糖尿病腎病動(dòng)物模型研究進(jìn)展*

田 雄 鄭敬民

(浙江省臺(tái)州醫(yī)院，臺(tái)州 317000)

糖尿病腎病(diabetic nephropathy，DN)是糖尿病主要的慢性并發(fā)癥之一，也是導(dǎo)致終末期腎病的主要原因。DN臨床早期表現(xiàn)為腎小球?yàn)V過(guò)率減少，后期出現(xiàn)蛋白尿增多、動(dòng)脈血壓升高和體液潴留，最終導(dǎo)致腎衰竭，并出現(xiàn)尿毒癥等癥狀，嚴(yán)重危害人類健康?？刂蒲羌把獕耗軌驕p緩糖尿病患者向終末期腎病轉(zhuǎn)化，但目前臨床上尚缺乏新的治療方法醫(yī)治糖尿病腎病[1-2]，其最根本的原因是對(duì)糖尿病腎病的發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明。建立適當(dāng)?shù)膭?dòng)物模型，可以為研究DN的病因、發(fā)病機(jī)制和病理生理改變提供重要的線索，同時(shí)也為臨床治療DN提供理論依據(jù)[3]。糖尿病并發(fā)癥聯(lián)盟及動(dòng)物模型腎病小組委員會(huì)(AMDCC)基于人類DN的臨床和病理特征，概括了以下關(guān)于DN的嚙齒動(dòng)物模型的驗(yàn)證標(biāo)準(zhǔn)：(1)腎臟功能退化50%；(2)蛋白尿增加10倍以上；(3)病理特征包括血管基質(zhì)擴(kuò)張(+/結(jié)節(jié))，腎小球基底膜增厚，小動(dòng)脈透明質(zhì)和管狀纖維化[4]。一個(gè)理想的糖尿病腎病模型應(yīng)該符合所有這些標(biāo)準(zhǔn)。然而，目前的各類動(dòng)物模型并未完全滿足以上標(biāo)準(zhǔn)，無(wú)法理想地復(fù)制出人類DN，這也解釋了諸多在臨床前期試驗(yàn)中有益的療法，在臨床應(yīng)用中被證明無(wú)效的原因[5]。因此，尋找并構(gòu)建能真實(shí)模擬人類DN主要特征的動(dòng)物模型，仍然是未來(lái)有意義的研究方向。本文將現(xiàn)有DN模型加以綜述，比較其優(yōu)缺點(diǎn)，以期未來(lái)能復(fù)制出理想的DN動(dòng)物模型，為DN的防治和研究提供有效的途徑。

1 誘發(fā)性DN動(dòng)物模型

誘發(fā)性模型相比于自發(fā)性動(dòng)物及轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型，成本低廉，操作方便，應(yīng)用比較廣泛常見(jiàn)的有化學(xué)藥物誘導(dǎo)、高糖高脂飲食誘導(dǎo)以及化學(xué)藥物和高脂飲食聯(lián)合誘導(dǎo)、化學(xué)藥物聯(lián)合手術(shù)等手段[6]。

1.1 化學(xué)藥物誘導(dǎo)DN模型

最早的化學(xué)藥物誘導(dǎo)的 DN 模型是由Naccarator等[7]在1964年使用四氧嘧啶誘導(dǎo)建立。目前該類模型最常見(jiàn)的是由鏈脲佐菌素(STZ)、四氧嘧啶(ATX)作為主要藥物誘導(dǎo)而成。STZ和ATX對(duì)胰島細(xì)胞有很強(qiáng)的選擇性殺傷作用,其中 STZ通過(guò)影響葡萄糖激酶的功能，誘導(dǎo)DNA雙鏈的斷裂，高特異性殺傷胰島β細(xì)胞，使細(xì)胞內(nèi)胰島素合成受損，導(dǎo)致胰島素分泌缺乏。STZ應(yīng)用較為廣泛，適用于多種大小鼠模型且DN模型制備時(shí)間短，但此類模型腎臟病變比較溫和，而且STZ本身的非特異性毒性會(huì)干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果判斷[8]。

造模方法：最常用的使用SD及Wistar大鼠，小鼠作為造模對(duì)象也有相關(guān)報(bào)道。STZ腹腔注射劑量為50～75 mg/kg體質(zhì)量，病程為4～24周。動(dòng)物從4周開(kāi)始出現(xiàn)腎臟早期病變，系膜基質(zhì)擴(kuò)張，基底膜增厚。隨病程延長(zhǎng)，后期可出現(xiàn)腎間質(zhì)小血管玻璃樣變等腎小管及間質(zhì)病理改變，模型鼠尿蛋白排泄率增加[9]。

1.2 合并性誘導(dǎo)DN模型

為加快腎臟病理變化，縮短實(shí)驗(yàn)周期，不同研究者對(duì)原有單一藥物誘導(dǎo)的DN模型加以改進(jìn)，結(jié)合單側(cè)或部分腎切除、高糖高脂誘導(dǎo)等手段，加速糖尿病腎病進(jìn)展。

Melissa等[10]在DN相對(duì)耐受的C57Bl/6 (B6)小鼠中，利用STZ結(jié)合單側(cè)腎切除術(shù)，成功地建立了Ⅰ型糖尿病腎病模型。研究人員對(duì)6周齡C57BL6/J 小鼠行左側(cè)腎切除術(shù)后，每只小鼠隔日注射50 mg/kg STZ，共3次。12周后，與對(duì)照組相比，模型組小鼠血糖水平差異顯著，24 h蛋白尿明顯增加；模型組小鼠腎小球肥大且損傷嚴(yán)重，腎小球系膜基質(zhì)擴(kuò)張， TGF-β1、cTGF、Collagen IV等纖維化標(biāo)志物的表達(dá)水平明顯升高。

2 自發(fā)性動(dòng)物模型

自發(fā)性動(dòng)物模型是沒(méi)有經(jīng)過(guò)任何人為干預(yù)，在自然情況下由于基因突變或染色體畸變等發(fā)生的DN模型。相比于誘導(dǎo)模型，自發(fā)性模型在一定程度上減少了人為因素，其發(fā)病原理及特征更切近人類DN。但此類模型種類有限，疾病動(dòng)物飼養(yǎng)條件要求高，發(fā)病率低，病程長(zhǎng)，價(jià)格較高[11]。

2.1 NOD (non-obese diabetic mouse)小鼠

NOD小鼠來(lái)源于ICR小鼠，它通過(guò)自身免疫系統(tǒng)破壞胰島細(xì)胞，小鼠胰腺在4～5周自發(fā)出現(xiàn)不同程度的炎癥反應(yīng)，到24～30周齡時(shí)多數(shù)胰腺β細(xì)胞遭到破壞出現(xiàn)糖尿病，37周齡時(shí)NOD小鼠可發(fā)展為DN，主要表現(xiàn)為蛋白尿增加、腎臟病理學(xué)變化、系膜細(xì)胞增生、腎小球毛細(xì)血管基底膜增厚、細(xì)胞外基質(zhì)增多、最后出現(xiàn)腎小球硬化[12]。

2.2 胰島素-2 Akita小鼠

此小鼠在Ins2(C96Y)中有一個(gè)突變，導(dǎo)致胰島素2 A、B鏈間無(wú)法正確地形成二硫鍵，導(dǎo)致胰島素構(gòu)象發(fā)生劇烈的變化，同時(shí)對(duì)胰腺β細(xì)胞產(chǎn)生蛋白毒性，導(dǎo)致β細(xì)胞團(tuán)減少，分泌胰島素的能力減弱。4周齡Akita小鼠就出現(xiàn)明顯的高血糖癥、高水平的白蛋白尿以及持續(xù)的組織學(xué)變化。另外，Akita小鼠還會(huì)出現(xiàn)高血壓及心臟衰竭等糖尿病并發(fā)癥[13]。

2.3 KK-Ay 小鼠

這種小鼠最早由日本學(xué)者近藤恭司和西村正彥將Ay基因?qū)隟K小鼠體內(nèi)建立。與KK小鼠相比，KK-Ay 小鼠早期會(huì)出現(xiàn)重度肥胖及高血糖，且模型小鼠腎臟損傷與人類2型糖尿病腎臟損傷非常相似，可作為2型糖尿病模型動(dòng)物。因KK-Ay 小鼠體毛呈黃色，也有人稱其為yellow KK[14]。Ito等[15]報(bào)道了 KK-Ay小鼠腎小球的病理變化與人類DN早期階段的病理變化一致。該研究發(fā)現(xiàn)，KK-Ay小鼠的尿蛋白/肌酐比率明顯高于非糖尿病的BALB/c小鼠，其HbA1c的含量也明顯高于BALB/c小鼠(p<0.001)。AS和酸-甲胺銀染色結(jié)果表明，20周齡KK-Ay小鼠的腎小球中發(fā)生節(jié)段性硬化，而且AGEs和TGF-β定位在腎小球系膜區(qū)。

2.4 BB大鼠

此種大鼠是由Wistar大鼠經(jīng)篩選而得，可作為自身免疫性胰島素依賴性糖尿病動(dòng)物模型，其腎臟病理改變較輕微且周期較長(zhǎng)，18個(gè)月才出現(xiàn)腎小球基底膜增厚，系膜容量增加。而尿蛋白及白蛋白排泄沒(méi)有出現(xiàn)明顯的改變，GFR卻明顯增加[16]。

3 基因工程小鼠模型

基因工程小鼠遺傳背景清晰，造模時(shí)間短。利用基因工程技術(shù)，可以便利地在動(dòng)物基因組特定位點(diǎn)引入突變基因或?qū)⒛骋换蚯贸?，以此研究特定基因在?dòng)物發(fā)生與發(fā)育過(guò)程中的作用。但由于人類DN的發(fā)病機(jī)制和遺傳決定因素的闡述尚不完善，將相關(guān)的基因或遺傳變異納入模型，不能完全真實(shí)地反映人類DN。

3.1 eNOS 敲除鼠

在db/db小鼠中，eNOS基因敲除會(huì)導(dǎo)致高血壓和內(nèi)皮功能障礙，并加速腎臟的損傷，可表現(xiàn)為早發(fā)性蛋白尿、小動(dòng)脈透明質(zhì)化以及腎小球?yàn)V過(guò)率下降50%。26周后其病理改變表現(xiàn)為腎小球系膜基質(zhì)擴(kuò)張、伴小動(dòng)脈瘤的腎小球系膜溶解及kimmelstiel-wilson 結(jié)節(jié)性改變[17-18]。

3.2 OVE26小鼠

在FVB背景下，OVE26小鼠2月齡時(shí)出現(xiàn)蛋白尿，9月齡時(shí)表現(xiàn)出腎小球結(jié)節(jié)性硬化，并且蛋白尿增加了十倍。OVE26小鼠單側(cè)腎切除會(huì)促使多種DN特征包括蛋白尿、炎細(xì)胞浸潤(rùn)、纖維化和基因表達(dá)的變化的產(chǎn)生[19]。

3.3 轉(zhuǎn)基因mRen-2大鼠

Kelly等[20]將小鼠Ren2基因轉(zhuǎn)入SD大鼠基因組，并觀察血管緊張素在糖尿病腎病發(fā)生發(fā)展中的作用。研究人員利用 STZ 誘導(dǎo)TG(mRen-2)27 大鼠成糖尿病后，其生物活性腎素大量增加，導(dǎo)致腎臟血流動(dòng)力學(xué)發(fā)生改變，進(jìn)而損傷腎臟；同時(shí) TGF-β1表達(dá)增加，加重腎纖維化。

Betz和Conway[21]利用低劑量吲哚-3-甲醇處理mRen-2大鼠誘發(fā)中度高血壓。在沒(méi)有高血壓的情況下，STZ誘導(dǎo)的糖尿病大鼠蛋白尿增加了14倍，但只出現(xiàn)輕微的組織學(xué)和基因表達(dá)變化。在高血壓刺激下，高血糖導(dǎo)致糖尿病大鼠白蛋白尿增加了500倍，腎小球硬化和腎小管間質(zhì)纖維化程度加重。

4 加重DN模型

化學(xué)藥物誘導(dǎo)和基因工程手段并不能完全概括人類的DN特征。將糖尿病易感模型與其他致病基因相結(jié)合，能夠加重模型鼠病理學(xué)病變及腎臟損傷程度[22-25]。

4.1 BTBR ob/ob小鼠

Hudkins等[26]對(duì)BTBR背景小鼠進(jìn)行了ob/ob 瘦素突變，這些小鼠8周時(shí)出現(xiàn)明顯的高血糖癥狀，蛋白尿升高，腎小球系膜基質(zhì)積累，20周時(shí)腎小球出現(xiàn)與晚期DN相似的病變。22周時(shí)，基底膜厚度增加約20%，系膜基質(zhì)增加約50%。彌漫性系膜硬化(局部趨近結(jié)節(jié)性腎小球硬化)，局灶性小動(dòng)脈玻璃樣變性，血管溶解，局灶性輕度間質(zhì)纖維化。

4.2 MKR小鼠

Mallipattu等[27]構(gòu)建的小鼠骨骼肌中的胰島素樣生長(zhǎng)因子受體(IGF-1R)功能缺失鼠，即為MKR小鼠。這些小鼠體型偏瘦，存在明顯的胰島素抵抗、高胰島素血癥、高血糖和血脂異常，因此可作為非肥胖人類Ⅱ型糖尿病動(dòng)物模型。糖尿病MKR小鼠表現(xiàn)出明顯的蛋白尿和腎小球損傷。24周的高脂飼料喂養(yǎng)會(huì)顯著增加MKR小鼠蛋白尿以及病理學(xué)改變包括腎小管擴(kuò)張、顯著的足細(xì)胞減少和GBM增厚。

4.3 OVE26-TTRhRen雙轉(zhuǎn)基因小鼠

Thibodeau等[28]將STZ注射到TTRhRen轉(zhuǎn)基因小鼠中，發(fā)現(xiàn)其蛋白尿顯著增加和腎臟病理學(xué)明顯改變，而且其腎臟病變速度快于OVE26轉(zhuǎn)基因鼠。OVE26-TTRhRen 雙轉(zhuǎn)基因小鼠的白蛋白尿增加了40倍，并伴有更嚴(yán)重的組織病理學(xué)損傷，包括腎小球硬化和間質(zhì)纖維化。在這些小鼠中，GFR在12～20周劇下降。

5 討論

隨著對(duì)DN動(dòng)物模型研究的不斷深入，一些較為理想的動(dòng)物模型也已建立，并在糖尿病腎病的分子機(jī)制研究中發(fā)揮了重要作用。但是，由于人類DN發(fā)病的復(fù)雜性以及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與人類DN的差異性，現(xiàn)有的動(dòng)物模型無(wú)法完全滿足AMDCC腎病小組委員會(huì)關(guān)于理想DN模型的標(biāo)準(zhǔn)和完全重現(xiàn)人類DN疾病[29]。目前，化學(xué)誘導(dǎo)動(dòng)物模型只能簡(jiǎn)單地模擬早期人類腎病模型；自發(fā)性動(dòng)物模型雖然可以較形象地模擬人類DN, 但其培養(yǎng)困難，造價(jià)高昂；基因工程小鼠遺傳背景清晰，造模時(shí)間短、成模效果較好，但大多數(shù)基因工程小鼠與人類DN仍然存在一定的差距；而將致病基因與易感模型鼠結(jié)合可以快速地建立糖尿病腎病模型，其中一些模型表現(xiàn)出人類DN的基本特征包括高水平的白蛋白尿、結(jié)節(jié)性腎小球硬化和高血壓，這可能是未來(lái)糖尿病腎病動(dòng)物模型的發(fā)展方向。

新的DN動(dòng)物模型制備不僅需要描述實(shí)驗(yàn)動(dòng)物腎臟功能和病理變化，還應(yīng)該探究其相關(guān)因子轉(zhuǎn)錄水平的變化是否與人類疾病相關(guān)。模型動(dòng)物能真實(shí)地模擬和反映人類DN相似的腎臟病理生理學(xué)變化，是人類糖尿病腎病研究的重要基礎(chǔ)。此外，將系統(tǒng)生物學(xué)、基因組學(xué)及代謝組學(xué)研究方法結(jié)合起來(lái)，不斷完善模型制備技術(shù)并增強(qiáng)DN復(fù)雜病因的轉(zhuǎn)化研究，有助于模擬出更接近人類DN的動(dòng)物模型。因此，未來(lái)結(jié)合不同技術(shù)手段，從發(fā)病機(jī)制著手構(gòu)建與人類DN發(fā)病病因、病程及病理相似的動(dòng)物模型，依舊是今后糖尿病腎病領(lǐng)域的研究重點(diǎn)。