納米銀對(duì)青島近海浮游細(xì)菌活性的影響研究?

何羿霖， 白 潔,2， 白曉巖， 李巋然??

(1.中國(guó)海洋大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，山東 青島 266100； 2.中國(guó)海洋大學(xué)海洋環(huán)境與生態(tài)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 青島 266100；3.中國(guó)海洋大學(xué)海洋生命學(xué)院，山東 青島 266003)

隨著納米技術(shù)的發(fā)展，納米材料越來越多的被應(yīng)用于抗菌物質(zhì)、藥物載體、污水處理等領(lǐng)域[1]。早在16世紀(jì)，人類就發(fā)現(xiàn)銀及其復(fù)合物具有較強(qiáng)的抑菌殺菌作用，銀在抗菌抑菌方面具有更多其他材料不具備的優(yōu)點(diǎn)，諸如具有持久性、光譜性、耐熱性等理化性能[2]。與 Ag+相比，納米銀的抑菌能力更有效和持久，并且可以防止細(xì)菌二次污染，被廣泛應(yīng)用于各領(lǐng)域，在生產(chǎn)、運(yùn)輸、消費(fèi)和處置的過程中，納米銀等重金屬會(huì)通過大氣沉降、地表徑流等形式匯入海洋[3-4]。目前，在近岸海域已檢測(cè)到多種納米材料的存在，其環(huán)境預(yù)測(cè)濃度已達(dá)到“mg/L”級(jí)別。已有研究表明，工業(yè)排放水中納米銀濃度范圍可達(dá)1～6 mg/kg，青島近海位于納米銀進(jìn)入環(huán)境，發(fā)生遷移行為的路徑上，同時(shí)隨著排放量的增加其環(huán)境濃度呈指數(shù)上升[5-6]。盡管進(jìn)入環(huán)境中的納米銀背景濃度不高，但是其在環(huán)境中具有持久性和生物積累效應(yīng)，進(jìn)入水體中的納米銀可能會(huì)對(duì)碎屑分解、生物地球化學(xué)循環(huán)和基礎(chǔ)食物鏈的物質(zhì)傳遞產(chǎn)生消極影響[7-9]。而微生物是這些重要生態(tài)過程的主要參與者和完成者，同時(shí)也是物質(zhì)和能量的儲(chǔ)存庫，在生態(tài)系統(tǒng)循環(huán)中發(fā)揮著不可替代的重要作用。

納米銀體積極小，具有小尺寸效應(yīng)和表面效應(yīng)，可吸附在細(xì)菌細(xì)胞壁表面上，細(xì)菌細(xì)胞壁成分主要成分肽聚糖中的 -NH-、-COOH 官能團(tuán)可與納米銀發(fā)生反應(yīng)，導(dǎo)致細(xì)胞壁腐蝕，納米銀鑲嵌入細(xì)胞膜中[10]。當(dāng)納米銀嵌入細(xì)胞膜后，會(huì)釋放Ag+，使細(xì)菌細(xì)胞膜的通透性遭到破壞，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)、無機(jī)鹽和還原糖外漏，影響細(xì)菌細(xì)胞正常的跨膜運(yùn)輸，破壞了細(xì)菌細(xì)胞的代謝系統(tǒng)和與外界的通信，使生長(zhǎng)速度降低，從而抑制細(xì)菌的生長(zhǎng)與活性[11]。當(dāng)納米銀徹底滲透進(jìn)入菌體內(nèi)部后，會(huì)與細(xì)菌的酶蛋白巰基迅速結(jié)合，導(dǎo)致酶失去活性，由此造成細(xì)菌自身不能進(jìn)行新陳代謝而最終死亡[12-13]。有研究表明，納米銀能與大腸桿菌的胞內(nèi)蛋白和酶相互作用[12]，而細(xì)菌可通過胞外酶的釋放，將水生生態(tài)系統(tǒng)食物網(wǎng)很難利用的相對(duì)較大的顆粒轉(zhuǎn)化為可供低營(yíng)養(yǎng)級(jí)生物利用的能量(碳)和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)[14]，但納米銀對(duì)細(xì)菌胞外酶的影響的研究卻很少，且絕大部分的研究都是在培養(yǎng)基條件下進(jìn)行。探討納米銀對(duì)自然海水中浮游細(xì)菌生長(zhǎng)及活性的影響對(duì)深入研究納米材料對(duì)海洋生態(tài)系統(tǒng)的作用機(jī)制具有重要的參考價(jià)值，而青島沿岸經(jīng)濟(jì)發(fā)達(dá)，受人類活動(dòng)影響較大，因此探討納米銀對(duì)青島近海浮游細(xì)菌的影響具有重要意義。

水體中的大顆粒物質(zhì)無法直接通過細(xì)菌細(xì)胞膜，浮游細(xì)菌利用胞外酶從水體中的大顆粒物質(zhì)中獲取碳、氮、磷等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，堿性磷酸酶可以作用于有機(jī)物或無機(jī)物的單磷酸酯鍵，細(xì)菌可以通過堿性磷酸酶從胞外獲取磷和碳；氨肽酶可以作用于氨基酸的N端，細(xì)菌可以通過氨肽酶從胞外獲取氮和碳，這兩種酶是細(xì)菌維持正常生長(zhǎng)和活性的重要胞外酶。本研究通過現(xiàn)場(chǎng)采樣、實(shí)驗(yàn)室模擬培養(yǎng)，研究了不同濃度納米銀對(duì)青島近海海水中細(xì)菌胞外酶活性(堿性磷酸酶活性和氨肽酶活性)、蛋白質(zhì)含量和細(xì)菌死亡率的影響，為深入探討納米銀對(duì)近海海水環(huán)境的生態(tài)影響機(jī)制及環(huán)境效應(yīng)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)用納米銀及預(yù)處理

本研究所用納米銀粉購(gòu)自 SIGMA-ALDRICH?，粒徑<100 nm，銀純度>99.5%。取一定量的納米銀，加入一定量經(jīng) 0.22 μm 濾膜過濾的滅菌去離子水。納米銀溶液需要現(xiàn)用現(xiàn)配，為了防止納米銀聚集，使用前在冰浴條件下，將所用納米銀懸浮液用超聲波(230 V，50 kHz)超聲分散 40 min。

1.2 樣品采集與環(huán)境因子測(cè)定

本研究所用海水于2018年1月采自青島附近海域S站位(120° 22′ 52.32″ E，36°2′ 27.96″N)(見圖1)。使用酸清洗過的無菌聚乙烯塑料瓶采集表層海水水樣，立即用 2 μm 濾膜過濾(去除原生動(dòng)物)，低溫保存立即帶回實(shí)驗(yàn)室。采集海水樣品的同時(shí)，采用 YSI6600 多參數(shù)水質(zhì)測(cè)定儀測(cè)定現(xiàn)場(chǎng)海水pH值、鹽度和電導(dǎo)率等環(huán)境參數(shù)，現(xiàn)場(chǎng)環(huán)境理化參數(shù)為：pH=7.92、鹽度30.7、電導(dǎo)率32 156 μS/cm。

1.3 實(shí)驗(yàn)分組和培養(yǎng)體系的建立

實(shí)驗(yàn)共設(shè)置3個(gè)不同濃度的納米銀處理組和1個(gè)對(duì)照組，分別為對(duì)照組C(0 mg/L)、低濃度納米銀組L(0.5 mg/L)、中濃度納米銀組M(5 mg/L)以及高濃度納米銀組H(50 mg/L)，各組設(shè)置3個(gè)平行實(shí)驗(yàn)組。將水樣分裝于12個(gè)無菌NalgeneTM聚碳酸酯瓶(Thermo ScientificTM)，每瓶裝入過濾海水 2 L，取一定量納米銀儲(chǔ)備液分別加入各試驗(yàn)水體中，混勻，用無菌半透膜封口，置于室溫振蕩培養(yǎng)48 h。分別在0、4、8、16、24、36和48 h于各組培養(yǎng)體系取出一定量樣品，用于測(cè)定堿性磷酸酶活性、亮氨酸氨肽酶活性、蛋白質(zhì)含量和死、活細(xì)菌數(shù)量。

圖1 采樣站位

1.4 樣品測(cè)定

1.4.1 堿性磷酸酶活性(APA)測(cè)定 將采集的樣品以磷酸苯二鈉為底物，37 ℃ 培養(yǎng) 15 min，采用紫外可見分光光度計(jì)(TU-1810)于 510 nm 下測(cè)定酚含量。以單位時(shí)間內(nèi)每 1 mL 樣品水解底物產(chǎn)生的酚含量表示堿性磷酸酶活性[15]。

1.4.2 氨肽酶活性(ALP)測(cè)定 將采集的樣品以L-亮氨酸-4-硝基苯胺(現(xiàn)用現(xiàn)配，以無水乙醇充分溶解，置于棕色試劑瓶中，避光保存)為底物，58 ℃ 培養(yǎng) 15 min。反應(yīng)結(jié)束后立即取出，冰浴終止反應(yīng)，于用紫外可見分光光度計(jì)(TU-1810)在 405 nm 下測(cè)定吸光度值。以單位時(shí)間內(nèi)每 1 mL 樣品水解底物產(chǎn)生的對(duì)硝基苯胺(p-NA)含量表示氨肽酶活性[16]。

1.4.3 蛋白質(zhì)含量測(cè)定 將采集的樣品加入考馬斯亮藍(lán) G-250 試劑，混勻后靜置，用紫外分光光度法于 595 nm 波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度值，計(jì)算蛋白質(zhì)含量[17]。

1.4.4 細(xì)菌死亡率測(cè)定 采用染料 SYBR green1 與碘化丙啶(PI)雙染色法判定死、活細(xì)胞，其中，染料 SYBR green1 能夠穿透活細(xì)胞完整的細(xì)胞膜與核酸物質(zhì)結(jié)合產(chǎn)生 520 nm (綠色)熒光[18]；染料 PI 只能穿透結(jié)構(gòu)受損的細(xì)胞膜與其核酸物質(zhì)結(jié)合，產(chǎn)生 617 nm (紅色)熒光[19]。

細(xì)菌細(xì)胞死/活狀態(tài)采用流式細(xì)胞儀(BD公司，美國(guó))測(cè)定，激發(fā)波長(zhǎng) 488 nm。采用 FL1 通道收集 SYBR 熒光，F(xiàn)L2 通道收集 PI 熒光，分別表征活細(xì)胞和死亡細(xì)胞，如圖2所示[20]。

細(xì)菌細(xì)胞死/活狀態(tài)由細(xì)菌死亡率(P)表示，其計(jì)算公式[21]為：

(圖中E1為PI染色的死細(xì)胞；E2為SYBR green1染色的活細(xì)胞。E1 represents death cells； E2 represents survival cells.)

圖2 流式細(xì)胞儀細(xì)胞死/活狀態(tài)計(jì)數(shù)圖

Fig.2 Death/survival cell count of flow cytometry

1.5 數(shù)據(jù)處理

采用BD Accuri C6 Plus軟件(BD公司，美國(guó))對(duì)流式細(xì)胞儀數(shù)據(jù)進(jìn)行分析統(tǒng)計(jì)細(xì)胞數(shù)。所有數(shù)據(jù)用 Excel 2013 和 SPSS 19.0 分析軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理、分析和統(tǒng)計(jì)。使用Origin8.5作圖軟件進(jìn)行圖形繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 納米銀對(duì)浮游細(xì)菌死亡率的影響

不同濃度納米銀作用下，海水中細(xì)菌死亡率隨時(shí)間變化趨勢(shì)如圖3所示。在沒有外界營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)輸入的情況下，細(xì)菌對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的競(jìng)爭(zhēng)，和培養(yǎng)體系中存在的病毒噬菌體的裂解作用，導(dǎo)致空白組的細(xì)菌死亡率出現(xiàn)上升趨勢(shì)。各實(shí)驗(yàn)組0～4 h的細(xì)菌的死亡率有明顯升高，于4 h時(shí)高濃度納米銀組細(xì)菌死亡率達(dá)到高值，為88.20%，是同期空白組的1.72倍，此時(shí)納米銀對(duì)細(xì)菌死亡率的影響最為明顯，各實(shí)驗(yàn)組對(duì)浮游細(xì)菌死亡率表現(xiàn)出極顯著的抑制效應(yīng)(P<0.01)；在8～24 h，實(shí)驗(yàn)組細(xì)菌死亡率出現(xiàn)逐漸降低又升高的趨勢(shì)，并在暴露24 h后，高濃度納米銀組死亡率達(dá)到峰值88.69%，是同期空白組的1.33倍；在24～48 h，除高濃度納米銀組，其余實(shí)驗(yàn)組細(xì)菌死亡率呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，但變化過程緩慢。低、中濃度納米銀組的前半期變化趨勢(shì)與高濃度納米銀組的變化趨勢(shì)類似，但不同于高濃度納米銀組的是，在培養(yǎng)后期，細(xì)菌死亡率呈現(xiàn)持續(xù)降低的趨勢(shì)，可能是由于細(xì)菌對(duì)納米銀脅迫產(chǎn)生了一定的適應(yīng)性。

圖3 納米銀對(duì)細(xì)菌死亡率的影響

納米銀對(duì)細(xì)菌生長(zhǎng)具有明顯的抑制作用。隨著納米銀濃度的升高，對(duì)細(xì)菌生長(zhǎng)的抑制率也隨之升高，具有明顯的濃度梯度效應(yīng)[22]。在不同濃度納米銀作用下，細(xì)菌死亡率在短時(shí)間內(nèi)顯著升高，但隨著時(shí)間的推移，呈現(xiàn)緩慢恢復(fù)的狀態(tài)。隨著脅迫時(shí)間延長(zhǎng)，細(xì)菌產(chǎn)生了一定的抗性，表明細(xì)菌對(duì)于納米銀脅迫具有一定的適應(yīng)性，但到后期在納米銀和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)減少的雙重作用下，細(xì)菌數(shù)量再一次降低，進(jìn)而導(dǎo)致死亡率再次上升[23]。

2.2 納米銀對(duì)蛋白質(zhì)含量的影響

不同濃度納米銀作用下，海水中蛋白質(zhì)含量的變化趨勢(shì)如圖4所示。納米銀暴露8 h后，高濃度納米銀組蛋白質(zhì)含量達(dá)到最低值21.453 mg/L，此時(shí)抑制效率最高，相比空白組降低了29.80%，在培養(yǎng)前期各實(shí)驗(yàn)組較對(duì)照組都有顯著的抑制作用(P<0.05)。在16 h后，各實(shí)驗(yàn)組蛋白質(zhì)含量開始呈現(xiàn)出上升趨勢(shì)，高濃度納米銀組蛋白質(zhì)含量達(dá)到28.021 mg/L，但仍比對(duì)照組低 8.32%，而中濃度和低濃度組蛋白質(zhì)含量均高于對(duì)照組，細(xì)菌對(duì)納米銀脅迫開始出現(xiàn)適應(yīng)性；在16～24 h蛋白質(zhì)含量又緩慢降低，可能是由于水體中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的減少，實(shí)驗(yàn)組細(xì)菌死亡率升高，導(dǎo)致蛋白質(zhì)含量降低，細(xì)菌體內(nèi)堿性磷酸酶和氨肽酶受到誘導(dǎo)，活性有所增加。在培養(yǎng)后期各實(shí)驗(yàn)組蛋白質(zhì)含量都表現(xiàn)出了波動(dòng)，但在培養(yǎng)結(jié)束時(shí)，各實(shí)驗(yàn)組蛋白質(zhì)含量均低于對(duì)照組。中濃度納米銀組與低濃度納米銀組的變化趨勢(shì)類似。由單因素方差分析結(jié)果可以看出，高濃度納米銀添加組較對(duì)照組表現(xiàn)出顯著的抑制效應(yīng)(P<0.05)，低、中濃度組相比的抑制效應(yīng)物顯著性差異(P>0.05)，因此納米銀對(duì)細(xì)菌蛋白質(zhì)含量的抑制作用沒有明顯的濃度梯度效應(yīng)。

圖4 納米銀對(duì)細(xì)菌蛋白質(zhì)的影響

2.3 納米銀對(duì)細(xì)菌酶活性的影響

2.3.1 納米銀對(duì)堿性磷酸酶活性(APA)的影響 不同濃度納米銀作用下，海水中堿性磷酸酶活性的變化趨勢(shì)如圖5所示。在納米銀添加后，各實(shí)驗(yàn)組堿性磷酸酶活性都出現(xiàn)不同程度的降低，細(xì)菌對(duì)納米銀脅迫表現(xiàn)出急性毒性效應(yīng)，在培養(yǎng)1～4 h抑制效應(yīng)最強(qiáng)，高濃度組堿性磷酸酶活性達(dá)到最低值31.469 mg·L-1·h-1，相比空白組降低了8.58%。在暴露16 h后，高濃度組堿性磷酸酶活性降到最低值31.469 mg·L-1·h-1，此時(shí)相比空白組降低了7.78%；在培養(yǎng)后期，堿性磷酸酶活性呈現(xiàn)恢復(fù)趨勢(shì)，可能是由于細(xì)菌對(duì)納米銀暴露產(chǎn)生適應(yīng)性恢復(fù)。在實(shí)驗(yàn)室模擬培養(yǎng)周期內(nèi)，低、中濃度納米銀組和高濃度納米銀組的變化趨勢(shì)類似，但堿性磷酸酶活性始終高于同期高濃度組。從單因素方差分析中可以看出，高濃度組堿性磷酸酶活性較對(duì)照組有極其顯著的差異性(P<0.01)，且濃度越高，顯著性差異越明顯。由此可見，不同納米銀濃度作用下酶活性受到抑制的程度不同，高濃度組堿性磷酸酶活性抑制最為明顯(P<0.01)，表現(xiàn)出明顯的濃度梯度效應(yīng)。

圖5 納米銀對(duì)堿性磷酸酶活性的影響

2.3.2 納米銀對(duì)氨肽酶活性(ALP)的影響 不同濃度納米銀作用下，培養(yǎng)體系中氨肽酶活性的變化趨勢(shì)如圖6所示。各實(shí)驗(yàn)組氨肽酶活性較對(duì)照組都有降低，在納米銀脅迫下4 h后，高濃度組氨肽酶活性相比于對(duì)照組抑制率達(dá)到18.62%，抑制效應(yīng)顯著(P<0.01)；16 h后，高濃度組氨肽酶活性相比空白組降低了32.55%，抑制效率達(dá)到最高；在16～24 h內(nèi)，氨肽酶活性呈現(xiàn)恢復(fù)趨勢(shì)，細(xì)菌對(duì)納米銀脅迫表現(xiàn)出適應(yīng)性恢復(fù)。中濃度組和低濃度組變化趨勢(shì)與高濃度組基本相同，但是氨肽酶活性也是始終高于高濃度組，基本趨勢(shì)為納米銀濃度越高，酶活性越低。在實(shí)驗(yàn)周期內(nèi)，細(xì)菌氨肽酶活性在短時(shí)間內(nèi)受到抑制，但在培養(yǎng)后期逐漸恢復(fù)，由此可見，納米銀對(duì)細(xì)菌氨肽酶活性的影響是短暫的[24]。由單因素方差分析可以看出，在0～24 h，高濃度組相比于對(duì)照組具有極顯著性差異(P<0.01)，中濃度組對(duì)比于對(duì)照組也具有顯著性差異(P<0.05)，低濃度組無顯著性差異(P>0.05)； 在24～36 h， 各濃度組相比于對(duì)照組無顯著性差異(P>0.05)。由此可知，細(xì)菌氨肽酶活性受納米銀抑制的大小具有濃度梯度效應(yīng)且在培養(yǎng)后期氨肽酶活性受納米銀脅迫影響較小。

圖6 納米銀對(duì)氨肽酶活性的影響

綜合納米銀對(duì)兩種細(xì)菌重要胞外酶活性的影響可以看出，納米銀暴露環(huán)境下，細(xì)菌胞外酶活性均具有明顯抑制效應(yīng)，且納米銀濃度越高，抑制效應(yīng)越顯著。在納米銀加入前期，細(xì)菌就會(huì)產(chǎn)生強(qiáng)烈的應(yīng)激反應(yīng)，在納米銀暴露4 h后，各實(shí)驗(yàn)組納米銀相比于對(duì)照組對(duì)細(xì)菌酶活性的抑制最強(qiáng)，表現(xiàn)出急性毒性效應(yīng)，在納米銀暴露16 h后，酶活性達(dá)到最低值，16 h后，各實(shí)驗(yàn)組酶活性緩慢升高，細(xì)菌對(duì)納米銀暴露產(chǎn)生了一定的適應(yīng)性。

3 討論

本研究中，在納米銀脅迫4 h后所有實(shí)驗(yàn)組浮游細(xì)菌死亡率較同期對(duì)照達(dá)到了峰值，實(shí)驗(yàn)組細(xì)菌死亡率較對(duì)照組有明顯區(qū)別，納米銀濃度越高，細(xì)菌死亡率越高。然而，納米銀對(duì)細(xì)菌的抑制效應(yīng)在培養(yǎng)16 h后開始減小，實(shí)驗(yàn)組細(xì)菌死亡率與同期對(duì)照差異減小，浮游細(xì)菌開始出現(xiàn)適應(yīng)性。這說明了本研究中使用的納米銀對(duì)細(xì)菌具有毒性效應(yīng)，但納米銀對(duì)細(xì)菌的抑制在培養(yǎng)后期出現(xiàn)了適應(yīng)性，高濃度納米銀對(duì)細(xì)菌的抑制效應(yīng)相對(duì)較強(qiáng)，細(xì)菌的適應(yīng)性較弱。隨著納米銀暴露濃度的增加，納米銀顆粒的數(shù)量增加，因此隨著更多納米銀顆粒與細(xì)菌的動(dòng)態(tài)混合，導(dǎo)致海水中的納米銀對(duì)細(xì)菌生長(zhǎng)產(chǎn)生更加明顯的抑制作用，呈現(xiàn)出一定的劑量效應(yīng)關(guān)系。由此可見，高濃度納米銀對(duì)細(xì)菌有極顯著的抑制效應(yīng)，其可能原因有三種，即抑制細(xì)菌增殖、誘導(dǎo)細(xì)菌凋亡或誘導(dǎo)細(xì)菌死亡。納米材料對(duì)海洋生態(tài)系統(tǒng)的短期影響可能出現(xiàn)在局部水體或納米材料點(diǎn)源輸入附近的地點(diǎn)，但隨著時(shí)間的推移，在遠(yuǎn)離近岸和納米銀輸入點(diǎn)源的海區(qū)這種影響可以通過在海水中的稀釋來克服[25]。

納米銀進(jìn)入水體后釋放的Ag+可以通過攻擊細(xì)胞膜上或者細(xì)胞內(nèi)部的含硫蛋白質(zhì)破壞細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能，Ag+與含硫、磷的基團(tuán)結(jié)合或與蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)中的二硫鍵結(jié)合，使蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)破壞而失去活性，從而抑制細(xì)菌細(xì)胞的新陳代謝[26]。實(shí)驗(yàn)組蛋白質(zhì)含量在培養(yǎng)前期較對(duì)照組有明顯抑制(P<0.05)，但在納米銀添加16 h后，蛋白質(zhì)含量出現(xiàn)波動(dòng)，細(xì)菌對(duì)納米銀脅迫出現(xiàn)適應(yīng)性。細(xì)菌的 DNA 堿基對(duì)也可以與納米銀釋放的Ag+發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，與細(xì)菌 DNA 中的嘌呤和嘧啶相鄰的氫鍵發(fā)生置換反應(yīng)，形成復(fù)雜的交叉鏈接，導(dǎo)致 DNA 無法自我復(fù)制和轉(zhuǎn)錄，致使蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)破壞失去活性進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)菌細(xì)胞死亡[27-29]。但納米銀對(duì)細(xì)菌的抑制是短暫的，培養(yǎng)后期，實(shí)驗(yàn)組的蛋白質(zhì)含量與空白組相近。在整個(gè)過程中，蛋白質(zhì)含量隨著脅迫時(shí)間延長(zhǎng)出現(xiàn)恢復(fù)的跡象，這種恢復(fù)可能與部分不敏感的細(xì)菌群落有關(guān)。當(dāng)細(xì)菌受到納米銀脅迫時(shí)，會(huì)產(chǎn)生更多的蛋白質(zhì)(如：酶、無序蛋白或其他應(yīng)激蛋白等)通過解毒代謝來減輕傷害，由此導(dǎo)致細(xì)菌活性升高而出現(xiàn)對(duì)納米銀脅迫具有一定的適應(yīng)性。而高濃度的納米銀造成蛋白質(zhì)含量的減少可能是因?yàn)榈鞍踪|(zhì)合成過程受到干擾，減少了蛋白質(zhì)的合成，或者因?yàn)榈鞍踪|(zhì)的分解加速[30]。

在本研究中，納米銀添加對(duì)細(xì)菌堿性磷酸酶和氨肽酶都有明顯的抑制。在大腸桿菌培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中，納米銀添加使細(xì)菌胞內(nèi)色氨酸酶的活性降低60%以上，納米銀屏蔽了酶的部分活性基團(tuán)或改變了酶的結(jié)構(gòu)而導(dǎo)致酶活性降低甚至失去活性[31]。納米銀顆粒接觸并進(jìn)入細(xì)菌后，會(huì)與酶的氧、氮和巰基等重要功能基團(tuán)結(jié)合，引起酶的三維構(gòu)象改變，或替換出酶中的金屬離子，進(jìn)而影響酶的穩(wěn)定性，最終影響酶發(fā)揮催化功能[32]。當(dāng)水體中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)濃度較低，不足以維持細(xì)菌生長(zhǎng)時(shí)，細(xì)菌體內(nèi)堿性磷酸酶和氨肽酶將受到誘導(dǎo)，使其活性顯著地增加[32]。但由于納米銀的持續(xù)影響，酶活性增長(zhǎng)率低于抑制率，使其在1～8 h內(nèi)活性并沒有明顯升高，但在16 h后，與對(duì)照組酶活性相差幅度減小，在暴露36 h后，酶活性顯示恢復(fù)的跡象。在培養(yǎng)的中后期，各濃度納米銀作用條件下，酶活性都表現(xiàn)出了恢復(fù)的趨勢(shì)，表明細(xì)菌胞外酶的活性對(duì)納米銀的脅迫具有一定的適應(yīng)性。

4 結(jié)論

(1)納米銀對(duì)青島近海水體中的細(xì)菌生長(zhǎng)和活性具有一定的抑制作用。納米銀作用下細(xì)菌酶活性和蛋白質(zhì)含量都顯著下降，納米銀脅迫會(huì)影響細(xì)菌正常生理代謝，導(dǎo)致細(xì)菌死亡率升高和環(huán)境功能的下降。

(2)在納米銀暴露初期，細(xì)菌死亡率顯著升高，細(xì)菌酶活性和蛋白質(zhì)含量受抑制程度最高，但在暴露后期呈現(xiàn)緩慢恢復(fù)的趨勢(shì)，表現(xiàn)出對(duì)納米銀脅迫具有一定的適應(yīng)性。

(3)隨著納米銀濃度的升高，細(xì)菌死亡率和酶活性的抑制率均隨之升高，蛋白質(zhì)含量降低，表明納米銀對(duì)細(xì)菌生長(zhǎng)和酶活性的抑制具有顯著的濃度梯度效應(yīng)。