hairy和hedgehog在單環(huán)刺螠幼蟲體節(jié)形成過程中的表達(dá)特征分析?

李 琦， 秦貞奎， 張婷婷， 魏茂凱， 侯西坦， 張志峰

(中國海洋大學(xué)海洋生物遺傳學(xué)與育種教育部重點實驗室，山東 青島 266003)

Hariy是Hes家族成員，其作為Notch信號通路的下游靶基因，參與神經(jīng)和體節(jié)的發(fā)育以及免疫和癌癥等生物學(xué)過程[1]。hairy參與體節(jié)形成已經(jīng)在幾種昆蟲中被驗證[2-6]；在環(huán)節(jié)動物小頭蟲(Capitellateleta)中hairy/hes1定位于體節(jié)產(chǎn)生區(qū)域，被認(rèn)為可能參與了體節(jié)形成過程[7]；在有爪動物櫛蠶(Euperipatoideskanangrensis)中，盡管hairy呈現(xiàn)條帶狀表達(dá)圖式，但因其在胚胎末端體節(jié)發(fā)生區(qū)域不表達(dá)，因而被認(rèn)為與體節(jié)形成無關(guān)[8]。

Hedgehog作為其信號通路中的配體參與眾多發(fā)育過程，如細(xì)胞增殖與定向分化，組織形態(tài)發(fā)生和體節(jié)極性維持等[8]。在果蠅(Drosophilamelanogaster)中，其首先被證明作為一種體節(jié)極性基因參與副體節(jié)和體節(jié)邊界的界定與維持[10]，相同的功能也在螯肢動物歐洲黃色尾蝎(Euscorpiusflavicaudis)、甲殼動物鹵蟲(Artemiafranciscana)以及環(huán)節(jié)動物褐片闊沙蠶(Platynereisdumerilii)中被驗證[11-12]。

單環(huán)刺螠(Urechisunicinctus)隸屬螠蟲動物門(Echiura)，主要分布于遠(yuǎn)東地區(qū)，是一種海洋經(jīng)濟(jì)無脊椎動物。其胚胎孵化后，歷經(jīng)擔(dān)輪幼蟲、體節(jié)幼蟲、蠕蟲狀幼蟲，然后變態(tài)成為幼螠；在由晚期擔(dān)輪幼蟲發(fā)育至早期體節(jié)幼蟲的過程中產(chǎn)生體節(jié)，在由體節(jié)幼蟲發(fā)育至蠕蟲狀幼蟲的過程中體節(jié)消失(見圖1)。謝躍洋報道單環(huán)刺螠的幼蟲體節(jié)僅是表皮分節(jié)[13]，這一特點與典型體節(jié)動物(節(jié)肢動物和環(huán)節(jié)動物)終生存在的體節(jié)不同，典型體節(jié)動物除了表皮分節(jié)外，其內(nèi)部主要組織器官(體腔、肌肉、循環(huán)系統(tǒng)、排泄系統(tǒng)等)均按節(jié)重復(fù)排布[14-15]。為了探討螠蟲動物幼蟲體節(jié)和典型體節(jié)動物體節(jié)發(fā)生和功能維持中的基因調(diào)控以及進(jìn)化關(guān)系，本研究以hairy和hedgehog為靶基因，揭示了它們在單環(huán)刺螠幼蟲體節(jié)形成過程中的表達(dá)特征。旨在為探究螠蟲動物幼蟲體節(jié)發(fā)生的分子機(jī)制和進(jìn)化等研究提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

單環(huán)刺螠成體來自山東省萊州灣。挑選腎管飽滿的雌、雄個體(平均體重為(28.7±8.6) g)，解剖并獲取成熟的兩性配子，以精卵比例10∶1進(jìn)行體外人工授精。將受精卵置于盛有200 L過濾海水的培養(yǎng)箱(855 mm×650 mm×595 mm)中進(jìn)行孵化(水溫為17.2 ℃，pH=7.8 ± 0.06，鹽度為29 ± 1)和前期培育。受精后24 h孵出擔(dān)輪幼蟲，投喂以小球藻(Chlorellavulgaris)和牟氏角毛藻(Cheatocerosmuelleri)，每天早晚分別投餌一次，并隨著幼蟲發(fā)育逐漸增加投餌量；至晚期體節(jié)幼蟲轉(zhuǎn)入泥沙底質(zhì)(厚約6 cm)中繼續(xù)培養(yǎng)。培養(yǎng)期間，定期于顯微鏡下觀察幼蟲的發(fā)育，并取中期擔(dān)輪幼蟲(受精后10 d)、晚期擔(dān)輪幼蟲(受精后25 d)、早期體節(jié)幼蟲(受精后30 d)，體節(jié)幼蟲(受精后33、37和40 d)和蠕蟲狀幼蟲(受精后45 d)于4%多聚甲醛中固定過夜，經(jīng)梯度甲醇脫水后保存于無水甲醇中(-20 ℃)，用于整體原位雜交。

(A：受精卵；B：囊胚；C：原腸胚；D：早期擔(dān)輪幼蟲(消化道打通之前)；E：中期擔(dān)輪幼蟲(消化道打通)F：晚期擔(dān)輪幼蟲(腹側(cè)體壁增厚)；G：早期體節(jié)幼蟲(腹側(cè)體壁分節(jié))；H～I(xiàn)：體節(jié)幼蟲(完全分節(jié))； J：蠕蟲狀幼蟲(分節(jié)消失)。E～H為側(cè)視圖；I和J為背視圖；星號示意口；左上角數(shù)字為受精后時間。A: Fertilized egg; B: Blastula; C: Gastrula; D: Early-trochophore larva (Before the digestive gut opening); E: Mid-trochophore larva (The digestive gut opening); F: Late-trochophore larva (With the thickened ventral body wall); G: Early-segmentation larva (With the segmented ventral body wall); H～I(xiàn): Segmentation larva (With the complete segments); J: Worm-shaped larva (The segments disappeared). E～H Are ventral view; I & J Are dorsal view. The asterisks point to the mouth. The top left number of each picture is the post fertilization time.)

圖1 單環(huán)刺螠早期發(fā)育

Fig.1 The early development ofU.unicinctus

1.2 總RNA提取和cDNA合成

收集晚期擔(dān)輪幼蟲約100只，使用MicroElute?Total RNA Kit (Omega, 美國)并按照操作指南提取其總RNA；使用PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser試劑盒(TaKaRa, 大連)并按照操作指南將總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，用于靶基因ORF擴(kuò)增。

1.3 Uu-hairy ORF擴(kuò)增及序列分析

從單環(huán)刺螠幼蟲轉(zhuǎn)錄組中獲得hairycDNA 片段序列，設(shè)計ORF擴(kuò)增引物(見表1)。以上述cDNA為模板，PCR擴(kuò)增獲得其ORF全長序列，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測、膠回收、連接pClone007載體、轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α后，挑取單菌落進(jìn)行PCR驗證，然后送往華大基因測序。使用DMAMAN軟件對Hairy蛋白進(jìn)行氨基酸多序列比對，通過NCBI在線BLAST程序(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/)進(jìn)行同源性分析，使用MEGA 7.0 軟件采用Neighbor Joining法構(gòu)建進(jìn)化樹，Bootstrap設(shè)置為1 000。

1.4 目的基因定量表達(dá)分析

從單環(huán)刺螠幼蟲轉(zhuǎn)錄組中挑出靶基因，以它們的FPKM值作為表達(dá)量，計算各發(fā)育時期幼蟲(晚期擔(dān)輪幼蟲(L，受精后25 d)，早期體節(jié)幼蟲(E，受精后30 d)，體節(jié)幼蟲(S，受精后35 d)和蠕蟲狀幼蟲(W，受精后42 d))中FPKM的平均值(n=3)。使用SPSS Statistic軟件并采用單因素方差分析(One-Way ANOVE)和Tukey’s HSD檢驗法對各期幼蟲靶基因的表達(dá)量進(jìn)行統(tǒng)計分析，顯著性差異水平設(shè)定為P<0.05。

1.5 整體原位雜交

根據(jù)單環(huán)刺螠hariy(GenBank序列號：MK353161)和hedgehog(GenBank序列號：KY773909)ORF序列設(shè)計探針合成引物(見表1)，PCR擴(kuò)增分別獲得長度為436 bp (Uu-hariy)和487 bp(Uu-hedgehog)的序列。以該序列為模板，使用DIG RNA Labeling kit(Roche，瑞士)并按照操作指南合成地高辛標(biāo)記的RNA 正義和反義探針。取保存于無水甲醇中的各時期幼蟲，經(jīng)梯度甲醇復(fù)水后于100 ng/mL蛋白酶K 37 ℃消化20 min(擔(dān)輪幼蟲)或者400 ng/mL蛋白酶K 37 ℃消化30 min(體節(jié)幼蟲)；預(yù)雜交條件為60 ℃下6 h，然后加入DIG標(biāo)記的RNA探針于60 ℃雜交過夜；經(jīng)過洗滌和blocking buffer封閉后，加入DIG抗體4 ℃孵育過夜；再于NBT/BCIP體系中顯色；最終樣本于Nikon E80i 顯微鏡下觀察和拍照。

表1 本研究中所用引物序列

2 結(jié)果

2.1單環(huán)刺螠hairy的序列特征分析

由于周頔[16]已報道了單環(huán)刺螠hedgehog的序列特征，因此本研究僅對單環(huán)刺螠hairy的序列特征進(jìn)行分析。

單環(huán)刺螠hairy開放閱讀框(Open reading frame，ORF)長度為888 bp，編碼295個氨基酸。多序列比對結(jié)果顯示，單環(huán)刺螠預(yù)測蛋白的氨基酸序列中含有Hairy蛋白保守的HLH結(jié)構(gòu)域、Hairy_Orange結(jié)構(gòu)域和保守的四肽WRPW(見圖2)。

(HLH結(jié)構(gòu)域、Hairy_Orange結(jié)構(gòu)域和保守四肽WRPW分別用方框標(biāo)記。HLH motif, Hairy_Orange motif and tetrapeptide WRPW are boxed.)

同源性分析表明，Uu-Hariy蛋白與小頭蟲(C.teleta)和黑腹果蠅(D.melanogaster)的Hairy序列一致性分別為69%和57%；與脊椎動物人(Homosapiens)和斑馬魚(Daniorerio)的序列一致性均為54%。系統(tǒng)進(jìn)化分析發(fā)現(xiàn)Uu-Hairy首先與小頭蟲Hairy聚為一簇，隨后與其他物種Hairy聚合，最后與Hes家族聚合(見圖3)。

圖3 不同物種Hes家族蛋白系統(tǒng)進(jìn)化分析

2.2 hairy和hedgehog在單環(huán)刺螠幼蟲中的定量表達(dá)

單環(huán)刺螠的幼蟲體節(jié)是在晚期擔(dān)輪幼蟲向早期體節(jié)幼蟲發(fā)育過程中形成的；在由早期體節(jié)幼蟲發(fā)育至體節(jié)幼蟲期間，幼蟲體節(jié)逐漸完善；在由體節(jié)幼蟲向蠕蟲狀幼蟲的發(fā)育過程中幼蟲體節(jié)消失。分析單環(huán)刺螠幼蟲轉(zhuǎn)錄組中hairy和hedgehog的FPKM值，發(fā)現(xiàn)兩個靶基因在四個發(fā)育時期幼蟲中均表達(dá)，其表達(dá)量均隨幼蟲發(fā)育逐漸升高。其中hairy在早期體節(jié)幼蟲中的表達(dá)量較晚期擔(dān)輪幼蟲顯著增加，約提高1.4倍，之后的各期幼蟲中未見顯著差異；hedgehog在體節(jié)幼蟲中的表達(dá)量較早期體節(jié)幼蟲顯著增加，約提高1.3倍(見圖4)。

2.3 hairy和hedgehog在單環(huán)刺螠幼蟲中的定位表達(dá)

整體原位雜交結(jié)果顯示，單環(huán)刺螠hairy和hedgehog的mRNA均在中期擔(dān)輪幼蟲纖毛環(huán)和口處呈現(xiàn)明顯的陽性信號(見圖5 A1、A2)；至晚期擔(dān)輪幼蟲，靶基因在其下半球處呈現(xiàn)條帶狀表達(dá)模式(見圖5 B1、B2)，這種條帶狀分布特點一直維持到體節(jié)幼蟲，并且隨著發(fā)育表達(dá)條帶更加清晰(見圖5 C1～F1、C2～F2)；至蠕蟲狀幼蟲，靶基因的條帶狀表達(dá)模式消失，轉(zhuǎn)而彌散于體壁及消化道處(見圖5 G1、G2)。但未見hairy的體節(jié)間隔式表達(dá)特征。

(L：晚期擔(dān)輪幼蟲；E：早期體節(jié)幼蟲；S：體節(jié)幼蟲；W：蠕蟲狀幼蟲；所有數(shù)據(jù)均為平均值(n=3)，同一基因不同字母表示不同時期幼蟲中的表達(dá)量存在顯著性差異(P<0.05)。L: late-trochophore larva; E early-segmentation larva; S: segmentation larva; W: worm-shaped larva; Date are indicated as the mean from three independent samples with duplicates. For each gene, different letters indicate significant differences(P<0.05)among the larvae at the different stages.)

圖4 單環(huán)刺螠幼蟲發(fā)育過程中hairy和hedgehog的表達(dá)量

Fig.4 Expression levels ofhairyandhedgehoginU.unicinctusduring the larval development

(A：中期擔(dān)輪幼蟲；B：晚期擔(dān)輪幼蟲；C：早期體節(jié)幼蟲；D～F：體節(jié)幼蟲；G：蠕蟲狀幼蟲。A～E：腹面觀，F(xiàn)、G：側(cè)面觀。星號指示口的位置。A: mid-trochophore larva; B: late-trochophore larva; C: early-segmentation larva; D～F: segmentation larva; G: worm-shaped larva. A～E are ventral view; F & G are lateral view. The asterisks point to the mouth.)

圖5hairy和hedgehog在單環(huán)刺螠幼蟲中的原位雜交檢測

Fig.5 Location ofhairyandhedgehogmRNA inU.unicinctuslarvae detected by whole mountinsituhybridization

3 討論

本研究獲得的單環(huán)刺螠靶序列 ORF全長888 bp，其預(yù)測氨基酸序列中含有Hes家族蛋白保守的HLH結(jié)構(gòu)域(與DNA結(jié)合后調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄)、Hairy_Orange結(jié)構(gòu)域(調(diào)節(jié)Hes蛋白異源二聚體形成)和C端保守四肽(轉(zhuǎn)錄抑制域)；同時還具有Hairy的保守特征，即：在其HLH結(jié)構(gòu)域第6位是脯氨酸，其C端四肽是WRPW[2,5,7]；初步確定本研究獲得的靶序列是單環(huán)刺螠hairyORF全長。比較不同物種Hariy保守結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列一致性發(fā)現(xiàn)，HLH結(jié)構(gòu)域序列的保守性高于Hairy_Orange結(jié)構(gòu)域；反映了與DNA結(jié)合并調(diào)控轉(zhuǎn)錄的HLH結(jié)構(gòu)域在各物種間更加保守，而調(diào)節(jié)Hes蛋白二聚體形成的Hairy_Orange結(jié)構(gòu)域序列則具物種間特異性。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，單環(huán)刺螠Hairy的HLH結(jié)構(gòu)域、Hairy_Orange結(jié)構(gòu)域以及整個氨基酸序列均與環(huán)節(jié)動物小頭蟲對應(yīng)序列之間的一致性最高，分別為81.03%、57.14%和69%，提示單環(huán)刺螠可能與環(huán)節(jié)動物小頭蟲親緣關(guān)系最近。

hairy調(diào)控體節(jié)發(fā)生的功能已在多種節(jié)肢動物中報道。在長胚基昆蟲果蠅(D.melanogaster)中，hairy呈現(xiàn)體節(jié)間隔的表達(dá)模式，由此被定義為成對控制基因[2-4]。然而，在短胚基昆蟲雜擬谷盜(Triboliumconfusum)和中胚基昆蟲白腹皮蠹(Gryllusbimaculatus)以及多足綱球馬陸(Glomerismarginata)和蛛形綱游走蛛(Cupienniussalei)中，hairy定位于每一個體節(jié)中，而非果蠅中的間隔體節(jié)表達(dá)特征[5-6, 17-19]。在環(huán)節(jié)動物沙蠶、小頭蟲和有爪動物櫛蠶中，hariy/hes也呈現(xiàn)按節(jié)分布的條帶狀表達(dá)模式[7-8, 20]，可見大部分體節(jié)物種中hairy均呈現(xiàn)按節(jié)分布的表達(dá)特點。本研究結(jié)果顯示，單環(huán)刺螠hairy自晚期擔(dān)輪幼蟲開始便呈現(xiàn)條帶狀表達(dá)，至體節(jié)幼蟲時定位于每一個幼蟲體節(jié)的邊界處。這一表達(dá)特征與中、短胚基昆蟲、有爪動物和環(huán)節(jié)動物等典型體節(jié)動物中的表達(dá)模式基本一致，但不同于果蠅中的體節(jié)間隔表達(dá)模式。

Bianchi-Frias等[4]揭示，在hairy突變的果蠅中，hairy下游基因表達(dá)區(qū)域擴(kuò)大并失去體節(jié)極性，導(dǎo)致全部體節(jié)不能發(fā)生；在雜擬谷盜中，hairy調(diào)控其頭節(jié)分化與發(fā)育[5]；在白腹皮蠹中，hairy則調(diào)控腹節(jié)形成[6]。在環(huán)節(jié)動物小頭蟲中，hairy/hes1信號定位于體節(jié)形成區(qū)域，并略早或同步于體節(jié)形成過程，因而被認(rèn)為可能參與其體節(jié)形成[7]；在有爪動物櫛蠶中，hairy信號并不定位于胚胎末端的體節(jié)形成區(qū)域且其條帶狀信號出現(xiàn)時體節(jié)已經(jīng)形成，因而被認(rèn)為不參與體節(jié)形成[8]。在單環(huán)刺螠幼蟲體節(jié)形成過程中，條帶狀hairy信號早于體節(jié)形成過程出現(xiàn)并主要定位于即將形成體節(jié)的幼蟲下半球，這與小頭蟲中情況較為一致；由此，本研究者推測hairy可能參與了單環(huán)刺螠幼蟲體節(jié)形成過程。然而，hairy在單環(huán)刺螠幼蟲體節(jié)形成過程中所發(fā)揮的具體功能及調(diào)控區(qū)域尚不明確，仍需后續(xù)實驗驗證。

在節(jié)肢動物和環(huán)節(jié)動物中，hedgehog定位于副體節(jié)或體節(jié)的邊界處，參與體節(jié)邊界的界定和維持，由此被確定是一個保守的體節(jié)極性基因[9-12]。本研究結(jié)果顯示，hedgehog在單環(huán)刺螠尚未發(fā)生形態(tài)可見的幼蟲體節(jié)之前(晚期擔(dān)輪幼蟲)便呈條帶狀表達(dá)特征，當(dāng)發(fā)育至體節(jié)幼蟲時其定位于幼蟲體節(jié)的邊界。提示hedgehog在單環(huán)刺螠幼蟲體節(jié)中的功能與已報道典型體節(jié)物種中的功能一致，即參與幼蟲體節(jié)的邊界維持[12]。

謝躍洋[13]基于組織學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)，單環(huán)刺螠幼蟲體節(jié)形成模式類似于小頭蟲的側(cè)增殖帶法，據(jù)此提出單環(huán)刺螠與環(huán)節(jié)動物小頭蟲親緣關(guān)系最近。本研究通過對單環(huán)刺螠hairy和hedgehog序列特征及其在幼蟲體節(jié)發(fā)生過程中的表達(dá)圖式分析，發(fā)現(xiàn)其均與環(huán)節(jié)動物小頭蟲的特征最接近，本研究結(jié)果也謝躍洋的觀點一致。