藜蒿莖抑制黃嘌呤氧化酶活性成分提取條件優(yōu)化及其成分分析

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(1.南昌大學(xué)，食品科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江西南昌 330047; 2.南昌大學(xué)食品學(xué)院,江西南昌 330031; 3.南昌大學(xué)，中德食品工程中心,江西南昌 330047)

在生物體中存在黃素蛋白酶——黃嘌呤氧化酶(Xanthine oxidase,XOD),能夠催化體內(nèi)的底物黃嘌呤與次黃嘌呤形成尿酸,長期的嘌呤代謝紊亂可能會(huì)引起生物體內(nèi)尿酸生成增多或尿酸排泄減少,體內(nèi)尿酸濃度升高容易導(dǎo)致高尿酸血癥,進(jìn)一步可引起痛風(fēng)發(fā)作[1],根據(jù)統(tǒng)計(jì)約有5%～12%的高尿酸血癥最終可發(fā)展為痛風(fēng)[2-3]。研究表明,痛風(fēng)不但可以引起骨頭和關(guān)節(jié)上的疾病,而且還與肥胖、高血脂、高血壓、糖尿病、動(dòng)脈粥樣硬化等疾病密切相關(guān)[4-6],已被聯(lián)合國列為21世紀(jì)20大頑癥之一[7]。XOD是催化黃嘌呤和次黃嘌呤代謝產(chǎn)生尿酸的關(guān)鍵酶,而黃嘌呤氧化酶抑制劑(Xanthine Oxidase Inhibitor,XOI)能同XOD結(jié)合,降低次黃嘌呤或黃嘌呤生成尿酸的速率,抑制尿酸生成。傳統(tǒng)的抗痛風(fēng)藥物如別嘌醇、非布索坦通過抑制XOD活性達(dá)到治療效果,但存在較大的毒副作用[8-9]。苯溴馬隆等通過促進(jìn)尿酸的排泄來達(dá)到降尿酸的作用[10],但這些藥物常常伴隨有皮疹、發(fā)熱等副作用。因此開發(fā)安全性高的天然黃嘌呤氧化酶抑制劑具有實(shí)際意義。

藜蒿(ArtemisiaselengensisTurcz.)為菊科蒿屬植物,自古以來就是一種既可供食用又可入藥的時(shí)令性野生蔬菜,現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn),藜蒿具有抗氧化[11]、抗腫瘤[12]、抑菌[13]、降壓[14]等作用,但對(duì)于藜蒿提取物抑制XOD活性,緩解高尿酸血癥的研究報(bào)道較少。李思慧等[15]檢測(cè)了24種蔬菜(藜蒿、香菜、芽白秧、生菜等)醇提物對(duì)XOD的抑制作用,同等劑量下藜蒿提取物的抑制率最高,動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中也發(fā)現(xiàn)藜蒿提取物具有較強(qiáng)降尿酸作用,并能抑制肝臟XOD的活性。藜蒿主要食用部分為莖而非葉,本研究以藜蒿莖中具XOD抑制能力的成分為研究對(duì)象,通過單因素實(shí)驗(yàn)和響應(yīng)曲面試驗(yàn),確定最優(yōu)的提取條件,液質(zhì)聯(lián)用分析確定提取液中主要成分,為研究開發(fā)可調(diào)節(jié)尿酸水平的食品功能成分提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

新鮮藜蒿 采自江西省南昌市新建區(qū)南磯鄉(xiāng);次黃嘌呤(HPLC純度99%)、別嘌醇(HPLC純度98%)、甲醇(色譜級(jí))、甲酸(色譜級(jí)) 上海阿拉丁生化科技股份有限公司;黃嘌呤氧化酶(X1875-25UN) 美國Sigma公司;對(duì)照品綠原酸(3-CQA)、新綠原酸(5-CQA)、異綠原酸b(3,4-diCQA)、異綠原酸a(3,5-diCQA)、1,5-二咖啡?；鼘幩?1,5-diCQA)和異綠原酸c(4,5-diCQA) 純度≥98%,上海融禾醫(yī)藥科技發(fā)展有限公司;氫氧化鈉、鹽酸、焦磷酸鈉、無水乙醇 分析純,西隴化工股份有限公司。

DFY-500粉碎機(jī) 天津市泰斯特儀器有限公司;HJ-40磁力攪拌水浴鍋 金壇市良友儀器有限公司;FA1604分析電子天平、UV-7504紫外分光光度計(jì) 上海精密科學(xué)有限公司;SHZ-Ⅲ循環(huán)水真空泵、RE-2000A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠;安捷倫6430超高效液相色譜串聯(lián)四級(jí)桿飛行時(shí)間質(zhì)譜儀 上海安捷倫科技公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 藜蒿莖抑XOD活性成分的提取 將新鮮藜蒿葉、莖分離,洗凈,切段,取藜蒿莖在60 ℃烘箱干燥,粉碎,過60目篩,置于干燥器內(nèi)保存?zhèn)溆?。稱取藜蒿莖干粉末5 g于圓底燒瓶中,在一定的乙醇濃度、液料比、提取溫度、提取時(shí)間、提取次數(shù)下進(jìn)行乙醇回流提取,提取結(jié)束后,將提取液過濾,去除濾渣,得到的濾液轉(zhuǎn)移至旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中,50 ℃旋蒸濃縮至無醇味,最終用蒸餾水定容至100 mL。每個(gè)實(shí)驗(yàn)做三組平行樣。

1.2.2 單因素條件的確定

1.2.2.1 乙醇濃度 取乙醇濃度分別為0%、20%、40%、60%、80%,液料比10∶1 mL/g,在80 ℃水浴提取2 h,提取1次。將提取液檢測(cè)抑制XOD活性,確定效果最好水平。

1.2.2.2 液料比 乙醇濃度參照1.2.2.1,取液料比10∶1、20∶1、30∶1、40∶1 mL/g,在80 ℃水浴提取2 h,提取1次。將提取液檢測(cè)抑制XOD活性,確定效果最好水平。

1.2.2.3 提取溫度 乙醇濃度參照1.2.2.1,液料比參照1.2.2.2,取水浴溫度分別為40、60、80、100 ℃,提取2 h,提取1次。將提取液檢測(cè)抑制XOD活性,確定效果最好水平。

1.2.2.4 提取時(shí)間 乙醇濃度參照1.2.2.1,液料比參照1.2.2.2,水浴溫度參照1.2.2.3,取提取時(shí)間1、2、3、4 h,提取1次。將提取液檢測(cè)抑制XOD活性,確定效果最好水平。

1.2.2.5 提取次數(shù) 乙醇濃度參照1.2.2.1,液料比參照1.2.2.2,水浴溫度參照1.2.2.3,提取時(shí)間參照1.2.2.4,取提取次數(shù)1次、2次、3次。將提取液檢測(cè)抑制XOD活性,確定效果最好水平。

1.2.3 響應(yīng)曲面優(yōu)化 根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果,采用Box-Behnken中心試驗(yàn)優(yōu)化設(shè)計(jì),選擇乙醇濃度、液料比以及提取溫度為三個(gè)考察因子。響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素及水平表,見表1。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)三因素三水平表Table 1 Response surface test design of three factors and three levels

1.2.4 抑制XOD活性的測(cè)定 參照文獻(xiàn)[16],按實(shí)驗(yàn)情況改動(dòng),在有氧條件下使用紫外分光光度法測(cè)量XOD活性,反應(yīng)混合物由200 mmol/L焦磷酸鈉緩沖液(pH=7.5)400 μL、0.6 mmol/L次黃嘌呤200 μL、樣品20 μL、蒸餾水180 μL和0.1 U/mL黃嘌呤氧化酶(XOD)200 μL組成。將反應(yīng)體系混合除次黃嘌呤外在37 ℃下水浴0.5 h,最后用次黃嘌呤啟動(dòng)反應(yīng)。隨后在波長295 nm處測(cè)量一定的時(shí)間內(nèi)尿酸的生成(吸光度變化)速率。計(jì)算公式為:

抑制率R(%)=(1-b/a)×100

其中,a:無樣品吸光度隨時(shí)間的變化率;b:樣品存在下吸光度隨時(shí)間的變化率。

1.2.5 藜蒿莖提取液的主要成分分析 稱取藜蒿莖干粉末5 g于圓底燒瓶中,按響應(yīng)曲面優(yōu)化的最佳提取條件,加170 mL 53%的乙醇溶液,79 ℃乙醇回流提取1 h,提取次數(shù)為2次。提取結(jié)束后,將提取液過濾,去除濾渣,得到的濾液轉(zhuǎn)移至旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中,50 ℃旋蒸濃縮至無醇味,最終用蒸餾水定容至100 mL。移取2 mL,過0.22 μm濾膜后,置于進(jìn)樣瓶中。

色譜條件:UPLC色譜柱:Shim-pack GIST C18(2.1×75 mm,2 μm),流動(dòng)相A為0.1%甲酸水溶液,B為乙腈;洗脫梯度:0～15 min,10%～25% B;15～25 min,25%～35% B;25～30 min,35%～40% B;30～35 min,40% B;35～36 min,40%～10% B;36～40 min,10% B,進(jìn)樣量為5 μL,柱溫為室溫,流速0.3 mL/min。

質(zhì)譜條件:Hybrid Quadrupole-TOF LC/MS/MS Mass Spectrometer:TripleTOF 5600+(AB Sciex);ESI源;負(fù)離子檢測(cè)模式;CUR:35.000 psi;GS1:50.000 psi;GS2:50.000 psi;ISVF:-4500.000 V;TEM:550.000 ℃;一級(jí)(Start Mass:100.0;End Mass:1000.0;CE:-10.000 V;DP:-80.000 V);二級(jí)(IDA模式,Start Mass:50.0;End Mass:1000.0;CE:-30±15.000 V;DP:-80.000 V)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有數(shù)據(jù)為3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)的平均值,結(jié)果表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用Origin2017作圖,響應(yīng)面用Design Expert 8.0軟件設(shè)計(jì)。

2 結(jié)果與分析

2.1 藜蒿莖抑XOD活性成分提取單因素條件的確定

2.1.1 乙醇濃度的確定 由圖1可知,隨著乙醇濃度的增加,藜蒿莖提取液的XOD抑制率增加,且XOD抑制率在乙醇濃度60%時(shí)達(dá)到最大,之后再提高乙醇濃度,XOD抑制率有所下降。這可能是由于活性成分的溶解特性因溶劑極性不同而有所差異,隨著乙醇濃度增加,活性成分與乙醇溶劑的極性越來越接近,提取液中溶出的活性成分含量增加,但乙醇濃度超過60%后,極性差異變大,影響活性成分的提取效果[17],XOD抑制率因此受到影響而下降。確定60%為最佳的乙醇濃度。

圖1 乙醇濃度對(duì)XOD抑制率的影響Fig.1 Effect of ethanol concentration on XOD inhibition rate注:不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，圖2～圖5同。

2.1.2 液料比的確定 由圖2可知,隨著提取試劑乙醇比例的增多,藜蒿莖提取液的XOD抑制率增加,主要是因?yàn)樘崛∪軇┯昧吭蕉?增加了料與液的接觸面積,提高溶質(zhì)擴(kuò)散速率,從而使XOD抑制成分提取得率增加。當(dāng)液料比達(dá)到40∶1 (mL/g)時(shí),XOD抑制率達(dá)到最大,但由圖2可以看出,當(dāng)液料比在30∶1～40∶1之間時(shí),XOD抑制率差異不顯著,綜合考慮經(jīng)濟(jì)適用性,確定30∶1為最佳液料比。

圖2 液料比對(duì)XOD抑制率的影響Fig.2 Effect of liquid-solid ratio on XOD inhibition rate

2.1.3 提取溫度的確定 由圖3可知,隨著提取溫度的升高,藜蒿莖提取液的XOD抑制率增加,且XOD抑制率在提取溫度為80 ℃時(shí)達(dá)到最大,之后再提高提取溫度,XOD抑制率有所下降，但并不顯著。原因可能是溫度升高,增加了細(xì)胞膜的流動(dòng)性,同時(shí)原料中的化合物擴(kuò)散速率也加快,更多的活性物質(zhì)被提取出來,從而增加了XOD抑制率[18]。但溫度過高,部分化合物的穩(wěn)定性也會(huì)受影響,所以確定80 ℃為最佳提取溫度。

圖3 提取溫度對(duì)XOD抑制率的影響Fig.3 Effect of extraction temperature on XOD inhibition rate

2.1.4 提取時(shí)間的確定 由圖4可知,提取時(shí)間對(duì)藜蒿莖提取液的XOD抑制率影響無顯著差異,1 h到4 h提取液的酶抑制率幾乎相同。原料與提取溶劑接觸時(shí)間足夠充分,原料組分不斷從原料中擴(kuò)散出來,但是當(dāng)大部分的原料組分都通過擴(kuò)散溶解到提取溶劑中后,繼續(xù)延長提取時(shí)間,XOD抑制率無明顯變化。故后續(xù)實(shí)驗(yàn)的提取時(shí)間選定為1 h。

圖4 提取時(shí)間對(duì)XOD抑制率的影響Fig.4 Effect of extraction time on enzyme XOD rate

2.1.5 提取次數(shù)的確定 由圖5可知,隨著提取次數(shù)的增加,藜蒿莖提取液的XOD抑制率增加,且XOD抑制率在提取次數(shù)為2次時(shí)達(dá)到最大,之后再增加提取次數(shù),XOD抑制率無顯著差異。提取次數(shù)的增加,使得第一次提取時(shí)未溶出活性物質(zhì)能被提取出來,所以增大了XOD抑制率。但2次提取和3次提取的提取液XOD抑制率幾乎不變,原因可能是2次提取可使活性物質(zhì)基本全部溶出,第3次提取時(shí)幾乎沒有新溶出的活性物質(zhì)。故后續(xù)實(shí)驗(yàn)的提取次數(shù)選定為2次。

表3 回歸模型系數(shù)顯著性檢驗(yàn)及方差分析Table 3 Significance testing and variance analysis of model regression coefficients

注:*顯著(P<0.05),**極顯著(P<0.01)。

圖5 提取次數(shù)對(duì)XOD抑制率的影響Fig.5 Effect of extraction times on XOD inhibition rate

2.2 響應(yīng)曲面優(yōu)化提取條件

在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上,以A乙醇濃度、B液料比和C提取溫度3個(gè)因素為影響因素,以XOD抑制率為響應(yīng)值設(shè)計(jì)3因素3水平試驗(yàn)。響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果,見表2。由表2可得以XOD抑制率為響應(yīng)值的回歸方程:R=+58.66+0.4A+1.99B-0.36C+0.67AB+0.23AC+0.50BC-2.51A2-1.33B2-2.08C2。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 The experimental results of response surface design

由表3可知,模型的Prob>F為0.0132(P<0.05),表明該模型具有顯著性。此外,模型的失擬項(xiàng)值為0.7177(P>0.05),不顯著,說明模型選擇較合適,實(shí)驗(yàn)的相對(duì)誤差較小,可以用此模型對(duì)XOD抑制率進(jìn)行分析和預(yù)測(cè)。一次項(xiàng)中B項(xiàng)極顯著(P<0.01),二次項(xiàng)中A2極顯著(P<0.01),C2顯著(P<0.05),兩兩因素之間交互作用不顯著。各因素對(duì)XOD抑制率的影響大小依次為液料比>乙醇濃度>提取溫度。

圖6為各因素交互作用的響應(yīng)面及等高線圖。響應(yīng)曲面圖以及等高線圖都可以反應(yīng)兩個(gè)因素間相互作用的強(qiáng)弱。在響應(yīng)面分析圖中,響應(yīng)曲面的陡峭程度越大,說明相應(yīng)的交互作用對(duì)XOD抑制率的影響越顯著,響應(yīng)曲面的陡峭程度越平緩,相應(yīng)的交互作用越弱。同樣,等高線越密集表示兩個(gè)因素交互作用越強(qiáng),等高線稀疏則相反。由響應(yīng)面和等高線可知,乙醇濃度與液料比、乙醇濃度與提取溫度以及液料比與提取溫度的交互作用均不顯著,這與表3中交互項(xiàng)AB、AC、BC的P值的分析結(jié)果保持一致。

圖6 各因素交互作用的響應(yīng)面及等高線圖Fig.6 Response surface and contour plots showing the effect of various reaction conditions

根據(jù)響應(yīng)面分析建立的數(shù)學(xué)模型,得到最佳提取條件為乙醇濃度為53.98%,提取溫度為79.51 ℃,液料比為35.85∶1 (mL/g),在此條件下酶抑制率預(yù)測(cè)值為57.988%。根據(jù)驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果,當(dāng)乙醇濃度為53%,提取溫度為79 ℃,液料比為34∶1 (mL/g)時(shí),平均酶抑制率達(dá)到56.4%±1.8%,實(shí)際測(cè)量值與預(yù)測(cè)值的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD為1.4%,說明所建模型與實(shí)際情況擬合很好。

表4 藜蒿莖提取液組分保留時(shí)間和質(zhì)譜數(shù)據(jù)Table 4 Retention time and mass spectral data of extract of Artemisia selengensis Turcz stems

2.3 藜蒿莖提取液組分液質(zhì)定性分析

如圖7、圖8所示,根據(jù)藜蒿莖提取液組分各峰的一級(jí)質(zhì)譜圖可以看出,1、2號(hào)峰[M-H]-為m/z 353,3、4、5、6號(hào)峰[M-H]-為m/z 515,再結(jié)合相對(duì)應(yīng)的二級(jí)質(zhì)譜圖中的碎片離子峰,可以初步推斷出1、2號(hào)峰為單咖啡?；鼘幩?3、4、5、6號(hào)峰為二咖啡酰基奎寧酸。根據(jù)保留時(shí)間1號(hào)峰5.29 min,2號(hào)峰10.38 min,3號(hào)峰為25.03 min,4號(hào)峰為26.17 min,5號(hào)峰為27.06 min,6號(hào)峰為29.78 min,對(duì)比混合對(duì)照品的總離子流圖和質(zhì)譜圖,確認(rèn)1、2、3、4、5、6號(hào)峰分別為新綠原酸、綠原酸、異綠原酸b、異綠原酸a、1,5-二咖啡?；鼘幩?、異綠原酸c,具體參數(shù)列于表4。Li等[19]從藜蒿葉中提取得到含有綠原酸、隱綠原酸、異綠原酸b、異綠原酸a、異綠原酸c、萊薊素的提取物,并且這六種綠原酸類物質(zhì)在體外都有一定的抑制黃嘌呤氧化酶的效果。Zhang等[20]在微波提取的藜蒿液中發(fā)現(xiàn)了三種單咖啡?；鼘幩崤c四種二咖啡?；鼘幩?分別為1-咖啡?；鼘幩?新綠原酸、綠原酸、異綠原酸b、異綠原酸a、1,5-二咖啡酰基奎寧酸、異綠原酸c,其中綠原酸的含量最高,其次為1,5-二咖啡?；鼘幩崤c異綠原酸a。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果與Li及Zhang等的結(jié)果相似,但未檢出萊薊素與1-咖啡?；鼘幩?原因可能是所使用的原料來源不同,成分的種類和含量略有差異。

圖7 綠原酸混合對(duì)照品的總離子流圖Fig.7 Total ion chromatogram of chlorogenic acid mixed controls注:A:新綠原酸;B:綠原酸;C:異綠原酸b;D:異綠原酸a; E:1,5-二咖啡酰基奎寧酸;F:異綠原酸c。

圖8 藜蒿莖提取液的總離子流圖Fig.8 Total ion currents of extract of Artemisia selengensis Turcz stems

3 結(jié)論

本文在單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上,采用響應(yīng)曲面法優(yōu)化藜蒿莖中抑制XOD活性成分的提取條件。最佳提取條件為:乙醇濃度為53%,提取溫度為79 ℃,液料比為34∶1 (mL/g)。在此條件下進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn),得到的提取液對(duì)XOD抑制率為56.4%,與預(yù)測(cè)值57.988%非常接近,實(shí)際測(cè)量值與預(yù)測(cè)值的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD為1.4%。利用液質(zhì)聯(lián)用定性分析發(fā)現(xiàn)藜蒿莖提取液主要含有新綠原酸、綠原酸、異綠原酸b、異綠原酸a、1,5-二咖啡?；鼘幩岷彤惥G原酸c。對(duì)于藜蒿莖抑XOD的有效成分定量與純化分離有待進(jìn)一步的研究。