基于HS-SPME-GC-MS分析茶葉 提取物對(duì)奶酪揮發(fā)性風(fēng)味的影響

徐振麗,鄭曉吉,陳計(jì)巒,王 斌,鄭曉春,李晗暢,史學(xué)偉

(石河子大學(xué)食品學(xué)院,新疆石河子 832000)

茶葉起源于中國(guó),是我國(guó)重要的農(nóng)產(chǎn)品,具有種類(lèi)繁多、茶香濃郁等特點(diǎn),在我國(guó)有著悠久的飲用歷史[1]。茶葉中含有多種功能性成分,如茶多酚、氨基酸、茶多糖、生物堿和維生素等,具有抑菌、抗氧化、防癌及降血糖、降血壓等藥理作用[2]。奶酪又被稱(chēng)為“乳黃金”,是一種具有極高營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的發(fā)酵乳制品,不僅富含蛋白質(zhì)、脂肪,還含有豐富的礦物質(zhì)和微量元素[3]。食物的揮發(fā)性風(fēng)味組分是評(píng)價(jià)其品質(zhì)的重要指標(biāo),同時(shí)也是影響消費(fèi)者選擇和購(gòu)買(mǎi)的重要因素之一[4]。隨著我國(guó)經(jīng)濟(jì)水平的逐漸提高,消費(fèi)者的健康意識(shí)逐漸提升,乳制品的消費(fèi)也逐漸向多元化發(fā)展,營(yíng)養(yǎng)價(jià)值極高的奶酪開(kāi)始走向大眾視野,但奶酪獨(dú)特的風(fēng)味并不能被消費(fèi)者廣泛接受,因此研制出風(fēng)味良好的奶酪對(duì)于奶酪的工業(yè)化發(fā)展具有重要意義。

目前國(guó)內(nèi)外對(duì)于奶酪風(fēng)味的研究相對(duì)較少,且主要集中于已有奶酪的揮發(fā)性風(fēng)味研究。馬艷麗等[5]利用固相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜分析方法,檢測(cè)并比較4種傳統(tǒng)中式酸凝奶酪(奶疙瘩、奶豆腐、乳扇、乳餅)與西方切達(dá)奶酪中揮發(fā)性風(fēng)味組分的差別。鄭曉吉等[6]采用頂空固相微萃取結(jié)合氣質(zhì)聯(lián)用技術(shù)(SPME/GC-MS),對(duì)采集自新疆哈薩克族不同居住地區(qū)20種奶酪樣品中揮發(fā)性風(fēng)味組分進(jìn)行了研究。Francisco等[7]運(yùn)用SPME-GC-MS分析了山羊奶酪四個(gè)成熟階段(1、30、60和90 d)的揮發(fā)性化合物。但目前茶葉提取物對(duì)奶酪揮發(fā)性風(fēng)味影響的相關(guān)文獻(xiàn)鮮有報(bào)道。Ozturkoglu-Budak等[8]對(duì)3個(gè)不同奶牛場(chǎng)生產(chǎn)的土耳其洞穴奶酪在生產(chǎn)和成熟過(guò)程中揮發(fā)性化合物進(jìn)行了測(cè)定,檢出110種化合物,包括酸、醇、酮、酯和萜烯。

茶葉中含有多種呈味物質(zhì),香氣醇厚,將中國(guó)傳統(tǒng)的茶葉提取物加至奶酪中將會(huì)對(duì)奶酪揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)產(chǎn)生重要的影響。但我國(guó)現(xiàn)有研究主要集中于茶奶酪制作工藝及抗氧化研究,而茶奶酪風(fēng)味研究鮮有報(bào)道。因此,本文基于前期研究工作,探討茶葉提取物對(duì)奶酪揮發(fā)性風(fēng)味的影響,以期為我國(guó)奶酪產(chǎn)業(yè)多元化發(fā)展提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

牛奶 新疆石河子花園乳液有限公司;特制茯磚茶 湖南益陽(yáng)茶廠有限公司;綠茶(碧螺春) 信陽(yáng)天潭茶葉有限公司;奶酪發(fā)酵劑(保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌) 北京川秀科技有限公司;精制食鹽 中國(guó)鹽業(yè)集團(tuán)有限公司;凝乳酶(小牛皺胃酶,酶活≥100000 U/g);2-辛醇、正構(gòu)烷烴(C6-C30) 色譜純,美國(guó)Sigma-Aldrich公司。

SPX-50電熱恒溫培養(yǎng)箱 上海力辰儀器科技有限公司;B250水浴鍋 上海予卓?jī)x器有限公司;AUY120分析天平 日本島津有限公司;SCION SQ 456-GC氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀 美國(guó)BRUKER公司;75 μm Car/PDMS fibres 美國(guó)SUPELCO公司、DB-WAX 毛細(xì)管柱(30 m×0.25 mm,0.25 μm) 美國(guó)安捷倫有限公司、JP-1000B-2高速多功能粉碎機(jī) 永康市久品工貿(mào)有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 奶酪樣品的準(zhǔn)備 參考切達(dá)奶酪制作工藝[9],采用前期優(yōu)化好的茶奶酪生產(chǎn)工藝,制作3種奶酪(原奶酪、綠茶奶酪、茯苓茶奶酪)。茶葉添加量1%、發(fā)酵劑添加量0.3%、發(fā)酵溫度40 ℃、發(fā)酵時(shí)間7 h和凝乳酶添加量2 mg/L。綠茶或茯磚茶經(jīng)粉粹后過(guò)10目篩,置于牛奶中于80 ℃水浴浸泡20 min,6層紗布過(guò)濾,濾液與牛奶混合經(jīng)巴氏殺菌(63 ℃,30 min),然后冷卻至37 ℃,添加發(fā)酵劑發(fā)酵,添加凝乳酶于38 ℃凝乳1 h,切割成0.5 cm方凝塊,于室溫下靜置10 min,同方向攪拌10 min,利用模具排乳清并壓榨成型,得到新鮮茶奶酪,涂抹2%食鹽,真空包裝并于濕度85%,溫度12 ℃條件下成熟30 d,-4 ℃保存。從奶酪的橫截面收集1 cm厚片狀奶酪作為樣品,用于奶酪的風(fēng)味物質(zhì)分析,實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。

1.2.2 HS-SPME提取方法 參考Francisco等[10]和Li等[11]的方法,取8 g奶酪樣品置于20 mL頂空瓶中,加入10 μL 100 μg/mL的2-辛醇作內(nèi)標(biāo),將老化后的75 μm CAR/PDMS萃取頭插入樣品瓶頂空部分,于60 ℃吸附30 min,吸附后的萃取頭取出后插入氣相色譜進(jìn)樣口,于250 ℃解吸3 min,啟動(dòng)儀器采集數(shù)據(jù)。

1.2.3 GC-MS檢測(cè)條件 采用DB-WAX 色譜柱(規(guī)格30 m×0.25 mm×0.25 μm),升溫程序參考Urgeghe等[12]的方法:初始柱溫40 ℃,保持3 min,以5 ℃/min 升到90 ℃保持1 min,再以3 ℃/min升高到150 ℃,最后以10 ℃/min 升到230 ℃,保持10 min。進(jìn)樣口溫度250 ℃,載氣為氦氣(He),流速為0.8 mL/min。電離子源(electron ionization,EI),電子能量70 eV,離子源溫度為200 ℃,質(zhì)譜接口溫度250 ℃,檢測(cè)器溫度為280 ℃,掃描范圍為20～350 amu,每個(gè)樣品平行3次。

1.2.4 揮發(fā)性化合物定性和定量分析 奶酪樣品中揮發(fā)性化合物定性:實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)經(jīng)檢索并與數(shù)據(jù)庫(kù)NIST和WILEY中的圖譜進(jìn)行比對(duì)分析;與標(biāo)準(zhǔn)品的保留指數(shù)值進(jìn)行分析比對(duì);此外與已報(bào)到的參考文獻(xiàn)中該化合物的RI共同確定。在同樣色譜條件下,以C6～C23的正構(gòu)烷烴為標(biāo)準(zhǔn),GC-MS分析并根據(jù)公式(1)計(jì)算待測(cè)化合物x的保留指數(shù)。按式(1)計(jì)算保留指數(shù)(RI):

式(1)

式中：tRx-待測(cè)化合物的調(diào)整保留時(shí)間,min;tRn-碳原子數(shù)為n的正構(gòu)烷烴調(diào)整保留時(shí)間,min;tRn+1-碳原子數(shù)為n+1的正構(gòu)烷烴調(diào)整保留時(shí)間,min;n-碳原子數(shù)。

本試驗(yàn)采用內(nèi)標(biāo)法對(duì)奶酪中揮發(fā)性化合物進(jìn)行定量,待測(cè)揮發(fā)性化合物的濃度按公式(2)進(jìn)行計(jì)算。

式(2)

式中：Cx-待測(cè)揮發(fā)性化合物的濃度,μg/g;Ax-待測(cè)揮發(fā)性化合物的峰面積;A內(nèi)標(biāo)-內(nèi)標(biāo)物的峰面積;C內(nèi)標(biāo)-內(nèi)標(biāo)物的濃度,μg/g。

1.2.5 感官評(píng)定 3種奶酪樣品的感官評(píng)價(jià)小組由身體健康、無(wú)不良嗜好、表達(dá)能力良好的5名男性和5名女性評(píng)價(jià)人員組成。評(píng)價(jià)人員使用的感官評(píng)價(jià)表參考O’Callaghan等[13]研究附表S1中奶油味、果香味、堅(jiān)果味等詞匯進(jìn)行感官描述。采用十點(diǎn)感官評(píng)定法:0～10表示香氣強(qiáng)度逐漸增強(qiáng),其中0表示香氣未被察覺(jué),10分表示氣味清晰,香氣強(qiáng)度最強(qiáng)。所有奶酪樣品均隨機(jī)擺放,每個(gè)樣品重復(fù)三次。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行方差分析(ANOVA)和主成分分析,Origin 2017軟件進(jìn)行繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 茶葉提取對(duì)奶酪揮發(fā)性風(fēng)味成分的影響

采用頂空固相微萃取法結(jié)合氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(HS-SPME-GC-MS)對(duì)原奶酪、綠茶奶酪和茯磚茶奶酪揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行提取測(cè)定,如表1所示,共檢出56種揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì),其中原奶酪、綠茶奶酪和茯磚茶奶酪分別檢出37種、36種和39種揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)。由圖1可知,與原奶酪相比,茶奶酪酸類(lèi)、酯類(lèi)揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的含量更高,因此茶葉提取物對(duì)奶酪揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的影響較為明顯。但綠茶與茯磚茶奶酪的主要揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)不同,綠茶提取物增加了奶酪中的酸類(lèi)化合物,而茯磚茶提取物增加了奶酪中的酯類(lèi)物質(zhì)。

圖1 原奶酪、綠茶奶酪、茯磚茶奶酪中 各揮發(fā)性組分相對(duì)含量Fig.1 Relative contents of each volatile compounds in cheese,green tea cheese and brick tea cheese

表1 原奶酪、綠茶奶酪、茯磚茶奶酪揮發(fā)性化合物相對(duì)含量分析Table 1 Relative contents of volatile compounds in cheese,green tea cheese and brick tea

續(xù)表

注:同行不同小寫(xiě)字母代表差異顯著(P<0.05)。

2.1.1 酸類(lèi)化合物 酸類(lèi)化合物不僅是奶酪中香氣成分,還是甲基酮、內(nèi)酯和醛類(lèi)等風(fēng)味物質(zhì)的前體,對(duì)于奶酪風(fēng)味的形成有著重要影響[14]。表1中酸類(lèi)化合物在原奶酪、綠茶奶酪和茯磚茶奶酪的總含量分別為9.43、12.41和12.90 μg/g,綠茶奶酪中的酸類(lèi)化合物含量顯著高于原奶酪(P<0.05)。相關(guān)研究表明,綠茶對(duì)發(fā)酵乳制品中有機(jī)酸類(lèi)物質(zhì)有積極的影響[15]。如表1所示,茶葉提取物可以顯著增加奶酪中丁酸、辛酸和9-癸烯酸的含量(P<0.05)。丁酸有難聞的氣味,是Parmigiano-Reggiano干酪的特征風(fēng)味物質(zhì)[16],辛酸有汗臭味,是意大利PDO綿羊奶酪短鏈線(xiàn)性脂肪酸中最具代表性的羧酸化合物[12],這兩種酸類(lèi)化合物具有較高的香氣活力值,對(duì)奶酪整體奶香風(fēng)味的形成具有積極的促進(jìn)作用[17]。茯磚茶提取物可以增加奶酪中的癸酸含量,綠茶提取物顯著增加奶酪中己酸含量(P<0.05),己酸和癸酸是牛乳在脂酶的作用下,催化乳脂肪降解為低級(jí)脂肪酸或水解產(chǎn)生的,是奶酪風(fēng)味的重要影響因素[14,18]。

2.1.2 酯類(lèi)化合物 如表1所示,原奶酪、綠茶奶酪和茯磚茶奶酪分別有3種、4種和12種酯類(lèi),茯磚茶奶酪中的酯類(lèi)物質(zhì)的種類(lèi)大于綠茶奶酪和原奶酪,并且其含量高達(dá)53.16 μg/g,是茯磚茶奶酪主要的揮發(fā)性風(fēng)味成分。綠茶提取物有助于增加奶酪中乙酸香葉酯、乙酸乙酯的含量,其中乙酸乙酯是艾達(dá)姆干酪中含量豐富的酯類(lèi)物質(zhì),可以賦予奶酪香蕉、蘋(píng)果以及微弱的玫瑰香[19]。乙酸香葉酯是茶葉的特征風(fēng)味物質(zhì),是綠茶奶酪中特有的酯類(lèi)物質(zhì),但由于其香氣閾值值較高,對(duì)奶酪清甜檸檬果香及甜潤(rùn)的花香氣味影響不大[1]。茯磚茶提取物可以顯著增加奶酪中2-羥基丙酸乙酯、丁酸乙酯、巴豆酸戊酯、己酸乙酯、辛酸乙酯、壬酸乙酯、辛酸丁酯、癸酸乙酯、9-癸烯酸乙酯、十二烷酸乙酯和十四烷酸乙酯的含量(P<0.05),且多為乙酯類(lèi),尤其是C2～C10的乙酯類(lèi)物質(zhì)具有較低的香閾值,對(duì)奶酪整體風(fēng)味的平衡起促進(jìn)作用,使奶酪具有果香風(fēng)味[20]。

2.1.3 醇類(lèi)化合物 三種奶酪共檢測(cè)出14種醇類(lèi)化合物,添加綠茶和茯磚茶提取物的奶酪醇類(lèi)化合物的含量顯著下降(P<0.05),由33.59 μg/g分別下降至13.58和14.55 μg/g。在茯磚茶奶酪中,醇類(lèi)化合物下降的主要原因是茯磚茶提取促進(jìn)了醇類(lèi)和酸類(lèi)的酯化反應(yīng)[21]。在綠茶奶酪中,醇類(lèi)物質(zhì)下降可能是由于綠茶提取物促進(jìn)了乙醇脫氫酶的作用下,將醇類(lèi)化合物還原成相應(yīng)的醛或酮類(lèi)物質(zhì)。綠茶提取物提高了奶酪中芳樟醇的含量,芳樟醇可以賦予奶酪濃青帶甜的木青香氣。茯磚茶提取物可以顯著(P<0.05)增加奶酪中2-壬醇和苯乙醇的含量,其分別具有果香和玫瑰香味[22]。

2.1.4 醛類(lèi)和酮類(lèi)化合物 原奶酪、綠茶奶酪和茯磚茶奶酪共檢測(cè)出6種醛類(lèi)化合物和7中酮類(lèi)化合物。如圖2所示,添加茶葉提取物后,奶酪中醛類(lèi)和酮類(lèi)化合物均明顯下降。其中苯甲醛的含量大幅下降,但由于苯甲醛的香氣閾值高于其他醛類(lèi)物質(zhì)100多倍,并且醛類(lèi)化合物化學(xué)性質(zhì)相對(duì)活潑,是不穩(wěn)定的中間產(chǎn)物,易被還原成相應(yīng)的醇和酸[23]。因此,醛類(lèi)化合物對(duì)于奶酪整體風(fēng)味的貢獻(xiàn)不大。

圖2 原奶酪、綠茶奶酪和茯磚茶奶酪主成分分析圖Fig.2 Principal component analysis(PCA)of volatile flavor compounds in cheese,green tea cheese and brick tea cheese注:圖2中各揮發(fā)性化合物序號(hào)與表1同。

原奶酪中的酮類(lèi)化合物含量較高,酮類(lèi)化合物香氣感受閾值低,對(duì)奶酪整體風(fēng)味貢獻(xiàn)較大[17]。2-庚酮、3-辛酮和2-壬酮是原奶酪中主要的酮類(lèi)化合物,甲基酮類(lèi)物質(zhì)是藍(lán)紋干酪奶油風(fēng)味的主要貢獻(xiàn)者[24],其中2-庚酮是Emmental和天然和奶油Gorgonzola的重要風(fēng)味化合物,2-壬酮是天然Gorgonzola和成熟的Ragusano奶酪中另一種主要的甲基酮。

2.1.5 萜烯和內(nèi)酯類(lèi)化合物 原奶酪、綠茶奶酪和茯磚茶奶酪檢出4種萜烯類(lèi)化合物和6種醛類(lèi)化合物。綠茶提取物可以顯著增加奶酪中萜烯類(lèi)化合物的總含量(P<0.05),尤其是苯并環(huán)丁烯,苯并環(huán)丁烯是綠茶奶酪中特有的萜烯類(lèi)化合物,但由于萜烯類(lèi)化合物具有高芳香閾值,對(duì)奶酪整體風(fēng)味的貢獻(xiàn)率較小[25]。三種奶酪樣品中共檢測(cè)出3種內(nèi)酯類(lèi)化合物,含量普遍偏低。添加茶葉提取物對(duì)奶酪中內(nèi)酯類(lèi)化合物的影響較小,內(nèi)酯類(lèi)風(fēng)味物質(zhì)具有強(qiáng)烈的奶油香特征,并且其風(fēng)味閾值較低,對(duì)奶酪奶油風(fēng)味的形成有重要作用[26]。

2.1.6 主成分分析(PCA) 對(duì)原奶酪、綠茶奶酪和茯磚茶奶酪的風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行主成分分析,結(jié)果如圖2所示,主成分1和主成分2的累積方差貢獻(xiàn)率為76%和24%。原奶酪、綠茶奶酪和茯磚茶奶酪的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)具有明顯差異,在主成分分析中可以得到明顯區(qū)分,表明茶葉提取物對(duì)奶酪揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)產(chǎn)生重要影響。己酸、4-苯基-環(huán)內(nèi)酯和芳樟醇是綠茶奶酪區(qū)別于其它奶酪的特征風(fēng)味物質(zhì),癸酸乙酯、十二烷酸乙酯、辛酸乙酯和9-癸烯酸乙酯是茯磚茶奶酪區(qū)別于其它奶酪的特征風(fēng)味物質(zhì)。

2.2 茶奶酪感官評(píng)定

10名感官評(píng)定人員對(duì)3種奶酪的10個(gè)指標(biāo)[13,27-28](甜味、苦味、青草味、奶油味、酸味、果香味、氧化味、腐臭味、堅(jiān)果味和黃油味)進(jìn)行感官評(píng)價(jià),評(píng)價(jià)結(jié)果見(jiàn)圖3。原奶酪、綠茶奶酪和茯磚茶奶酪的感官具有明顯差異,主要表現(xiàn)在苦味、青草味、果香味和氧化味,添加茶葉提取物的奶酪青草味明顯,同時(shí)苦味有些許提升,茯磚茶奶酪的果香味較其他兩種奶酪有明顯提升,可能是由于茯磚茶奶酪中的乙酯類(lèi)化合物的種類(lèi)和含量較多,對(duì)奶酪整體果香風(fēng)味有重要影響。添加茶葉提取物的奶酪氧化味降低,可能是由于茶葉提取物中含有茶多酚等天然抗氧化成分,使得茶奶酪中氧化味降低[29]。

圖3 原奶酪、綠茶奶酪和茯磚茶奶酪感官評(píng)定Fig.3 Sensory evaluation of cheese, green tea cheese and brick tea cheese

3 結(jié)論

以原奶酪、綠茶奶酪和茯磚茶奶酪為研究對(duì)象,通過(guò)HS-SPME-GC-MS分析技術(shù)探究茶葉提取物對(duì)奶酪風(fēng)味成分的影響,結(jié)果顯示原奶酪、綠茶奶酪和茯磚茶奶酪中分別含有37種、36種、39種揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)。2-壬酮、苯甲醛、苯甲醇和3-辛酮為原奶酪的特征揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)。己酸、4-苯基-1-環(huán)己烯和芳樟醇為綠茶奶酪的特征風(fēng)味物質(zhì),綠茶提取物可以顯著(P<0.05)增加奶酪中萜烯類(lèi)化合物的含量,尤其是苯并環(huán)丁烯,苯并環(huán)丁烯是綠茶奶酪中特有的萜烯類(lèi)化合物。茯磚茶提取物可以顯著(P<0.05)增加奶酪中乙酯類(lèi)化合物含量,尤其是癸酸乙酯、十二烷酸乙酯、辛酸乙酯和9-癸烯酸乙酯為茯磚茶奶酪特征風(fēng)味物質(zhì)。三種奶酪感官評(píng)定分析顯示,綠茶與茯磚茶奶酪具有較高的感官評(píng)分?？梢缘贸?茶葉提取物可有效改善奶酪風(fēng)味,對(duì)奶酪品質(zhì)具有積極地促進(jìn)作用。