東北刺人參抗疲勞及改善睡眠節(jié)律作用研究

王艷艷,翟春梅,申柯欣,米 曉,黃莉莉,孟永海,李廷利

(黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院,黑龍江哈爾濱 150040)

東北刺人參(OplopanaxelatusNakai.)為五加科刺參屬，多年生落葉灌木,又名刺參、刺人參、長(zhǎng)白山刺人參等,以根入藥,有補(bǔ)氣助陽、強(qiáng)心利尿的功效,收載于《中國(guó)植物志》[1]。東北刺人參主要分布于我國(guó)的吉林省長(zhǎng)白山地區(qū)、朝鮮北部山區(qū)以及俄羅斯遠(yuǎn)東山區(qū)[2]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn),東北刺人參與人參的生物活性極為相似,都具有很高的藥用價(jià)值,且安全性高、無毒副作用,在民間可替代人參應(yīng)用,有“木本人參”的美譽(yù)[3]。

東北刺人參具有廣泛的生物活性,其在臨床上被用于治療慢性疲勞綜合癥、神經(jīng)衰弱、心血管疾病、糖尿病等多種疾病。胡彥武[4]用不同劑量東北刺人參莖給正常小鼠連續(xù)灌胃14 d,測(cè)定其負(fù)重游泳時(shí)間、耐缺氧時(shí)間、血乳酸含量,結(jié)果顯示,東北刺人參莖能延長(zhǎng)小鼠的耐缺氧時(shí)間和負(fù)重游泳時(shí)間,降低小鼠血乳酸含量。然而,目前國(guó)內(nèi)外對(duì)東北刺人參根的抗疲勞作用的實(shí)驗(yàn)研究較少。因此,本文建立小鼠力竭游泳模型,分別考察東北刺人參根對(duì)小鼠負(fù)重游泳時(shí)間以及自由泳小鼠GSH-Px、LDH、ATPase和BUN等指標(biāo)的影響。

本實(shí)驗(yàn)室前期研究發(fā)現(xiàn),東北刺人參具有顯著的改善睡眠作用,其作用機(jī)制與調(diào)節(jié)中樞神經(jīng)遞質(zhì)含量有關(guān)[5],但東北刺人參對(duì)睡眠節(jié)律的影響尚未可知。本文結(jié)合以往研究,以野生型Canton S品系黑腹果蠅為觀察對(duì)象[6],利用果蠅活動(dòng)監(jiān)測(cè)系統(tǒng)DAMS,研究東北刺人參根水提取物凍干粉對(duì)7日齡黑腹果蠅睡眠節(jié)律的干預(yù)作用，初步探討東北刺人參改善睡眠質(zhì)量及抗疲勞的作用,為東北刺人參生物活性的基礎(chǔ)研究以及人工栽培品的應(yīng)用及產(chǎn)品開發(fā)提供參考[7]。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

ICR小鼠 雌雄各半,體重(20±2) g,SPF級(jí),均由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)藥物安全評(píng)價(jià)中心提供,許可證號(hào):SCXK(黑)2013-004;野生型Canton S品系黑腹果蠅(Drosophilamelanogaster) 7日齡,256只,雌雄各半,由北京大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院提供;東北刺人參根 產(chǎn)自吉林省集安市野生藥材種植基地,秋季采收,將其根洗凈、切段、晾干、粉碎(過二號(hào)篩)、備用,經(jīng)黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)王振月教授鑒定為東北刺人參的根;蔗糖 分析純,天津市濱?？频匣瘜W(xué)試劑有限公司;瓊脂 細(xì)菌學(xué)級(jí),賽國(guó)生物科技有限責(zé)任公司;丙酸 分析純,天津市福晨化學(xué)試劑廠;乙醇 分析純,天津市富宇精細(xì)化工有限公司;酵母粉 食品級(jí),英國(guó)OXOID公司;玉米粉 食品級(jí),興化聯(lián)富食品有限公司;尿素氮測(cè)試盒(BUN)、乳酸脫氫酶測(cè)試盒(LDH)、考馬斯亮藍(lán)測(cè)試盒、谷胱甘肽-過氧化物酶測(cè)試盒(GSH-Px)、三磷酸腺苷測(cè)試盒(ATP) 以上試劑盒均產(chǎn)自南京建成成生物工程研究所。

N-1100D型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀、FDU-1200型冷凍干燥機(jī) 上海愛朗儀器有限公司;FJ-200高速萬能粉碎機(jī) 上海申勝儀器公司;HH. WZ. CY600電熱恒溫水浴鍋 上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備公司;AL 204電子天平 美國(guó)METTLER TOLEDO公司;EVOLUTION 260紫外分光光度計(jì) 美國(guó)Thermo公司;DAMS果蠅活動(dòng)監(jiān)測(cè)系統(tǒng) Trikinetics Inc.Waltham,MA;EPOCH12酶標(biāo)儀 美國(guó)BIOTEK公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 東北刺人參提取物溶液的制備 稱取東北刺人參根粉末(過二號(hào)篩)200 g,分別用10倍量和8倍量體積的蒸餾水加熱回流提取2次,每次1.5 h,合并提取液,過濾,50 ℃減壓濃縮至1 mg/mL,冷凍干燥,得東北刺人參根水提取物凍干粉,備用。

1.2.2 小鼠實(shí)驗(yàn)環(huán)境 將ICR小鼠置于獨(dú)立通氣籠中飼養(yǎng)(噪音≤55 dB(A),換氣次數(shù):20～50 次/h,潔凈度:100級(jí),壓差≥10 Pa,菌落數(shù)≤1 個(gè)/皿·時(shí));外界溫度(24±2) ℃,濕度55%±15%,光照強(qiáng)度:300 lux,12 h/12 h明暗交替(7:00～19:00光照;19:00～次日7:00黑暗)。

1.2.3 小鼠力竭游泳實(shí)驗(yàn)

1.2.3.1 實(shí)驗(yàn)分組及給藥 選取ICR小鼠,置于實(shí)驗(yàn)環(huán)境中適應(yīng)一周。隨機(jī)分組,雌雄各半,分別為空白對(duì)照組,東北刺人參根凍干粉高、中、低劑量組(500、250、125 mg/kg),灌胃給藥;空白組動(dòng)物給予生理鹽水溶液,給藥容積為0.2 mL/10 g體重;連續(xù)給藥15 d,末次給藥后進(jìn)行各項(xiàng)抗疲勞指標(biāo)測(cè)定。

1.2.3.2 負(fù)重小鼠游泳時(shí)間的測(cè)定 力竭游泳實(shí)驗(yàn)中,將小鼠隨機(jī)分成4組(空白對(duì)照組,東北刺人參根凍干粉高、中、低劑量組),每組12只,雌雄各半。末次灌胃給藥30 min后,以小鼠體重的5%稱取鉛絲,在其尾根部負(fù)重,置于(25±1) ℃的恒溫水箱(60 cm×40 cm×40 cm)中進(jìn)行游泳,力竭標(biāo)志為小鼠頭部完全沒入水中8 s不再浮起記錄此時(shí)的負(fù)重游泳時(shí)間。期間可適時(shí)使用玻璃棒撥動(dòng)小鼠,使其始終處于運(yùn)動(dòng)狀態(tài)及避免抱團(tuán),但不可干擾其運(yùn)動(dòng),記錄小鼠從進(jìn)入水中至游泳力竭的時(shí)間并計(jì)算延長(zhǎng)率，延長(zhǎng)率(%)=[(給藥組平均負(fù)重游泳時(shí)間-空白組平均負(fù)重游泳時(shí)間)/空白組平均負(fù)重游泳時(shí)間]×100。

1.2.3.3 抗疲勞生理指標(biāo)的測(cè)定 另取一批小鼠,隨機(jī)分組,每組12只,雌雄各半,末次灌胃給藥30 min后稱重,頸椎脫臼處死,進(jìn)行各項(xiàng)抗疲勞生理指標(biāo)測(cè)定。

臟器指數(shù):小鼠稱重,處死,解剖取出脾臟、胸腺并用生理鹽水洗去血液,濾紙吸干表面水分,分別稱重,計(jì)算臟器指數(shù)。臟器指數(shù)(mg/g)=臟器重量/體重。

血清BUN含量和LDH活性的測(cè)定:小鼠不負(fù)重游泳90 min后,立即撈出小鼠,剪去胡須,摘眼球取血,靜置,3000 r/min離心10 min,分離血清,4 ℃保存。參照血尿素氮測(cè)試盒、乳酸脫氫酶測(cè)試盒說明書方法,結(jié)合紫外可見光分光光度計(jì)測(cè)量血清BUN的含量及LDH活力。

GSH-Px、ATPase活力(Ca2+-Mg2+-ATPase和Na+-K+-ATPase)的測(cè)定:小鼠處死,解剖取出肝臟,預(yù)冷的生理鹽水洗去血液,冰浴中制成10%肝勻漿。參照谷胱甘肽過氧化物酶測(cè)試盒和三磷酸腺苷測(cè)試盒說明書操作測(cè)定上述指標(biāo)。

1.2.4 果蠅睡眠實(shí)驗(yàn)

1.2.4.1 果蠅實(shí)驗(yàn)環(huán)境 果蠅飼養(yǎng)于果蠅培養(yǎng)室中,通風(fēng)、避光,采用自動(dòng)定時(shí)光控系統(tǒng)對(duì)果蠅生活環(huán)境實(shí)行每天12 h的明暗光照周期處理,實(shí)驗(yàn)溫度為(24±1) ℃,相對(duì)濕度為50%～60%。

1.2.4.2 果蠅培養(yǎng)基制備 培養(yǎng)基制備的配制參照卞宏生等[8]文獻(xiàn)。在基礎(chǔ)培養(yǎng)基配方基礎(chǔ)上加入東北刺人參根凍干粉,按照文獻(xiàn)方法制備成濃度分別為0.500%、0.250%、0.125%、0.0625%、0.0313%的含藥培養(yǎng)基,完全凝固后,倒置于操作臺(tái)面上,備用。

1.2.4.3 實(shí)驗(yàn)分組 以7日齡野生型Canton S品系黑腹果蠅作為觀察對(duì)象。收集8 h內(nèi)羽化未交配的果蠅,CO2輕微麻醉后區(qū)分雌、雄,分為空白組和東北刺人參給藥組,每組32只。將新生果蠅置于相應(yīng)環(huán)境中,基礎(chǔ)培養(yǎng)基中培養(yǎng)3 d后,分別移入含基礎(chǔ)培養(yǎng)基和含藥培養(yǎng)基(0.500%、0.250%、0.125%、0.0625%、0.0313%)的監(jiān)測(cè)管中,連續(xù)給藥4 d,記錄第7 d上午7:00至第8 d上午7:00雌雄果蠅的睡眠時(shí)間;同理,將新生果蠅培養(yǎng)3 d后,分別移入含基礎(chǔ)培養(yǎng)基和含藥培養(yǎng)基(0.500%、0.125%、0.0313%)的監(jiān)測(cè)管中,記錄雌雄果蠅的睡眠發(fā)生次數(shù)、自主活動(dòng)次數(shù)及睡眠覺醒節(jié)律。

1.2.4.4 果蠅24 h睡眠覺醒節(jié)律監(jiān)測(cè) 采用DAMS儀,監(jiān)測(cè)果蠅早7:00至次日早7:00的睡眠。通過DAMS數(shù)據(jù)采集軟件每隔5 min自動(dòng)記錄一次果蠅活動(dòng)次數(shù),連續(xù)記錄的24 h。若5 min內(nèi)活動(dòng)次數(shù)記錄為零,即果蠅靜止時(shí)間持續(xù)5 min以上時(shí),此休息狀態(tài)符合睡眠行為標(biāo)準(zhǔn),認(rèn)為果蠅處于睡眠狀態(tài),記為果蠅睡眠時(shí)間[8]。

1.3 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 小鼠力竭游泳時(shí)間

游泳時(shí)間是小鼠運(yùn)動(dòng)耐力的體現(xiàn),是衡量藥物抗疲勞作用的重要指標(biāo)[9]。由表1可知,與空白組相比，東北刺人參高、中、低劑量組小鼠游泳時(shí)間均延長(zhǎng),其中東北刺人參高劑量組負(fù)重游泳時(shí)間增加具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)果表明,東北刺人參能延長(zhǎng)負(fù)重小鼠游泳時(shí)間,增強(qiáng)其抗疲勞能力。

表1 東北刺人參對(duì)負(fù)重小鼠力竭游泳時(shí)間的影響Table 1 Effects of Oplopanax elatus on swimming time of mice

注:“*”表示與空白對(duì)照組相比差異顯著(P<0.05);“**”表示與空白對(duì)照組相比差異極顯著(P<0.01);表2～表6同。

2.2 對(duì)臟器指數(shù)的影響

由表2可見,與空白對(duì)照組相比,各給藥組小鼠的胸腺系數(shù)均大于空白對(duì)照組,但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。刺人參凍干粉高、低劑量組的小鼠脾臟系數(shù)有增高趨勢(shì),但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)果表明,東北刺人參具有一定增強(qiáng)機(jī)體免疫功能的作用。

表2 東北刺人參對(duì)游泳小鼠臟器指數(shù)的影響Table 2 Effects of Oplopanax elatus on viscera indices of mice

2.3 對(duì)血清BUN和LDH含量的影響

本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明,各給藥組小鼠血清BUN含量與空白對(duì)照組相比均降低,且東北刺人參凍干粉高劑量組的血清BUN降低的含量具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),即說明了東北刺人參可以抑制或減少小鼠血尿素氮的產(chǎn)生,提高其抗疲勞能力[10]。同理,與空白對(duì)照組相比,刺人參凍干粉高劑量組的LDH活性升高有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)果表明,東北刺人參能提高游泳小鼠LDH活性,延緩疲勞產(chǎn)生或加速乳酸消除作用[10]。

表3 東北刺人參對(duì)游泳小鼠血BUN和LDH含量的影響Table 3 Effects of Oplopanax elatus on BUN and LDH content of mice

2.4 對(duì)GSH-Px活性的影響

由表4可知,與空白對(duì)照組相比,各給藥組小鼠GSH-Px活性均升高,其中,刺人參凍干粉高劑量組的GSH活性升高有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,東北刺人參干預(yù)后小鼠的GSH-Px活性升高,提示刺人參與人參相似,可以減少自由基的堆積,加快體內(nèi)脂質(zhì)過氧化物的清除。

表4 東北刺人參對(duì)游泳小鼠GSH-Px 活性的影響Table 4 Effects of Oplopanax elatus on GSH-Px activity of swimming mice

2.5 對(duì)ATPase活力的影響

實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表5所示,與空白對(duì)照組相比,刺人參凍干粉高劑量組的Ca2+-Mg2+-ATPase活力升高有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),提示東北刺人參能增加力竭游泳小鼠肝臟中Na+-K+-ATPase、Ca2+-Mg2+-ATPase的含量,具有保護(hù)線粒體氧化磷酸化的作用[11]。

表5 東北刺人參對(duì)小鼠ATPase活力的影響Table 5 Effects of Oplopanax elatus on ATPase activity of mice

2.6 東北刺人參對(duì)果蠅睡眠時(shí)間的影響

由圖1可知,與空白對(duì)照組相比,給藥濃度為0.5000%、0.2500%、0.1250%、0.0625%和0.0313%組的東北刺人參對(duì)雄果蠅全天睡眠時(shí)間增加有極顯著性影響(P<0.01);給藥濃度為0.2500%和0.1250%組極顯著降低雌果蠅的全天睡眠時(shí)間(P<0.01),其他各組無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。白天睡眠時(shí)間的影響結(jié)果顯示,與空白組比較,各組雄果蠅白天睡眠時(shí)間增加有極顯著影響(P<0.01);除0.0625%組與空白組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義外,其余各組均可不同程度減少雌果蠅白天睡眠時(shí)間。夜晚睡眠時(shí)間的影響結(jié)果顯示,給藥濃度為0.5000%和0.2500%組可不同程度增加雄果蠅夜晚睡眠時(shí)間,給藥濃度為0.5000%和0.0313%組可極顯著增加雌果蠅夜晚睡眠時(shí)間(P<0.01)。上述結(jié)果顯示,東北刺人參能夠顯著延長(zhǎng)雄果蠅的全天和白天睡眠時(shí)間,而雌果蠅白天睡眠時(shí)間顯著減少。

圖1 東北刺人參對(duì)7日齡果蠅平均睡眠-覺醒周期的影響Fig.1 Effects of Oplopanax elatus on average sleep-awakening of 7-day Drosophila注:“*”表示與空白對(duì)照組相比差異顯著升高(P<0.05); “**”表示與空白對(duì)照組相比差異極顯著升高(P<0.01); “#”表示與空白對(duì)照組相比差異顯著降低(P<0.05); “##”表示與空白對(duì)照組相比差異 極顯著降低(P<0.01)；圖2同。

2.7 東北刺人參對(duì)7日齡果蠅睡眠發(fā)生次數(shù)的影響

由圖2可知,與空白組比較,給藥濃度為0.500%、0.125%和0.0313% 組的東北刺人參對(duì)雄果蠅的全天夜晚平均睡眠發(fā)生次數(shù)增加有極顯著性影響(P<0.01),各給藥組對(duì)雌果蠅的全天平均睡眠發(fā)生次數(shù)的影響無顯著性意義;白天平均睡眠發(fā)生次數(shù)的影響結(jié)果顯示,與空白組比較,0.5000%、0.1250%和0.0313%組與空白組比較雄果蠅的平均睡眠發(fā)生次數(shù)增加均有極顯著差異(P<0.01),但各組不同程度減少雌果蠅白天平均睡眠發(fā)生次數(shù);夜晚平均睡眠發(fā)生次數(shù)的影響結(jié)果顯示,各給藥組對(duì)雄果蠅的夜晚平均睡眠發(fā)生次數(shù)的影響無顯著性意義;給藥濃度為0.5000%和0.0313%組可極顯著增加雌果蠅夜晚平均睡眠發(fā)生次數(shù)(P<0.01)。上述結(jié)果顯示,東北刺人參能夠顯著增加雄果蠅的全天和白天平均睡眠發(fā)生次數(shù),而對(duì)雌果蠅的影響體現(xiàn)在減少白天平均睡眠發(fā)生次數(shù),增加夜晚平均睡眠發(fā)生次數(shù)。

圖3 不同濃度東北刺人參干預(yù)后果蠅睡眠-覺醒圖Fig.3 Effects of Oplopanax elatus on sleep-awakening of Drosophila注:圖中白色部分表示活動(dòng),黑色部分表示睡眠。

圖2 東北刺人參對(duì)果蠅平均睡眠發(fā)生次數(shù)的影響Fig.2 Effects of Oplopanax elatus on average number of sleeps of Drosophila

2.8 東北刺人參對(duì)7日齡果蠅自主活動(dòng)的影響

由表6可知,與空白組比較,給藥濃度為0.125%和0.0313%的東北刺人參對(duì)雄果蠅的自主活動(dòng)次數(shù)降低有顯著性影響(P<0.05或P<0.01),0.500%和0.0313%組減少雌果蠅的自主活動(dòng)次數(shù)具有極顯著意義(P<0.01)。

表6 東北刺人參對(duì)果蠅平均自主活動(dòng)次數(shù)的影響Table 6 Effects of Oplopanax elatus on autonomic activity of Drosophila

2.9 東北刺人參對(duì)果蠅睡眠-覺醒節(jié)律改變的干預(yù)作用

由圖3分析可知,不同濃度的東北刺人參主要是通過增加雄果蠅白天和夜晚睡眠時(shí)間,減少片段化睡眠,延長(zhǎng)總睡眠時(shí)間。同時(shí),其對(duì)雌果蠅睡眠的影響主要體現(xiàn)在減少白天活動(dòng)時(shí)間,縮短果蠅片段化睡眠,增加夜晚睡眠時(shí)間,且明顯后移睡眠相位角,這種作用以給藥濃度為0.5000%最為明顯。

3 結(jié)論與討論

國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)報(bào)道,人參皂苷類成分具有顯著的抗疲勞和抗應(yīng)激作用[12-14]。東北刺人參與人參的生物活性相似,有學(xué)者報(bào)道東北刺人參莖能延長(zhǎng)小鼠的耐缺氧時(shí)間和負(fù)重游泳時(shí)間,降低小鼠血乳酸含量。本實(shí)驗(yàn)考察了東北刺人參根的抗疲勞活性,研究顯示,東北刺人參可顯著延長(zhǎng)負(fù)重小鼠的力竭游泳時(shí)間,提高運(yùn)動(dòng)耐力;東北刺人參能夠降低BUN的含量,抑制體內(nèi)蛋白質(zhì)分解代謝及支鏈氨基酸代謝過程,緩解疲勞的發(fā)生;東北刺人參高劑量組小鼠LDH的含量均高于空白對(duì)照組,這表明其有助于提高乳酸脫氫酶的活性,延緩疲勞產(chǎn)生或加速乳酸消除作用[15-16];東北刺人參干預(yù)后小鼠的GSH-Px活性升高,表明其與人參相似,可以減少自由基的堆積,加快體內(nèi)脂質(zhì)過氧化物的清除[17];藥物干預(yù)后小鼠的Na+-K+-ATP酶及Ca2+-Mg2+-ATP酶含量均高于空白對(duì)照組,這表明了刺人參具有保護(hù)線粒體氧化磷酸化功能作用[18-19]。上述結(jié)果表明,東北刺人參根可以延長(zhǎng)小鼠力竭游泳時(shí)間,提高其運(yùn)動(dòng)耐力,增加臟器指數(shù),降低小鼠BUN含量,提高小鼠LDH與GSH活力,提高Ca2+-Mg2+-ATP酶及Na+-K+-ATP酶活性,減少自由基的堆積,加快體內(nèi)代謝產(chǎn)物的清除,發(fā)揮延緩疲勞的作用。

東北刺人參具有顯著的改善睡眠作用,本實(shí)驗(yàn)考察了其對(duì)睡眠節(jié)律的影響。研究結(jié)果顯示,東北刺人參根對(duì)果蠅睡眠-覺醒節(jié)律調(diào)節(jié)的最佳給藥濃度為0.5000%,該藥物能夠顯著延長(zhǎng)雄果蠅的全天、白天平均睡眠時(shí)間和平均睡眠發(fā)生次數(shù),減少自主活動(dòng)次數(shù),而雌果蠅白天睡眠時(shí)間顯著減少,夜晚睡眠時(shí)間增加。通過分析藥物干預(yù)前后睡眠-覺醒圖我們發(fā)現(xiàn),12/12 h明暗交替組的果蠅往往在19:00熄燈前后陸續(xù)出現(xiàn)睡眠狀態(tài),在次日6:00左右覺醒,而給予藥物后的雌果蠅覺醒時(shí)間延遲至18:00

左右。這一現(xiàn)象在近日生理學(xué)中稱為睡眠時(shí)相后移,而這種研究果蠅整體節(jié)律特點(diǎn)的方法,稱為群體節(jié)律研究[20]。上述結(jié)果提示,東北刺人參根可以增加果蠅睡眠時(shí)間,減少自主活動(dòng)次數(shù),縮短片段化睡眠,且明顯后移睡眠相位角,改善睡眠質(zhì)量。

綜上所述,東北刺人參根具有改善睡眠質(zhì)量及抗疲勞的作用,但其發(fā)揮上述作用的物質(zhì)基礎(chǔ)和作用機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。東北刺人參具有廣闊的開發(fā)前景,其生物活性的基礎(chǔ)研究及人工栽培品的應(yīng)用值得進(jìn)一步探索。