五指山豬背最長(zhǎng)肌和半腱肌DNA甲基化檢測(cè)分析

晁 哲，孫瑞萍，劉海隆，邢漫萍，鄭心力

（1.海南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，海南 ?？?571100；2.海南省家畜家禽工程技術(shù)研究中心，海口 571100）

表觀遺傳（Epigenetic inheritance）是指在不改變DNA序列的情況下，基因表達(dá)模式發(fā)生可遺傳的變化。換言之，它是一種DNA序列之外的遺傳方式。表觀遺傳學(xué)（Epigenetics）則是研究不涉及DNA序列改變的基因表達(dá)、調(diào)控的可遺傳變化機(jī)制，或者說(shuō)是研究從基因演繹為表型的過(guò)程和機(jī)制的新興遺傳學(xué)分支。迄今為止，表觀遺傳學(xué)研究的主要內(nèi)容包括DNA甲基化、組蛋白修飾、染色質(zhì)結(jié)構(gòu)、X染色體失活和非編碼RNA調(diào)控等。DNA甲基化對(duì)骨骼肌發(fā)生具有重要的調(diào)控作用，它參與調(diào)節(jié)肌肉發(fā)育及再生過(guò)程中相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄[1-2]，其中最典型的例子是對(duì)MyoD基因表達(dá)的調(diào)節(jié)。MyoD選擇性地在骨骼肌細(xì)胞表達(dá)，在非骨骼肌細(xì)胞中，DNA甲基化可以阻止MyoD的表達(dá)。實(shí)際上，去甲基化試劑能夠誘導(dǎo)非骨骼肌細(xì)胞表達(dá)MyoD，并向骨骼肌細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)化。此外，DNA甲基化可以聯(lián)合組蛋白乙?；揎椆餐刂乒趋兰〉睦w維類(lèi)型。在肌肉再生過(guò)程中，肌衛(wèi)星細(xì)胞的激活受到表觀遺傳調(diào)控[3]，但DNA甲基化在其中的作用機(jī)制有待于進(jìn)一步研究。甲基敏感擴(kuò)增多態(tài)性（Methylation sensitive amplification polymorphism,MSAP）是由擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性技術(shù)（Amplified fragment length polymorphism,AFLP）改進(jìn)后形成的，該方法使用甲基化敏感性內(nèi)切酶代替AFLP中使用的內(nèi)切酶，其余技術(shù)路線不變。本研究采用MSAP方法對(duì)五指山豬肌肉甲基化狀態(tài)進(jìn)行研究，探討DNA甲基化在豬肌肉發(fā)育過(guò)程中的作用機(jī)制，為五指山豬基因組的甲基化研究積累數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)時(shí)間與地點(diǎn)

試驗(yàn)于2017年10月16日至2018年11月22日在海南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所進(jìn)行。

1.2 試驗(yàn)材料

選擇1月齡、2月齡、4月齡的五指山豬各3頭，采集背最長(zhǎng)肌和半腱肌后利用基因組提取試劑盒提取基因組DNA，-20℃保存。9頭五指山豬全部來(lái)自海南國(guó)家級(jí)五指山豬保種場(chǎng)。

1.3 引物與接頭

引物與接頭（表1）的設(shè)計(jì)參考徐青等[4]所用的方法。引物與接頭由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

表1 用于MSAP分析的引物與接頭序列

1.4 MSAP分析

MSAP分析包括4個(gè)主要部分：酶切反應(yīng)、連接反應(yīng)、擴(kuò)增反應(yīng)和產(chǎn)物檢測(cè)。對(duì)每份肌肉組織DNA樣本，分別用Eco RⅠ+MspⅠ和Eco RⅠ+HpaⅡ兩種組合進(jìn)行酶切，連上接頭，分別用預(yù)擴(kuò)增引物和選擇性擴(kuò)增引物進(jìn)行2輪擴(kuò)增，設(shè)計(jì)選擇性引物組合10對(duì)進(jìn)行第2輪擴(kuò)增。

預(yù)擴(kuò)增反應(yīng)：反應(yīng)總體系為25μL，其中連接產(chǎn)物1μL，EcoRⅠ和M-H預(yù)擴(kuò)增引物各30 ng，dNTP 0.5μL（10 mmol/L），10×PCR buffer 2.5μL，鎂離子（Mg2+）2.0μL（25 mmol/L），Taq DNA聚合酶1μL（1 U/μL），加滅菌后的去離子水補(bǔ)足25μL。PCR程序?yàn)椋?4℃預(yù)熱4min；94℃變性40 s，56℃退火60 s，72℃延伸60 s，共30個(gè)循環(huán)；72℃延伸7min。

選擇性擴(kuò)增反應(yīng)：反應(yīng)總體系為25μL，其中預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物0.2μL，Eco RⅠ和M-H選擇性擴(kuò)增引物各30 ng，dNTP 0.5μL（10 mmol/L），10×PCR buffer 2.5μL，Mg2+2.0μL（25 mmol/L），Taq DNA聚合酶1μL（1 U/μL），加滅菌后的去離子水至25μL。PCR程序?yàn)椋?4℃預(yù)熱4 min；94℃變性40 s，65℃（每個(gè)循環(huán)遞減0.7℃）退火30 s，72℃延伸60 s，共進(jìn)行13個(gè)遞減循環(huán)；然后94℃變性40 s，56℃退火30 s，72℃延伸60 s，共23個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸7 min。

PCR產(chǎn)物電泳及銀染：擴(kuò)增后產(chǎn)物經(jīng)4%聚丙烯酰胺凝膠電泳及硝酸銀染色后，統(tǒng)計(jì)凝膠上各種模式的片段，詳細(xì)過(guò)程參考Xu等[5]所用的方法。

2 結(jié)果與分析

2.1 五指山豬肌肉組織基因組DNA檢測(cè)

通過(guò)1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)提取的五指山豬肌肉組織基因組DNA（圖1），其片段大小均符合要求。采用微量紫外分光光度儀對(duì)DNA的OD值進(jìn)行檢測(cè)，提取的18個(gè)肌肉組織基因組DNA，其OD值和濃度匯總于表2，所有DNA的A260/A280值都在1.8～2.0之間，從濃度上看，所有DNA樣品均可以用于后續(xù)的試驗(yàn)。

表2 微量紫外分光光度儀檢測(cè)DNA結(jié)果

2.2 五指山豬肌肉組織甲基化分析

以10對(duì)選擇性引物分別擴(kuò)增五指山豬背最長(zhǎng)肌和半腱肌樣品，通過(guò)擴(kuò)增出的多態(tài)性條帶數(shù)計(jì)算出樣品的甲基化率（表3）。1月齡五指山豬背最長(zhǎng)肌的甲基化百分率介于42.37%～47.38%，平均為44.78%；2月齡五指山豬背最長(zhǎng)肌的甲基化百分率介于39.00%～42.98%，平均為41.58%；4月齡五指山豬背最長(zhǎng)肌的甲基化百分率介于36.32%～40.98%，平均為38.92%。1月齡、2月齡、4月齡五指山豬半腱肌的平均甲基化百分率分別是41.70%、39.39%、38.81%。

表3 五指山豬肌肉組織甲基化水平

3 討論

MSAP是在AFLP技術(shù)基礎(chǔ)上改進(jìn)后應(yīng)用于DNA甲基化研究的方法，MSAP用甲基敏感性內(nèi)切酶HpaⅡ和MspⅠ代替AFLP的高頻內(nèi)切酶MseⅠ處理基因組，并設(shè)計(jì)相應(yīng)的接頭和引物，酶切后的基因組經(jīng)擴(kuò)增后，就會(huì)產(chǎn)生甲基化敏感的多態(tài)性譜帶。MSAP相對(duì)于其他檢測(cè)DNA甲基化程度的技術(shù)有3個(gè)主要優(yōu)點(diǎn)：①不需要知道被測(cè)DNA的序列信息，在不同物種上具有通用性，可用于檢測(cè)基因組序列未知的生物；②敏感性強(qiáng)，只需要常規(guī)的儀器，操作相對(duì)簡(jiǎn)便；③可在全基因組范圍檢測(cè)CCGG位點(diǎn)的胞嘧啶甲基化變化[6]。

肌肉組織學(xué)特性一般包括：肌纖維類(lèi)型、肌纖維密度、肌纖維直徑、肌纖維面積、肌內(nèi)脂肪含量等，這些因素都與肉質(zhì)性狀緊密相關(guān)，并且相互之間也不是獨(dú)立的，其中肌纖維類(lèi)型是聯(lián)系這些組織學(xué)特征的決定因素。肌纖維在出生后還會(huì)經(jīng)過(guò)一個(gè)成熟的過(guò)程，這個(gè)過(guò)程主要涉及到肌纖維類(lèi)型的轉(zhuǎn)變。早在20世紀(jì)70年代，人們已經(jīng)開(kāi)始根據(jù)不同酶組織化學(xué)染色法對(duì)骨骼肌進(jìn)行分類(lèi)。目前公認(rèn)的分類(lèi)方法是根據(jù)肌球蛋白重鏈的不同亞型將肌纖維分為4種類(lèi)型：慢速氧化型肌纖維，即Ⅰ型肌纖維；快速氧化型，即Ⅱa型肌纖維；快速酵解型，即Ⅱb型肌纖維；中間型，即Ⅱx型肌纖維[7]。在本研究中，我們檢測(cè)了不同月齡五指山豬背最長(zhǎng)肌和半腱肌的甲基化程度，背最長(zhǎng)肌主要是Ⅱb型肌纖維，半腱肌主要是Ⅰ型肌纖維，兩種肌肉類(lèi)型雖然不同，但在生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中，其平均甲基化率都成遞減趨勢(shì)。DNA甲基化和mRNA表達(dá)密切相關(guān)，通常認(rèn)為高甲基化密度抑制基因表達(dá)，低甲基化密度促進(jìn)基因表達(dá)，1月齡五指山豬背最長(zhǎng)肌和半腱肌的平均甲基化率高于2月齡和4月齡，說(shuō)明2月齡和4月齡肌肉發(fā)育相關(guān)基因表達(dá)比較活躍。

在中國(guó)的地方豬種資源中，小型豬品種主要有6個(gè)，分別是海南五指山豬、廣西巴馬香豬、云南版納微型豬、貴州香豬、甘肅蕨麻小型豬和藏豬[8]。小型豬作為重要的產(chǎn)肉動(dòng)物和醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，在生產(chǎn)和科研上都具有重要價(jià)值。伴隨著后基因組時(shí)代的來(lái)臨，表觀遺傳學(xué)的研究已成為生命科學(xué)研究的熱點(diǎn)和發(fā)展前沿，下一步我們將對(duì)肌肉組織基因組DNA甲基化片段進(jìn)行回收、克隆測(cè)序，并通過(guò)生物信息學(xué)分析，確定這些甲基化片段所屬的基因，期望發(fā)現(xiàn)與肉質(zhì)性狀相關(guān)的功能基因，為更好地開(kāi)展五指山豬遺傳改良提供新的思路并奠定基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

在生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中，五指山豬背最長(zhǎng)肌和半腱肌DNA甲基化處于動(dòng)態(tài)變化中，兩種肌肉在1月齡時(shí)，其平均甲基化率均高于2月齡和4月齡。