蝦夷扇貝TET基因在配子發(fā)生和早期發(fā)育中的表達模式?

李仰平， 張玲玲,2??， 李若佼， 劉 甜， 郭振義， 李婉茹， 包振民,2

(1. 中國海洋大學海洋生物遺傳學與育種教育部重點實驗室，山東 青島 266003；2. 青島海洋科學與技術試點國家實驗室 海洋漁業(yè)科學與食物產出過程功能實驗室，山東 青島 266237)

DNA 甲基化，即胞嘧啶的5號碳原子上連接的氫原子被替換成為一個甲基，是真核生物類群中的重要的表觀遺傳修飾，廣泛存在于植物，動物和真菌中。DNA甲基化在基因表達調控，基因組穩(wěn)定性維持，哺乳動物X染色體失活等生物學現象中起到十分重要的作用[1-2]。在生物的生長發(fā)育過程中，細胞的DNA甲基化水平并不是一成不變的，在哺乳動物生長發(fā)育中就存在兩次大規(guī)模的DNA甲基化的重編程過程[3]。第一次DNA甲基化的重編程發(fā)生在配子發(fā)生過程中，原始生殖細胞首先去除來源于外胚層的DNA甲基化模式，在形成精子和卵子的過程中，分別形成配子特異的DNA甲基化模式，這種DNA甲基化模式與配子內基因表達，精子DNA的包裝以及基因印跡有著密切關系[4-6]。第二次DNA甲基化的重編程發(fā)生在精卵結合之后，精子來源的DNA會迅速發(fā)生DNA去甲基化，在受精卵第一次分裂之前精子來源的DNA去甲基化就已經完成；在隨后的細胞分裂過程中，卵子來源的DNA會逐漸去甲基化，在囊胚時期達到DNA甲基化的最低水平。早期發(fā)育時期DNA的去甲基化對胚胎細胞的全能性具有重要意義[3]。

DNA甲基化的重編程包括DNA的去甲基化和重新甲基化，其中DNA的去甲基化過程分為兩種類型：第一種是DNA的被動去甲基化，在細胞分裂的過程中，隨著DNA的復制，如果不形成新的DNA甲基化，DNA的甲基化水平就會逐漸降低，如胚胎時期卵子來源DNA的去甲基化現象。第二種是DNA的主動去甲基化，即在不發(fā)生DNA復制的情況下，通過一系列反應脫去胞嘧啶五號碳原子上所連接的甲基基團的過程[7]。該過程主要由TET(ten-eleven translocation)蛋白催化，TET先將5甲基胞嘧啶5mC催化生成5羥甲基胞嘧啶5hmC[8],然后脫氫生成5甲?；奏?fC，并可進一步氧化形成5羧基胞嘧啶5caC[9]。5fC和5caC都可以被胸腺嘧啶DNA糖基化酶(TDG)識別并脫去對應的甲?；汪然箟A基恢復為沒有修飾的胞嘧啶，從而完成DNA的主動去甲基化過程[10]。在哺乳動物中，TET基因家族有三個成員TET1，TET2和TET3，它們分別在不同的生物學過程中發(fā)揮DNA去甲基化的功能。TET3基因在卵和受精卵中表達量較高，缺失TET3基因會導致早期胚胎中的5hmC含量下降，表明TET3蛋白可能參與受精卵中父本來源DNA的去甲基化[11-12]。TET1和TET2基因在小鼠的原始生殖細胞中檢測到表達[13]，小鼠中的基因敲除實驗也表明這兩個基因對配子發(fā)生過程中基因印跡的擦除具有重要作用，并且TET1和TET2蛋白分別作用于不同的目標基因[14-15]。

蝦夷扇貝是中國重要的冷水性養(yǎng)殖貝類，開展對其科學、有效的育種和養(yǎng)殖工作是水產領域的重點工作之一。對蝦夷扇貝功能基因，包括生長[16]、生殖[17]和免疫[18]相關基因的研究是產業(yè)發(fā)展的基礎，并在近年來得到了一系列成果。特別最近蝦夷扇貝基因組的完成[19]，更是大大推動了蝦夷扇貝功能基因的研究。蝦夷扇貝每年經歷一個生殖周期，包括休止期，增殖期，生長期和成熟期四個時期[20]。筆者近期結合DNA甲基化水平和DNMT基因家族的表達模式，分析了蝦夷扇貝配子發(fā)生和早期發(fā)育過程中DNA甲基化的產生和維持[21]。本研究將從DNA去甲基化酶TET的角度，進一步探討蝦夷扇貝配子發(fā)生和早期發(fā)育中DNA去甲基化過程的發(fā)生。

1 材料方法

1.1 蝦夷扇貝TET基因的鑒定

人(Hs),小鼠(Mm),野豬(Ss),牛(Bt),美洲河貍(Cc),單峰駝(Cd)，原鴿(Cl),安氏蜂鳥(Ca)，鬃獅蜥(Pv),海龜(Cm)，非洲爪蟾(Xl),斑馬魚(Dr),青鳉(Nf),菜粉蝶(Pr),果蠅(Dm),太平洋牡蠣(Cg),美洲牡蠣(Cv),紫貽貝(Mg),帽貝(Lg)的TET蛋白序列下載自NCBI和Uniprot，其Accession Number見表1。用SMART在線軟件(http://smart.emblheidelberg.de/)預測這些蛋白的結構域。用blast軟件將這些TET蛋白的保守結構域序列比對到蝦夷扇貝的蛋白組數據庫(GenBank assembly accession: GCA_002113885.2)，比對參數為“blastall -p blastp -a 16 -v 10 -b 20 -e 1e-6”，獲得蝦夷扇貝候選TET基因，并用SMART預測蝦夷扇貝TET蛋白的結構域。用ClustalX使用默認參數進行結構域的比對，確定蝦夷扇貝TET蛋白序列中的保守殘基。使用TET蛋白全長構建系統發(fā)生樹，先用Protest預測出合適的氨基酸替換模型和參數(-m JTT+I+G+F -v 0.034 -a 1.414)，然后用PhyML軟件構建系統發(fā)生樹。

表1 各物種TET蛋白的序列信息

續(xù)表1

蛋白名稱Protein nameNCBI序列登記號Accession number物種(拉丁名)Species(Latin name)DrTET3A2CEA2斑馬魚(D. rerio)PyTETXP_021358783.1蝦夷扇貝(Patinopecten yessoensis)CgTETEKC18772.1太平洋牡蠣(Crassostrea gigas)CvTETXP_022313682.1美洲牡蠣(Crassostrea virginica)MgTETOPL33190.1紫貽貝(Mytilus galloprovincialis)LgTETXP_009060167.1帽貝(Lottia gigantea)DmTETNP_001246581.1果蠅(Drosophila melanogaster)NfTET1SBP47229.1青鳉(Nothobranchius furzeri)NfTET2SBP49038.1青鳉(N. furzeri)NfTET3SBP57161.1青鳉(N. furzeri)SsTET1AGI96745.1野豬(Sus scrofa)SsTET3AGI96747.1野豬(S. scrofa)BtTET2DAA28907.1牛(Bos taurus)PvTET1XP_020663651.1鬃獅蜥(Pogona vitticeps)PvTET2XP_020652070.1鬃獅蜥(P. vitticeps)PvTET3XP_020635782.1鬃獅蜥(P. vitticeps)CcTET1XP_020033190.1美洲河貍(Castor canadensis)CcTET2JAV39811.1美洲河貍(C. canadensis)CcTET3XP_020022002.1美洲河貍(C. canadensis)CdTET1XP_010984118.1單峰駝(Camelus dromedarius)CdTET2XP_010978962.1單峰駝(C. dromedarius)CdTET3XP_010987233.1單峰駝(C. dromedarius)CaTET1XP_008495875.1安氏蜂鳥(Calypte anna)CaTET2KFO97013.1安氏蜂鳥(C. anna)CaTET3XP_008498963.1安氏蜂鳥(C. anna)CmTET1XP_007054709.1海龜(Chelonia mydas)CmTET2XP_007054451.1海龜(C. mydas)CmTET3XP_007067519.1海龜(C. mydas)PrTETXP_022115477.1菜粉蝶(Pieris rapae)

1.2 蝦夷扇貝TET基因的表達模式

本研究中蝦夷扇貝TET基因的表達量由RNA-Seq數據計算得到。其中，配子發(fā)生過程中的表達數據來自本實驗室前期工作[22]。首先通過石蠟切片鑒定獲得休止期、增殖期、生長期和成熟期的精巢和卵巢，用異硫氰酸胍法提取性腺組織總RNA，然后使用VAHTS stranded mRNA-seq library prep kit for Illumina試劑盒構建RNA-Seq文庫并測序。早期發(fā)育時期的表達數據來自蝦夷扇貝基因組文章[19]，包括2～8細胞期、囊胚、原腸胚、擔輪幼蟲、D型幼蟲、早期殼頂幼蟲、中期殼頂幼蟲、后期殼頂幼蟲和稚貝的RNA-Seq數據。

表達量計算方法如下：先用STAR將RNA-Seq數據比對到蝦夷扇貝基因組[23]，之后用HTSeq-count統計每個基因上覆蓋的reads數[24]，基因的表達量(TPM)通過自行編寫的perl腳本計算獲得。

1.3 數據分析

用單因素方差分析檢測各性腺發(fā)育時期之間TET基因的表達差異。用t檢驗進行同一時期兩種性別的基因差異表達分析。P值小于0.05視為差異顯著。

1.4 組織原位雜交

為探究蝦夷扇貝性腺中表達PyTET基因的細胞類型，本研究開展了原位雜交實驗。用含有Sp6啟動子序列的正向引物和含有T7啟動子序列的反向引物擴增cDNA片段，以純化后的PCR產物為模板，分別用Sp6和T7聚合酶合成地高辛標記的正義探針和反義探針。原位雜交引物序列見表2。

將性腺組織切片在PBST(磷酸鹽緩沖鹽水，0.1% Tween-20)中連續(xù)再水化，并用2 μg/mL蛋白酶K在37 ℃下消化15 min。60 ℃預雜交4 h后，再用含1 μg/mL變性RNA探針的雜交緩沖液(50%甲酰胺，5×SSC，100 μg/mL酵母tRNA，1.5%封閉試劑，0.1% Tween-20)在60 ℃條件下雜交16 h。然后洗去探針，并在含有地高辛抗體的封閉緩沖液(1∶2 000稀釋)中4 ℃孵育16 h。用馬來酸緩沖液(0.1 mol/L馬來酸，0.15 mol/L NaCl，0.1% Tween-20，pH=7.5)充分洗滌后，將切片置于NBT/BCIP顯色液中避光顯色，最后用1%中性紅溶液復染觀察。

表2 原位雜交引物序列

2 實驗結果

2.1蝦夷扇貝TET基因的鑒定

用其他物種TET蛋白的加氧酶結構域比對到蝦夷扇貝蛋白組，發(fā)現蝦夷扇貝中存在一個TET同源蛋白，命名為PyTET。該蛋白由1 591個氨基酸組成，分子量為175 668 Do，等電點為8.57。PyTET基因由10個外顯子組成，其基因結構見圖1。蛋白結構域的預測結果顯示PyTET包含一個完整的2OGFeDO超家族的加氧酶結構域(見圖1)，該結構域與其他物種TET蛋白同源序列的相似度為46.59%～74.85%，并且和其他物種TET蛋白一樣，PyTET的保守結構域中包含鐵離子結合位點和2-氧代戊二酸結合殘基(見圖2)。TET蛋白序列的系統發(fā)生分析顯示，PyTET與軟體動物TET聚在一起，然后與節(jié)肢動物(果蠅和菜粉蝶)TET聚在一起，最后和脊椎動物的3個TET聚在一起(見圖3)。

(藍色表示編碼區(qū)，灰色表示非翻譯區(qū)，深綠色代表2OGFeDO超家族的加氧酶結構域。The blue and grey regions represent CDS and UTR, respectively. The oxygenase domain of the 2OGFeDO superfamily is highlighted in deep green. )

( 代表鐵離子結合位點，●代表2-氧代戊二酸結合殘基。 for iron ion binding site, ● for 2-oxoglutarate binding residues.)

圖3 TET蛋白的系統發(fā)生分析

2.2 PyTET基因在配子發(fā)生和早期發(fā)育中的表達模式

PyTET在精巢和卵巢中的表達呈現不同的趨勢。如圖4所示，在精巢中，從休止期到成熟期，PyTET基因的表達量呈現逐步下降的趨勢，在休止期最高，成熟期最低，休止期和增殖期的表達量顯著高于成熟期。原位雜交結果表明，PyTET基因在精原細胞、精母細胞中均有表達(見圖5a)。在卵巢中，PyTET基因在增殖期表達量最高，在生長期的表達量顯著高于休止期。原位雜交結果表明，PyTET基因主要在卵母細胞中表達，在卵原細胞中有微弱表達(見圖5b)。

PyTET基因在早期發(fā)育過程中的表達量如圖6所示，在多細胞期PyTET基因的表達量接近0，隨后表達量急劇升高，在囊胚期達到峰值；從原腸胚到D型幼蟲期表達量較低且趨于穩(wěn)定；進入殼頂期后PyTET基因表達量又開始逐漸下降，直至中期殼頂幼蟲；之后表達無明顯變化，一直維持到稚貝。

(不同字母表示差異顯著(P<0.05)。Different letters indicate significant differences (P<0.05).)

(a) PyTET在精巢中的定位；(b) PyTET在卵巢中的定位。(Sg：精原細胞；Sc：精母細胞；Og：卵原細胞；Oc：卵母細胞。(a) Localization of PyTET with an anti-sense probe in testes; (b) Localization of PyTET with an anti-sense probe in ovaries. Sg, spermatogonium; Sc, spermatocyte; Og, oogonium; Oc, oocyte.)

(基因表達量采用衡量指標為TPM。The measure of gene expression level TPM.)

3 討論

DNA甲基化現象廣泛存在于真核生物的各個類群，并在真核生物的生長發(fā)育過程中發(fā)揮重要的調控作用，因此DNA甲基化水平的調節(jié)對真核生物的生長發(fā)育十分關鍵。DNA甲基化水平的變化包括DNA去甲基化，DNA從頭甲基化，DNA甲基化的維持等過程，每個過程都有相應的酶發(fā)揮功能。在哺乳動物中，DNMT1/2/3[25-26]和TET/1/2/3[8, 11, 27]都已經被鑒定，對它們的功能也做了比較深入的研究。但在海洋軟體動物中，只有少數生物的DNMT基因被報道[28]，還未見關于TET基因的研究報道。本研究發(fā)現蝦夷扇貝只存在一個TET的同源基因，與蛻皮動物和其它冠輪動物類似。而脊椎動物基因組大多含有3個TET基因，各成員間的功能有所不同，TET1和TET2參與配子發(fā)生過程中的DNA去甲基化[13]，TET3參與胚胎發(fā)育過程中的DNA去甲基化[11-12]。PyTET基因在配子發(fā)生和胚胎發(fā)育過程中都有明顯的表達量變化，提示PyTET蛋白可能同時參與兩個發(fā)育過程中DNA的去甲基化。以上結果暗示，PyTET可能接近于TET基因家族的祖先形式，并同時具有脊椎動物不同TET蛋白的功能。

配子發(fā)生過程中DNA甲基化模式的重建包括DNA去甲基化和重新甲基化的兩個過程，在哺乳動物研究的比較深入，但在無脊椎動物，特別是海洋軟體動物中研究還比較欠缺。最近的研究報道了蝦夷扇貝配子發(fā)生過程中性腺整體DNA甲基化水平的變化和PyDNMT在該過程中的作用。但PyDNMT基因的表達僅能解釋DNA甲基化的形成和維持，對PyTET基因的表達分析有助于理解在蝦夷扇貝配子發(fā)生過程中DNA去甲基化的過程。在精子發(fā)生過程中，PyTET基因在休止期和增殖期的表達量較高，隨著精子的形成過程，其表達量逐步降低，在成熟期達到最低。由于休止期和增殖期的生殖細胞類型主要為精原細胞和精母細胞[20]，原位雜交結果也表明PyTET基因在這兩種細胞中均有表達，表明在蝦夷扇貝精子發(fā)生過程中，DNA的主動去甲基化過程可能發(fā)生在精原細胞和精母細胞中。在卵子發(fā)生過程中，PyTET基因表達量在休止期最低，增殖期開始升高，并一直維持到成熟期。與原位雜交結果觀察到的PyTET基因在卵原細胞有微弱表達，而在卵母細胞中有大量表達的結果一致。這里可能涉及到兩個DNA去甲基化的過程，第一個過程是卵原細胞中的PyTET參與了卵子發(fā)生過程中的DNA主動去甲基化過程，第二個過程是在初級卵母細胞中的PyTET，在精卵結合后，與哺乳動物TET3的相似，發(fā)揮著受精卵中DNA主動去甲基化的功能[11-12]。

蝦夷扇貝受精卵的DNA來源于精子和成熟卵，其DNA甲基化模式也同時被繼承，初級卵母細胞中表達大量PyTET基因可能與受精卵時期的DNA去甲基化過程有關，這一過程在哺乳動物中已有報道[29-31]。由于PyTET基因在2～8細胞期的表達量接近于0，與哺乳動物中的情況相同，推測這一過程可能在受精卵分裂之前已經完成。但不同的是在囊胚期，PyTET基因的表達突然升高，在隨后的原腸胚時期又降低，使囊胚期形成了PyTET基因的表達量高峰，這一現象表明，蝦夷扇貝可能在囊胚期發(fā)生了與哺乳動物不同的DNA去甲基化過程，這或許是海洋軟體動物中特有的現象。前期研究顯示，PyDNMT3在囊胚期的表達量也突然升高，基因組整體DNA甲基化水平在囊胚期也突然升高然后降低[21]。綜合以上結果，本研究者推測在蝦夷扇貝囊胚期可能發(fā)生了劇烈的DNA甲基化的重建，既包括DNA從頭甲基化，也包括DNA去甲基化，PyDNMT3和PyTET在其中發(fā)揮著重要作用。