β-內(nèi)酰胺類抗生素的檢測及去除技術的研究進展

李家成,王佳豪,許鍇,劉康樂,彭思偉,林子增,王鄭

(南京林業(yè)大學 土木工程學院，江蘇 南京 210037)

β-內(nèi)酰胺類抗生素(Beta-lactam Antibiotics，BLAs)是一種種類很廣的抗生素，在現(xiàn)有的抗生素種類中使用較為普遍，其中包含青霉素與頭孢菌素等。BLAs是一種最持久的人為藥物污染物，目前在許多水生環(huán)境中檢測到[1-3]。環(huán)境中的抗生素主要來自于農(nóng)用獸藥、醫(yī)用藥物以及污水廠的處理水排放[4]。環(huán)境中抗生素的殘留對人體和生態(tài)構成了潛在的威脅[5]，比如少數(shù)病人會對BLAs產(chǎn)生過敏反應、土壤中殘留的抗生素會對植物根系生長和種子萌發(fā)產(chǎn)生影響等[6]。此外，因濫用BLAs等抗生素導致的抗性細菌(Antibiotic Resistant Bacteria，ARB)及抗性基因(Antibiotics Resistance Gene，ARG)的污染正威脅著人類的健康與生態(tài)的安全[7]。

1 樣品前處理方法

檢測樣品前處理是首先從樣品中分離出待測物質(zhì)，然后采用合適的樣品處理方法，使待測組分轉(zhuǎn)變成儀器可測定的狀態(tài)[8]。其主要作用是將藥物從樣品中提取出來，去除樣品中所含的干擾雜質(zhì)，從而是待測組分狀態(tài)能夠達到檢測的要求[9]。由于環(huán)境中存在的抗生素含量較少，為了減少對環(huán)境樣品中基質(zhì)的影響，提高測定結果的正確性，故在樣品分析前需做預處理[10]。下面介紹了幾種內(nèi)酰胺類抗生素檢測前處理的方法：液液萃取[11-12]、固相萃取[13-14]、基質(zhì)固相分散萃取[15-16]。

1.1 液液萃取

液-液萃取(Liquid-liquid Extraction，LLE)又稱溶劑萃取，是利用組分在溶劑中的溶解度不同從而達到分離或提取的效果，或者通過控制pH值來調(diào)節(jié)藥物在兩相中的分配。

Moreno-González等[17]采用超高效液質(zhì)聯(lián)用技術，建立了一種新的多殘留法測定嬰兒乳和酸奶中15種BLAs的含量。采用Kinetex聯(lián)苯核殼柱(50 mm×2.1 mm，1.7 μm)，水與0.05%乙酸和甲醇的流動相，在6 min內(nèi)實現(xiàn)分離。采用多重反應監(jiān)測模式，在ESI+中檢測分析物，并對裂解條件進行優(yōu)化，以獲得最高的靈敏度。使用聯(lián)苯鍵合柱可以獲得所有研究分析物的滿意選擇性。提出了離子對鹽析輔助液-液萃取作為樣品處理方法，并通過實驗設計進行了優(yōu)化。在最佳條件下，加樣回收率為79%～93%。定量限小于9.0 μg/kg，結果表明該方法具有快速簡便，靈敏度高，適用性強等優(yōu)點。分析時間、靈敏度和準確度的結果表明，該方法適用于不同嬰兒食品中β-半乳聚糖殘留量的監(jiān)測。

1.2 固相萃取

固相萃取(Solid Phase Extraction，SPE)是利用待測組分與干擾物在萃取劑上吸附力的強弱不同，從而實現(xiàn)兩者的分離。常見的固相萃取劑是含C18、腈基等特殊填料的物質(zhì)。

漆晴等[18]采用固相萃取/超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法，檢測東太湖水源地三個典型點位原水中8類共31種抗生素的殘留量(包括氨基糖苷類 1種、林可胺類1種、氯霉素類2種、β-內(nèi)酰胺類 2種、大環(huán)內(nèi)酯類4種、喹諾酮類4種、四環(huán)素類 4種、磺胺類13種)。通過固相萃取富集、多反應監(jiān)測(Multiple Reaction Monitoring，MRM)定性定量分析，該方法的平均回收率為65.6%～108.8%，相對標準偏差(Relative Standard Deviations，RSDs)為2.35%～17.1%，準確度及精密度均良好，靈敏度高(最低檢出濃度為1.0 ng/L)，可快速有效地檢測東太湖原水中多種痕量抗生素的殘留量。

任召珍等[19]采用固相萃取/高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定動物源食品中青霉素G、青霉素V等其它10種β-內(nèi)酰胺類抗生素殘留量,以青霉素G-D7 為內(nèi)標。樣品首先用磷酸鹽緩沖溶液提取，然后用正己烷除提取液中所含的脂，處理后的樣品再經(jīng)PEP-2固相萃取柱凈化，最后采用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜對樣品進行測定，內(nèi)標法定量。在相應的濃度范圍內(nèi)，10種BLAs線性系數(shù)均大于0.99，檢測限為0.25～2.0 μg/L。在低、中、高3個不同的濃度水平下，10種BLAs在不同基質(zhì)中的回收率均處于80%～120%范圍內(nèi)，相對標準偏差小于10%。結果表明,該方法能夠滿足動物源食品中上述10種BLAs的測定需求。

1.3 基質(zhì)固相分散萃取

基質(zhì)固相分散萃取(Matrixsolid-phase Dispersion Extraction，MSPD)是一種快速樣品檢測處理技術。其原理是研磨固相萃取材料與樣品的混合物，再將得到的物質(zhì)作為填料裝柱，淋洗柱子，洗脫待測物，從而實現(xiàn)待測物的分離和提取[20]。

Huang等[21]建立了一種基于基質(zhì)固相分散(MSPD)的高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時測定豬肉中15種BLAs的方法。肌肉組織與Oasis-HLB吸附劑混合，用正己烷清洗由吸附劑/肌肉組織基質(zhì)制成的柱，然后用乙腈/水(50∶50,v/v)洗脫β-內(nèi)酰胺，兩者均含有0.1%甲酸。將最終提取液蒸發(fā)，重新配制成乙腈/水(10∶90,v/v)進行高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法分析，各基質(zhì)匹配校正曲線的相關系數(shù)(r2)均大于0.99。β-內(nèi)酰胺類藥物的檢測限和定量限分別為0.02～0.63 μg/kg和0.07～0.97 μg/kg。在強化水平下，各檢測物的平均回收率處于92%～111%范圍內(nèi)，相對標準偏差均小于12%。該方法準確、重復性好，已成功應用于中國市場豬肉中15種β-內(nèi)酰胺類物質(zhì)的檢測。

2 內(nèi)酰胺類抗生素的檢測方法

目前，對于BLAs的檢測方法主要有：毛細管電泳法、液相色譜法、液質(zhì)聯(lián)用法以及其他檢測方法。

2.1 高效毛細管電泳法

高效毛細管電泳(High Performance Capillary Electrophoresis，HPCE)，是一類以毛細管為分離通道、以高壓直流電場為驅(qū)動力的新型液相分離技術。

Li等[22]首次合成了聚吡咯包被尼龍6納米纖維膜作為固相膜吸附劑，用于城市河水中兩種BLAs(苯唑西林和氯唑西林)的提取。然后用毛細管電泳二極管陣列檢測器(Capillary Electrophoresis with a Diode Array Detector，CE-DAD)檢測分析物。用掃描電鏡和傅里葉變換紅外光譜儀對合成的納米纖維膜進行了表征。優(yōu)化了實驗條件，包括聚吡咯包被尼龍6納米纖維膜用量、樣品溶液pH值、吸附體積和解吸條件。在最佳提取分離條件下，苯唑西林和氯唑西林的檢出限均為2.0 ng/mL。將該方法應用于城市河流水樣中兩種β-內(nèi)酰胺的測定。兩種BLAs的回收率在84.2%～96.4%，表明聚吡咯包被尼龍6納米纖維膜對這兩種抗生素具有較高的提取能力。日內(nèi)測定的相對標準偏差為2.26%～5.29%，日間測定的相對標準偏差為2.38%～7.02%。

Li等[23]研究證實了聚吡咯作為吸附劑在Fe3O4磁性納米粒子(PPy/Fe3O4MNPs)表面的應用。用透射電子顯微鏡、傅里葉變換紅外吸收光譜儀和X射線衍射對合成的磁性復合材料進行了表征。選擇4種β-內(nèi)酰胺類藥物[苯唑西林(Oxacillin，OXA)、氯唑西林(Cloxacillin，CLOX)、雙氯唑西林(Dicloxacillin，DIC)和氟氯唑西林(Flucloxacillin，F(xiàn)LU)]作為實驗分析物。采用膠束電動毛細管色譜-二極管陣列檢測器(Micellar Electrokinetic capillary Chromatography-diode Array Detector，MEKC-DAD)對提取的β-內(nèi)酰胺進行了測定。對影響萃取效率和分離度的關鍵參數(shù)進行了研究和優(yōu)化。在最佳條件下，OXA、CLOX、FLU和DIC的檢出限分別為1.0 μg/L和0.8 μg/L。校準曲線在2.5～200.0 μg/L范圍內(nèi)呈線性。該種方法主要用來測定水樣中β-內(nèi)酰胺類化合物，結果符合預期。日內(nèi)相對標準差為1.09%～4.58%，日間相對標準差為2.95%～7.80%。實驗結果表明，該方法具有靈敏、簡便等優(yōu)點，可用于測定水樣中β-內(nèi)酰胺類物質(zhì)。

2.2 高效液相色譜法

高效液相色譜(High Performance Liquid Chromatography，HPLC)法是以高壓下的液體為流動相，并采用顆粒極細的高效固定相的柱色譜分離技術，具有分離效率高、靈敏度高等優(yōu)點[24]。

Briscoe S E等[25]建立了一種簡便的高效液相色譜法，用于常規(guī)測定在200 μL人血漿中的10種BLAs的游離(未結合)濃度。測定的抗生素包含 3種頭孢菌素(頭孢曲松、頭孢唑啉和頭孢菌素)；兩種碳青霉烯類抗生素(美羅培南和厄他培南)；5種青霉素(氨芐西林、哌拉西林、芐青霉素、氟氯唑西林和雙氯唑西林)。有一種單一的普通樣品制備方法，涉及超速離心和穩(wěn)定化。色譜分析在Waters Xbridge C18柱上進行，根據(jù)分析物的不同，4個乙腈磷酸鹽緩沖流動相之一，在210,260,304 nm處通過紫外吸光度檢測感興趣的峰。該方法已在危重病人治療藥物監(jiān)測的病理實驗室得到驗證和應用。傳統(tǒng)認為具有高蛋白結合的抗生素(如頭孢曲松、頭孢唑啉、厄他培南、氟氯唑西林和雙氯唑西林)普遍存在的蛋白結合水平的顯著變異性表明，該實驗應優(yōu)先用于藥理學測定。治療藥物監(jiān)測計劃中BLAs的有效濃度。

2.3 液質(zhì)聯(lián)用法

液質(zhì)聯(lián)用(High Performance Liquid Chromatography Tandem Mass Spectrometry，HPLC-MS)又叫高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術，分別以液相色譜和質(zhì)譜作為它的分離系統(tǒng)和檢測系統(tǒng)。液質(zhì)聯(lián)用體現(xiàn)了色譜和質(zhì)譜優(yōu)勢的互補，大大增強其分離能力，并且提高了其選擇性和靈敏度。

王帥帥等[26]建立QuEChERS(Quick、Easy、Cheap、Effective、Rugged、Safe)方法與超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜相結合同時測定羊奶中8種BLAs的檢測方法。樣品以乙腈作為提取試劑，用C18和PSA吸附劑進行凈化，以0.1%(v/v)甲酸水溶液-乙腈為流動相，反相C18色譜柱分離，正離子掃描，多反應監(jiān)測模式進行質(zhì)譜分析。結果表明，8種BLAs的線性關系良好，相關系數(shù)均大于0.986，樣品加標回收率為83.8%～95.4%，相對標準偏差小于6.5%，方法檢出限為0.25～1.00 μg/kg，定量限為1.0～2.0 μg/kg。該方法適用于羊奶及其它奶制品中BLAs的測定。

M Di Rocco等[27]建立了牛肌肉中30種BLAs殘留量的測定方法。方法包括12種青霉素、12種頭孢菌素、5種碳青霉烯類抗生素和法羅培南。首先采用乙腈-水(80∶20，v/v)和C18分散固相萃取(d-SPE)凈化的簡單溶劑萃取法提取樣品，然后采用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(UHPLC-MS/MS)檢測。色譜在反相csh-C18柱上進行，采用二元梯度分離法，包括水中0.01%甲酸和0.2 mmol/L醋酸銨(流動相A)和乙腈中0.01%甲酸(流動相B)。質(zhì)譜儀工作在正電噴霧電離模式。按照2002/657/EC指南進行驗證。在重復性實驗條件下，真實度在69%～143%，精確度在2.0%～29.9%。

2.4 其他檢測方法

Merola G等[28]開發(fā)了一種用于青霉素G和其他BLAs的單用、簡單、高靈敏的安培免疫傳感器。研制的免疫傳感器以過氧化氫安培電極為傳感器，過氧化物酶為標記物。通過比較兩種不同的競爭操作模式，驗證了該免疫傳感器優(yōu)化方法的有效性。LOD為10-10mol/L，所研制的免疫傳感器對所有BLAs的選擇性較低，對其他非BLAs的選擇性較高。Cámara M等[29]建立了同時測定β-內(nèi)酰胺類抗生素(BLAs)、氨芐西林(Ampicillin，AMP)、青霉素G(penicillin G，PEG)、頭孢氨芐(Cefalexin，CFX)、頭孢唑林(Cefazolin，CFL)、頭孢哌酮(Cefoperazone，CFP)、氯仿(Chloroform，CLO)的液相色譜-紫外二極管陣列檢測方法。對色譜柱、流動相、溫度和流速進行了優(yōu)化，以提供這些分析物的最佳分辨率?？股貧埩粑锏奶崛》椒òㄊ褂靡译鎸εＤ虡悠愤M行脫蛋白，然后離心，然后進行SPE清理。所研究的β-內(nèi)酰胺類藥物的回收率在79%～96%，相對標準偏差在0.5%～4.9%。Eltzov E等[30]研究提出了一種利用基因修飾細菌檢測新型抗菌化合物的新方法。建立了不同的多重耐藥(Multi-drug Resistant，MR)生物發(fā)光菌株，并將其暴露于不同的BLAs中。

3 BLAs的去除

3.1 吸附法

吸附法是利用多孔性的固體吸附劑吸收分離溶解性物質(zhì)的一種技術，目的是為了達到物質(zhì)的分離和富集，常分為物理吸附、化學吸附和離子交換吸附。吸附法具有高效、操作簡單以及吸附劑可重復使用等優(yōu)點。

孫玉茹[31]采用臭氧-活性炭組合工藝去除污水廠二級出水中的BLAs。實驗選取6種常見BLAs作為目標抗生素，考察了臭氧投加量、反應時間、活性炭層高度以及空床停留時間(Empty Bed Contact Time，EBCT)對BLAs去除效果的影響。實驗結果表明，在臭氧投加量為8 mg/L,臭氧與目標物質(zhì)反應20 min,活性炭炭層高度設置為750 mm，EBCT為10 min的條件下，該組合工藝對BLAs的平均去除率達到了69.24%。實驗結果表明,臭氧-活性炭組合工藝可以有效地去除二級出水中的BLAs。

Zhang等[32]研究了粉狀活性炭對水中6種具有代表性的28種抗生素。研究結果表明，粉狀活性炭對所選抗生素均有較好的吸附能力。在粉狀活性炭用量為20 mg/L、接觸時間為120 min的最佳條件下，去離子水和地表水的去除率分別為99.9%和99.6%，根據(jù)Freundlich模型的吸附等溫線，不同抗生素對n的吸附量不同，且多數(shù)小于1。粉狀活性炭是非線性的?？股氐奈椒蟼味墑恿W模型(R2=0.99)。用韋伯-莫里斯模型分析表明，粒子內(nèi)擴散并不是唯一的速率控制步驟?？偟膩碚f，本研究的結果證實,粉狀活性炭是一種可行的去除水中抗生素的方法，可以改善水質(zhì)，控制抗生素污染。

盧通等[33]采用香樟葉作為實驗原材料，在微波條件下利用尿素對香樟葉進行改性，目的是探究改性香樟葉對BLAs廢水處理效果的影響。通過與普通香樟葉顆粒處理效果相比較，改性香樟葉顆粒處理該類廢水效果顯著，在投加0.500 0 g，溫度 80 ℃，反應時間50 min，廢水初始濃度0.480 0 g/L時，處理效果最佳。研究結果表明，在該條件下，廢水中抗生素的去除率可達到72%，具有一定的應用價值。

3.2 氧化處理法

廢水氧化處理法是利用強氧化劑尤其是羥基自由基來氧化分解廢水中污染物，從而實現(xiàn)凈化廢水的一種方法，目前氧化法已成為處理生物難降解有機污染物的重要方法[34]。

Chen等[35]研究鐵(Ⅲ)對BLAs降解的促進作用。研究結果表明，AMP降解速率常數(shù)隨時間的增加呈線性增加，而當AMP濃度高于Fe(III)時，則與AMP濃度無關。中性pH最有利于鐵(III)對AMP的促進降解，在實際地表水和廢水基質(zhì)中，也具有顯著的促進降解作用。在各種BLAs中，F(xiàn)e(III)促進青霉素降解的速度快于頭孢菌素。Fe(III)促進降解可能是通過BLAs與羧基和叔氮絡合，進而促進β-內(nèi)酰胺環(huán)的水解裂解。本研究是首次發(fā)現(xiàn)Fe(III) 在BLAs降解中的作用并闡明其作用機制。

Karlesa Anggita等[36]研究了高鐵酸鹽水溶液氧化BLAs的反應動力學、反應部位、抗菌活性變化及轉(zhuǎn)化產(chǎn)物。在pH為6.0～9.5范圍內(nèi)，測定了高鐵酸鹽(VI)與青霉素、頭孢菌素和幾種模型化合物反應的表觀二級速率常數(shù)。高鐵酸鹽(VI)顯示出對所選β-內(nèi)酰胺的明顯反應性。通過考慮高鐵酸鹽(VI)和β-內(nèi)酰胺之間的物種特異性反應(反應發(fā)生在硫醚、胺和/或苯酚基團)，可以很好地解釋pH依賴性。根據(jù)動力學結果，硫醚是氯唑西林和青霉素G的主要反應部位，除硫醚外，胺是氨芐西林和頭孢氨芐的反應部位，胺和苯酚是阿莫西林的反應部位。HPLC/MS分析表明，β-內(nèi)酰胺的硫醚轉(zhuǎn)化為立體異構體(R)-和(S)-亞砜，再轉(zhuǎn)化為磺基。高鐵酸鹽(VI)處理的β-內(nèi)酰胺溶液的微生物定量分析表明，頭孢氨芐氧化產(chǎn)生的轉(zhuǎn)化產(chǎn)物表現(xiàn)出降低，但不可忽略的殘余活性。對于其他β-內(nèi)酰胺類化合物，轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的抗菌活性比母體化合物低(<5%)。總體而言，高鐵酸鹽(VI)氧化似乎是降低BLAs活性的有效方法，盡管可能需要其他方法來完全消除頭孢菌素的活性。

Elmolla E S等[37]研究了photo-Fenton法降解水中抗生素阿莫西林、氨芐西林和氯唑西林的效果?？疾炝撕?04,105,103 mg/L阿莫西林、氨芐西林和氯唑西林的水溶液處理的最佳操作條件：H2O2/COD摩爾比1.5、H2O2/Fe2+摩爾比20和pH。在最佳操作條件下，阿莫西林、氨芐西林和氯唑西林在2 min內(nèi)完全降解，生物降解性(BOD5/COD比)由0提高到0.4，COD和DOC在50 min內(nèi)分別降解80.8%和58.4%。抗生素分子中有機碳和氮的酶和礦化。有機碳和氮礦化導致氨和硝酸鹽濃度增加，DOC降解。DOC降解率提高到58.4%，氨氮從8～13.5 mg/L，硝酸鹽在50 min內(nèi)從0.3～14.2 mg/L。

3.3 生物降解法

生物法是通過利用微生物將有機物降解代謝為無機物的方法來處理廢水。根據(jù)使用微生物的種類不同，可將分為好氧法、厭氧法和生物酶法等。

Huang等[38]使用180 L厭氧膜生物反應器(Anaerobic Membrane Bioreactor，AnMBR)運行 253 d 來處理實際的制藥廢水的工藝，這主要含有BLAs中的阿莫西林、頭孢曲松鈉、頭孢哌酮和氨芐青霉素。工藝操作分為3個階段，水力停留時間(Hydraulic Retention Time，HRT)分別為48,36,24 h，對應的平均有機負荷率(Organic Loading Rates，OLRs)和抗生素負荷率(Antibiotic Loading Rates，ALRs)分別從(2.37±0.28) kg增加到(4.46±0.87) kg COD/(m3·d)、從(19.06±0.67) g增加到(37.91±3.57) g BLAs/(m3·d)。阿莫西林、頭孢曲松、頭孢哌酮和氨芐西林的去除率最高，分別為(73.2±4.3)%,(47.7±2.2)%,(79.4±4.1)%,(34.6±3.3)%。實驗結果表明，該工藝是一種切實可行、有效的處理含BLAs廢水的工藝。

近年來，通過研究者的不斷發(fā)現(xiàn)，將電化學氧化與生物處理相結合，能夠加速反應底物的降解，實現(xiàn)工業(yè)廢水的高效去除，呈現(xiàn)出良好的前景[39]。

4 總結

BLAs對于抗菌感染具有良好的效果，應用非常廣泛，然而由于大量存在于環(huán)境中，對人和動物產(chǎn)生潛在的威脅。目前，國內(nèi)外對于BLAs的萃取主要集中于SPE和MSDE等方法，這些方法具有靈敏度高、結果準確等優(yōu)點，未來可能會趨向于對吸附劑和組合工藝的研究。檢測方法主要是HPLC及其組合工藝，該類方法具有選擇性高、分離能力強、高靈敏度的優(yōu)點，未來的趨勢仍然會是這些與其他工藝的組合。去除技術主要有吸附法、氧化法以及生物降解法，目前的研究表明，這些工藝對于BLAs的去除都具有很好的處理效果。隨著傳統(tǒng)工藝對抗生素不能有效的去除，高級氧化技術應用的越來越多，其中臭氧法和Fenton法較為常用，就目前幾種方法而言，photo-Fenton法對BLAs的去除具有最好的效果。未來我們應當關注于組合工藝對BLAs的去除，充分結合工藝的優(yōu)點，提高抗生素的去除效果。