實驗小鼠細小病毒(MMV)抗體的實驗室檢測能力驗證結(jié)果評價*

王 吉 李曉波 王 洪 付 瑞 李 威 王淑菁 馮育芳 王莎莎 岳秉飛

(中國食品藥品檢定研究院，北京 102629)

小鼠細小病毒(MMV)屬細小病毒科的細小病毒屬。核酸型為單股線狀DNA。對外界環(huán)境因素抵抗力強，極耐干燥。實驗小鼠和野生小鼠是MMV的自然宿主，實驗條件下可感染大鼠和倉鼠[1]。可在生長旺盛的大鼠胚細胞和小鼠胚細胞中生長，并產(chǎn)生血凝素。MMV具有高度傳染性，主要通過糞便和尿液傳播，易感小鼠通過直接或間接接觸而感染,也可經(jīng)胎盤垂直傳播。MMV廣泛存在于實驗小鼠和野生小鼠中，在世界范圍內(nèi)廣泛存在[1-3]。在我國小鼠群中也監(jiān)測到MMV的感染[4-6]。MMV不僅是白血病病毒種毒、連續(xù)移植小鼠腫瘤的一種極常見的污染物，同時MMV污染也是倉鼠卵巢細胞(CHO)生物制藥生產(chǎn)過程中的一大難題[1，7]。MMV是我國SPF等級實驗動物必須排除的病原微生物之一[8]，同時也是ICLAS、FELASA等實驗動物檢測標準中要求排除的病原微生物之一[9]。

為促進我國實驗動物質(zhì)量檢測相關(guān)機構(gòu)檢測水平的整體提高，2018年由中國合格評定國家認可委員會(CNAS)組織，中國食品藥品檢定研究院依據(jù)ISO/IEC17043∶2010《合格評定能力驗證的通用要求》運作實施全國范圍內(nèi)實驗動物檢測機構(gòu)實驗小鼠細小病毒(MMV)抗體檢測能力驗證計劃[10-12]。目的是通過組織實施能力驗證了解我國目前實驗動物檢測機構(gòu)在實驗小鼠細小病毒(MMV)抗體檢測方面的技術(shù)水平和能力。通過對各檢測機構(gòu)提交檢測結(jié)果的比較分析，來彌補我國實驗動物檢驗中存在的不足、完善檢驗檢測體系，達到促進我國實驗動物質(zhì)量檢測機構(gòu)檢測技術(shù)水平的整體提高[11]。

1 材料與方法

1.1 能力驗證計劃開展

開展驗證的項目：實驗小鼠細小病毒(MMV)抗體檢測；開展時間：2018年4月；驗證代碼：NIFDC-PT-172；組織單位：中國合格評定國家認可委員會(CNAS)；計劃實施單位：中國食品藥品檢定研究院(以下簡稱中檢院)[14-15]。

1.2 能力驗證計劃的發(fā)布

本次能力驗證計劃實施前6個月在全國實驗動物檢測網(wǎng)絡(luò)公開，面向全國實驗動物檢測機構(gòu)。國內(nèi)具備實驗動物檢測能力和資質(zhì)的所有實驗動物檢測機構(gòu)相關(guān)實驗室均可報名參加。并規(guī)定了能力驗證時間及檢測結(jié)果反饋截至時間[14-15]。

1.3 能力驗證主要實驗材料

實驗小鼠細小病毒(MMV)抗體陽性血清、實驗小鼠細小病毒(MMV)抗體陰性血清：本室凍存；小鼠細小病毒(MMV)抗原包被板：本室制備；羊抗小鼠IgG-HRP：KPL公司；商品化實驗小鼠細小病毒(MMV)抗體ELISA試劑盒：國外某公司產(chǎn)品。

1.4 能力驗證比對樣本的檢測及標定

1.4.1此次比對實驗需要3個樣本，編號分別為樣本1、樣本2、樣本3。3個樣本肉眼觀察性狀均應(yīng)為澄清、透明、無絮狀物的淡黃色液體[11，14-15]。

1.4.23個樣本按國標ELISA方法測定后，用商品化ELISA檢測試劑盒進行標定。要求樣本1和樣本2為已知MMV抗體陽性樣本，樣本3為已知MMV抗體陰性樣本。ELISA按國標要求進行操作[8]，商品化試劑盒按說明書進行操作[14-15]。

1.5 能力驗證比對樣本的分裝及編號

取3個經(jīng)過標定的樣本，各分裝100支，100 μL/支。外包裝均一致，樣本性狀顏色均一致。由實施單位將所有樣本進行隨機編號，并記錄每支樣本編號和相對應(yīng)的結(jié)果[11，14]。

1.6 能力驗證比對樣本的均一性測定

將2個陽性樣本(樣本1和樣本2)和1個陰性樣本(樣本3)分別分裝成100份，隨機各取15份用國標ELISA方法進行檢測，要求樣本1小鼠細小病毒抗體A492≥0.6，樣本2小鼠細小病毒抗體0.6>A492≥0.2，樣本3小鼠細小病毒抗體A492<0.2。通過考察3個樣本的A值變化范圍和15支樣本的A492值的變異系數(shù)(相對偏差)來評價樣本的均一性[11，13-16]。

1.7 能力驗證比對樣本的穩(wěn)定性測定

1)37 ℃穩(wěn)定性試驗

3個比對樣本隨機各抽取15支，放置于37 ℃孵育箱，連續(xù)15 d，每天各取1支，凍存于-70 ℃，作為37 ℃穩(wěn)定性樣品[11，13-14，16]。

2)4 ℃穩(wěn)定性試驗

3個比對樣本隨機各抽取15支，放置于4 ℃孵育箱，連續(xù)15 d，每天各取1支，凍存于-70 ℃，作為4 ℃穩(wěn)定性樣品[14]。

2組樣本均采用國標ELISA方法測定各樣本A492值，通過考察3個樣本A492值變化范圍或計算3個樣本在2個不同溫度環(huán)境分別放置15 d 的A492值變異系數(shù)(相對偏差)，以評價樣本的穩(wěn)定性。

1.8 能力驗證比對樣本的運輸穩(wěn)定性測定[11]

將3個比對樣本，隨機各取3份于運輸冷藏箱中存放，連續(xù)放置7 d，每天記錄箱內(nèi)溫度。第7天將樣品取出進行檢測，樣本1小鼠細小病毒抗體A值應(yīng)為A492≥0.6，樣本2小鼠細小病毒抗體A值應(yīng)為0.6>A492≥0.2，樣本3小鼠細小病毒抗體A值應(yīng)為A492<0.2。

1.9 能力驗證比對樣本的分發(fā)

將經(jīng)過均一性、穩(wěn)定性和運輸穩(wěn)定性檢測均符合要求的比對樣本，分發(fā)給各報名參加比對單位。每個單位分發(fā)3個樣本。并由實施單位記錄不同單位相對應(yīng)的樣本編號，通過冷鏈保持低溫運輸[14]。

1.10 本次能力驗證檢測方法為ELISA方法[8]

1.11 結(jié)果評價標準

此次能力驗證為定性檢測，樣本檢測結(jié)果以陰性(-)或陽性(+)來表示[13-16]。比對單位在規(guī)定截至日期內(nèi)反饋結(jié)果，并且3個樣本的檢測結(jié)果與實施單位分發(fā)樣本的預(yù)期結(jié)果均相符，判為滿意；比對單位未在截至日期內(nèi)反饋結(jié)果，或者比對樣本中有一個結(jié)果與預(yù)期結(jié)果不相符，則判為不滿意[12-21]。

2 結(jié)果

2.1 33個實驗動物檢測機構(gòu)參加此次能力驗證計劃

由中檢院給每個機構(gòu)以“NIFDC-PT-172-編號”表示的1個代碼，對其說明反饋的結(jié)果及其評價均以代碼表示。

2.2 比對樣本的標定

經(jīng)ELISA檢測的3個樣本通過商品化小鼠細小病毒(MMV)抗體ELISA檢測試劑盒檢測，符合率為100%。樣本1和樣本2為陽性，樣本3為陰性，結(jié)果見表1。

表1 比對樣本標定結(jié)果Table 1 The calibration results of samples

2.3 能力驗證比對樣本的均一性測定

樣本1和樣本2兩個陽性樣本A值范圍分別為0.673～0.819和0.374～0.511，其變異系數(shù)(相對偏差)分別為6.93%和9.46%。陰性樣本3的A值范圍為-0.008～0.007。3個樣本均符合能力驗證樣本均一性要求。3個樣本A值結(jié)果見表2。

2.4 樣本的穩(wěn)定性測定[12]

結(jié)果顯示37 ℃穩(wěn)定性實驗樣本1和樣本2兩個陽性樣本A值范圍分別為0.612～0.792和0.376～0.508，其變異系數(shù)(相對偏差)分別為7.78%和10.24%。陰性樣本3的A值范圍為-0.005～0.003，均符合樣本穩(wěn)定性要求。

4 ℃穩(wěn)定性實驗樣本1和樣本2兩個陽性樣本A值范圍分別為0.657～0.866和0.376～0.508，其

表2 樣本均一性測定結(jié)果Table 2 The uniformity results of samples

變異系數(shù)(相對偏差)分別為7.78%和10.24%。陰性樣本3的A值范圍為-0.001～0.009，均符合樣本穩(wěn)定性要求。

3個樣本A值結(jié)果見表3。

表3 樣本穩(wěn)定性測定結(jié)果Table 3 The stability results of samples

2.5 樣本的運輸穩(wěn)定性測定

連續(xù)7 d監(jiān)測比對樣本存放于運輸冷藏箱溫度記錄結(jié)果及溫度變化曲線見表4及圖1。運輸穩(wěn)定性樣本檢測結(jié)果見表5。

表4 運輸穩(wěn)定性實驗溫度記錄結(jié)果Table 4 The temperature record results of transport stability test

圖1 運輸穩(wěn)定性實驗溫度記錄曲線圖Fig.1 The temperature graph of transport stability test

表5 運輸穩(wěn)定性實驗結(jié)果Table 5 The results of transport stability test

結(jié)果顯示3份樣本1的A492值均>0.6,3份樣本2的A值均為0.6>A492>0.2，3份樣本3的A492值均<0.2。3個樣本均符合樣本運輸穩(wěn)定性要求。

2.6 參加能力驗證實驗室行業(yè)分布統(tǒng)計[12]

參加本次能力驗證的有國家及省部級科學研究院，省、市級實驗動物檢測質(zhì)量中心、疾病預(yù)防控制中心等共33家檢測機構(gòu)，具體統(tǒng)計結(jié)果見表6。

表6 參加實驗室行業(yè)分布Table 6 The industry distribution of participating laboratory

2.7 參加能力驗證實驗室地區(qū)分布統(tǒng)計[12]

參加本次能力驗證的33個檢測機構(gòu)覆蓋了國內(nèi)19個省/市/自治區(qū)。具體統(tǒng)計結(jié)果見表7。

表7 參加實驗室所在地區(qū)分布Table 7 The regional distribution of participating laboratory

2.8 能力驗證比對樣本檢測結(jié)果分析[12]

33個實驗室在規(guī)定時限內(nèi)均提交了樣本的檢測結(jié)果。實驗室代碼及其相對應(yīng)的樣本編號及其檢測結(jié)果見表8。

表8 33家單位反饋檢測結(jié)果一覽表Table 8 The list of test results from 33 units

續(xù)表8-1

續(xù)表8-2

從匯總結(jié)果看，33個實驗室及檢測結(jié)果均為滿意，滿意率為100%。

3 討論

3.1 檢測方法的要求

實驗動物國家標準(GB/T14926.28-2001實驗動物小鼠細小病毒檢測方法)[8]規(guī)定的檢測方法包括酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)、免疫酶試驗(IEA)、免疫熒光試驗(IFA)[8]，與以往的能力驗證計劃不同的是，考慮到不同檢測方法可能出現(xiàn)不同的結(jié)果，本次能力驗證要求所有參加單位均采用ELISA方法進行檢測[8]。從反饋的結(jié)果來看，提交結(jié)果的33家實驗室均采用了ELISA檢測方法[8]，有1家單位同時還采用IFA方法進行了結(jié)果驗證，2種方法的檢測結(jié)果均為滿意。通過此單位采用ELISA和IFA 2種方法檢測均可得到滿意結(jié)果，同時結(jié)合2016年及2017年此單位也均采用上述兩種方法對其他兩種病毒抗體進行檢測并均得到滿意結(jié)果看：1)證明其中一種方法可以作為驗證另一種方法的可靠技術(shù)手段；2)此家實驗室兩種方法技術(shù)應(yīng)用均較成熟；3)此家實驗室在實驗動物檢測技術(shù)能力方面較強。

3.2 檢測試劑的選擇

從檢測試劑看，提交材料的33家單位中，有21家采用商品化ELISA試劑進行檢測，并說明了試劑盒來源及批號。其中有2家實驗室同時采用國產(chǎn)和進口兩種試劑進行檢測，其余8家單位未表明試劑盒來源。不管是使用國內(nèi)檢測試劑，還是國外檢測試劑，或是未表明試劑來源的檢測試劑，反饋的結(jié)果看均為滿意。說明商品化檢測試劑質(zhì)量可靠，為我國實驗動物質(zhì)量控制提供可靠的技術(shù)保障，同時也說明參加能力驗證各實驗室檢測能力可靠。同時從反饋的信息看，大家更傾向于選擇國外檢測試劑，但2018年從檢測結(jié)果看，國內(nèi)國外檢測試劑均能達到滿意結(jié)果。結(jié)合近幾年檢測結(jié)果看，不滿意結(jié)果中用國外檢測試劑的和用國內(nèi)檢測試劑單位占百分比相當，所以從近幾年使用試劑和反饋結(jié)果看，檢測結(jié)果是否達到滿意，實驗室檢測技術(shù)能力至關(guān)重要。

3.3 反饋結(jié)果分析

本次能力驗證同樣加入了弱陽性樣本，并且采用隨機編號形式進行隨機發(fā)放。每個實驗室發(fā)放陽性、弱陽性和陰性樣本各1個[13-16，20]。弱陽性樣本的增加無疑增加了檢測難度，也更能檢驗出各單位的檢驗水平。從整個反饋結(jié)果看，各單位均能檢出弱陽性樣本，說明各單位在小鼠細小病毒檢測方面具備很強的檢測能力。

33家提交材料的單位中，有23家提交了報告，有29家提交了原始記錄，有19家同時提交了報告和原始記錄。從報告和原始記錄信息看，大部分原始記錄里體現(xiàn)了使用儀器及儀器編號、檢驗依據(jù)等信息的記錄，而且部分實驗室原始記錄記述相當詳細完整。有6家實驗室在報告及原始記錄里沒有提到檢驗依據(jù)，有5家實驗室沒有使用相關(guān)儀器信息。提示部分實驗室需要完善報告及原始記錄的完整性。

按照國標的要求，檢測為陽性的樣品需要用同一方法或不同方法進行復(fù)檢，尤其是ELISA試驗，影響結(jié)果因素較多，進行復(fù)檢或平行樣本檢測很有必要，本次提供材料的33家實驗室，有9家實驗室做的較好，對實驗結(jié)果采用不同方法、不同的實驗人員或不同來源試劑進行了復(fù)檢，有的實驗室用同一方法進行了復(fù)檢，還有的實驗室每個檢測樣本做了多個重復(fù)孔進行檢測；但多數(shù)實驗室通過對樣本的單次檢驗即判定了結(jié)果。雖然從提交檢測結(jié)果看，與預(yù)期結(jié)果一致。但是，從實驗室的檢測程序來看，存在缺陷。因此建議沒有對陽性樣本進行復(fù)核或者復(fù)檢的實驗室在今后的實驗過程，要做到對陽性檢測樣本進行驗證或復(fù)核，以保證檢測結(jié)果的可靠性。部分單位使用的檢測試劑未寫明來源或來源不清，檢測報告中應(yīng)寫明檢測試劑的來源及批號等信息，以保證檢測結(jié)果的溯源性。

從本次能力驗證結(jié)果，并結(jié)合近年開展的實驗動物病毒檢測項目能力驗證結(jié)果可以看出，通過開展能力驗證活動[13-16，20]，不僅促進了我國實驗動物檢測實驗室檢測能力和檢測水平的整體提高，而且對于完善實驗動物檢驗檢測體系具有重要意義。