞發(fā)生凋亡來抑制腫瘤的生長。因此，sv-cystatin有望成為具有抗腫瘤功能的新型候選藥物。

除了sv-cystatin，Richards等在2011年通過KM71H畢赤酵母表達系統(tǒng)重組表達了來自澳大利亞低地銅斑蛇（Australian lowland copperhead）蛇毒中的Ⅱ型cystatins成員AsCystatin，并預測其Mr為13 087。與人cystatin C相似，重組AsCystatin同樣可抑制組織蛋白酶B、L以及木瓜蛋白酶的活性[65]。不過，AsCystatin是否與sv-cystatin一樣具有多種生物學功能，還須進一步探索。

綜上所述，來源于吸血動物及蛇毒的cystatin成員隸屬于Ⅰ型和Ⅱ型cystatins家族，具有該家族典型的生物學功能，即能夠抑制多種半胱氨酸類蛋白酶的活性。同時，上述cystatins成員還能夠廣泛參與調(diào)節(jié)吸血動物的生長發(fā)育、寄生吸血、血液消化、應對宿主免疫調(diào)節(jié)以及抗腫瘤等功能。