基于16S rDNA高通量測(cè)序技術(shù)分析北京豆汁兒微生物多樣性和功能預(yù)測(cè)的研究

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(1.北京農(nóng)業(yè)職業(yè)學(xué)院,北京 102400; 2.廣東輕工職業(yè)技術(shù)學(xué)院,廣東高校特色調(diào)味品工程技術(shù)開發(fā)中心(GCZXB1103),廣州 510300)

豆汁兒是由綠豆自然發(fā)酵而來的北京特有傳統(tǒng)食品,具有降燥解毒、促進(jìn)脾胃功能、消暑降溫的功效[1-6]。豆汁兒聞之有酸臭味(與泔水味相似),入口以酸味為主伴有回甘,其獨(dú)特的風(fēng)味是由微生物發(fā)酵產(chǎn)生的。目前,豆汁兒中微生物的相關(guān)報(bào)道較少,有文獻(xiàn)表明豆汁兒中存在乳酸乳球菌乳酸亞種[7]。通過宏基因組學(xué)對(duì)微生物的種屬組成、豐度及其優(yōu)勢(shì)菌進(jìn)行研究分析是目前微生物學(xué)研究的熱點(diǎn)[8-10],被廣泛運(yùn)用于食品微生物研究領(lǐng)域[11-14]。通過微觀層面的科學(xué)研究,人們對(duì)微生物菌落有了全面的認(rèn)識(shí)[15-18]。以環(huán)境樣品中總微生物基因組為研究對(duì)象,通過測(cè)序分析和功能基因篩選等對(duì)樣本中的微生物進(jìn)行較全面的分析,如:菌落多樣性分析、樣本與物種關(guān)系分析等[19-22]。其中,16S rDNA測(cè)序分析技術(shù)最為常用,在不對(duì)微生物進(jìn)行純化培養(yǎng)的情況下,直接從食品生態(tài)系統(tǒng)中獲取基因信息對(duì)其進(jìn)行測(cè)序分析[23-26]。

本文通過16S rDNA測(cè)序?qū)Χ怪瓋褐兴⑸锏姆N屬類型、種類的相對(duì)豐度以及樣本與物種的關(guān)系等進(jìn)行分析,從而了解豆汁兒中菌落組成及其優(yōu)勢(shì)菌種,以期為豆汁兒的科學(xué)安全生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

豆汁兒 來自北京不同城區(qū)具有代表性的6家豆汁兒店,編號(hào)分別為A、B、C、D、E、F。

HR/T16M臺(tái)式高速冷凍離心機(jī) 湖南赫西儀器裝備有限公司;YXQ-LS-50SII壓力蒸汽滅菌器 上海篤特科學(xué)儀器有限公司;JA2003 電子天平 上海精密科學(xué)儀器有限公司;高通量測(cè)序儀 Illumina(Miseq);中科美菱DW-HL290超低溫儲(chǔ)存箱 上海旦鼎國(guó)際貿(mào)易有限公司。

表1 Alpha多樣性分析Table 1 Alpha diversity analysis

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 微生物16S rDNA測(cè)序的樣品前處理方法 分別取6種豆汁兒,立即用12000 r/min轉(zhuǎn)速的高速冷凍離心機(jī)4 ℃條件下離心30 min,去除上清液后放入-80 ℃的超低溫儲(chǔ)存箱保存,同一家店分三批次取樣混合均勻。

1.2.2 16S rDNA PCR擴(kuò)增 選擇799F和1193R作為引物,引物序列分別為AACMGGATTA GATACCCKG和ACGTCATCCCCACCTTCC。為了保證后續(xù)數(shù)據(jù)分析的準(zhǔn)確性及可靠性,在可行范圍內(nèi)使用低循環(huán)數(shù)擴(kuò)增并保證每個(gè)樣品擴(kuò)增的循環(huán)數(shù)統(tǒng)一。擴(kuò)增體系為:TransStart Fastpfu DNA Polymerase,20 μL反應(yīng)體系,其中包括:4 μL的5×FastPfu Buffer,42 μL的2.5 mmol dNTPs,0.8 μL的Forward Primer(5 μmol/L),0.8 μL的Reverse Primer(5 μmol/L),0.4 μL的FastPfu Polymerase,0.2 μL的BSA,10 ng的Template DNA,補(bǔ)ddH2O至20 μL。PCR反應(yīng)參數(shù):a. 95 ℃預(yù)變性3 min;b. 循環(huán)數(shù)×(95 ℃變性30 s;55 ℃退火30 s;72 ℃延伸45 s);c. 72 ℃延伸10 min,至10 ℃停止。

二輪擴(kuò)增:一輪引物 799F,退火55 ℃,27個(gè)循環(huán);二輪引物 799F-1193R,退火55 ℃,13個(gè)循環(huán)。測(cè)序工作由北京美吉桑格生物醫(yī)藥科技有限責(zé)任公司完成。

1.2.3 16S rDNA功能預(yù)測(cè)分析 16S rDNA功能預(yù)測(cè)是通過PICRUSt軟件(PICRUSt軟件[27]存儲(chǔ)了Greengene ID對(duì)應(yīng)的Clusters of Orthologous Groups of Proteins(COG)信息和KEGG Ortholog(KO)信息)對(duì)OTU豐度表進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化,即去除16S marker gene在物種基因組中的copy數(shù)目的影響;再通過每個(gè)OTU對(duì)應(yīng)的Greengene ID,比對(duì)到COG和KEGG庫,獲得OTU對(duì)應(yīng)的COG家族信息和KO信息;并計(jì)算各COG的豐度和KO豐度。根據(jù)COG數(shù)據(jù)庫的信息,可以從EggNOG(evolutionary genealogy of genes:Non-supervised Orthologous Groups,http://eggnog.embl. de/)數(shù)據(jù)庫中解析到各個(gè)COG的描述信息,以及其功能信息,從而得到功能豐度譜;根據(jù)KEGG數(shù)據(jù)庫(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,京都基因和基因組百科全書,http://www.genome.jp/kegg/)的信息,可以獲得KO、Pathway、EC信息,并能根據(jù)OTU豐度計(jì)算各功能類別的豐度。針對(duì)Pathway,運(yùn)用PICRUSt軟件可獲得代謝通路的3個(gè)水平信息及各個(gè)水平的豐度表。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Circos-0.67-7、PICRUSt軟件、R語言工具統(tǒng)計(jì)和作圖,Excel進(jìn)行數(shù)據(jù)處理分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣本OTU及Alpha多樣性分析

除去低于置信閾值的分類譜系外,6個(gè)豆汁兒樣品總共獲得有效序列204144條。按照97%相似水平對(duì)OTU進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,6個(gè)豆汁兒樣品中,OTU50數(shù)量最多,共有53613個(gè),其對(duì)應(yīng)的菌種是食竇魏斯氏菌(Weissellacibaria);OTU35次之,共有50080個(gè),其對(duì)應(yīng)的菌種是沙克乳酸桿菌(Lactobacillussakei)。豆汁兒樣本中包含的物種分類個(gè)數(shù)統(tǒng)計(jì)結(jié)果為:域1個(gè);界1個(gè);門5個(gè);綱8個(gè);目13個(gè);科21個(gè);屬35個(gè);種51個(gè);OTU 70個(gè)。

各樣本OTU數(shù)目、Ace豐富度指數(shù)、Chao1豐富度指數(shù)、測(cè)序深度指數(shù)、Shannon指數(shù)及Simpson指數(shù)見表1。由表1可知,樣品E的Ace豐富度指數(shù)為76.02;Chao1豐富度指數(shù)為88.25,是所有樣品中菌群豐度最高的。由Shannon指數(shù)可知,樣品B多樣性最高,Shannon指數(shù)最大為1.96。6個(gè)豆汁兒樣品的Simpson指數(shù)值在0.21～0.27區(qū)間內(nèi),說明菌落多樣性相似度較高。

2.2 物種組成分析

2.2.1 物種Venn圖分析 圖1為6個(gè)豆汁兒樣品在種分類水平上的物種Venn圖。如圖1所示,6個(gè)樣品共有物種數(shù)目22種;樣品E和樣品F共有物種數(shù)目最多,有42種。由此得出樣品E與樣品F物種相似度高。共有物種數(shù)目在35種以上的群組有:E&F、D&E、B&E、D&E&F、D&F。

圖1 OTU交集韋恩圖Fig.1 Intersected Venn diagram analysis of OTU

6個(gè)豆汁兒樣品合并后微生物物種分布如圖2所示。食竇魏斯氏菌(Weissellacibaria)占比最多為25.73%;次之為沙克乳酸桿菌(Lactobacillussakei),占比為24.63%。與樣本OTU統(tǒng)計(jì)分析分析結(jié)果相吻合。

圖4 菌落熱圖Fig.4 Community heatmap

圖2 物種分布餅圖Fig.2 Species distribution pie map

2.2.2 菌落組成分析 基于目分類水平柱形圖3結(jié)果表明:不同樣本在目水平優(yōu)勢(shì)物種相同,乳桿菌目(Lactobacillales)占比最大,6個(gè)樣本中乳桿菌目都在95.8%以上,其他菌目占0.2%以下;B樣品中有3.7%的雙歧桿菌目(Bifidobacteriales)。由此看出,豆汁兒的發(fā)酵是以乳桿菌目為主的,不同來源的豆汁兒,其所含微生物相似度極高。

圖3 基于目分類水平的菌落柱形圖Fig.3 Community barplot analysis based on category level

2.2.3 群落Heatmap圖 樣品A～F這6個(gè)樣本的群落屬水平物種組成熱圖和樣本聚類樹分析如圖4所示,在屬分類水平上,根據(jù)豆汁兒樣本間物種相對(duì)豐度的相似性進(jìn)行聚類,對(duì)聚類后各樣品中不同菌屬所含序列的豐度作菌落熱圖,可使高豐度和低豐度的物種分塊聚集,反映出在屬分類水平上所有豆汁兒樣品菌落結(jié)構(gòu)的相似性和差異性。

熱圖共展示35個(gè)屬,不同豆汁兒樣本中TOP5門類組成存在差異。其中樣品A、樣品B、樣品D、樣品E、樣品F占比最大的為乳桿菌屬(Lactobacillus),是豆汁兒中的優(yōu)勢(shì)菌屬;而樣品C占比最大的是魏斯氏屬(Weissella)。且樣品A～F 6種樣品中優(yōu)勢(shì)菌種的組成相似,菌種類別統(tǒng)一度高,均含有乳桿菌屬(Lactobacillus)、乳球菌(Lactococcus)和魏斯氏屬(Weissella);6種樣品菌屬的豐度指數(shù)存在差異,表明菌屬的占比量不同。

2.2.4 樣本與物種關(guān)系分析 在種分類水平上的Circos圖分析結(jié)果如圖5。A～F 6種樣品中優(yōu)勢(shì)菌種的組成相似,但占比不同,其中B、D和E的優(yōu)勢(shì)菌種均為沙克乳酸桿菌(Lactobacillussakei),該菌種在樣本中的占比分別為37%、32%和31%;樣品C和F的優(yōu)勢(shì)菌種是食竇魏斯氏菌(Weissellacibaria),在樣本中的占比分別是:44%和35%;樣品A的優(yōu)勢(shì)菌種是一種未分類的乳桿菌,該菌種在樣本的占比為37%。有研究表明:沙克乳酸桿菌能夠抑制食物腐敗菌和食源性病原體[28],本研究中,樣品B、D、E中存在該菌種,因此推測(cè)對(duì)豆汁兒中的腐敗菌具有抑制作用。

圖5 Circos樣本與物種關(guān)系圖Fig.5 Circos sample and species diagram

樣品A、D和E這3個(gè)樣品中,均存在食竇魏斯氏菌(Weissellacibaria),分別占比均為22%、26%、28%,食竇魏斯氏菌不產(chǎn)生物胺類物質(zhì),耐低酸、膽鹽,可促進(jìn)發(fā)酵食品的風(fēng)味形成[29-30]。

2.3 功能預(yù)測(cè)分析

16S功能預(yù)測(cè)是通過PICRUSt軟件對(duì)OTU豐度表進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化后,通過每個(gè)OTU 對(duì)應(yīng)的Greengene Id獲得OTU對(duì)應(yīng)的COG家族信息和KEGG Ortholog(KO)信息,并計(jì)算豐度。由于乳桿菌目(Lactobacillales)占比95.8%以上,是豆汁兒發(fā)酵過程中的優(yōu)勢(shì)菌目,因此以乳桿菌目(Lactobacillales)對(duì)應(yīng)的OTU數(shù)據(jù)(篩選后的OTU命名a～f),進(jìn)行功能預(yù)測(cè)分析。

2.3.1 COG數(shù)據(jù)庫注釋分析 COG是由NCBI創(chuàng)建并維護(hù)的蛋白數(shù)據(jù)庫[31]。圖6是COG功能分類統(tǒng)計(jì)圖。由圖6可知,樣本a～f的COG功能組成相似度高,功能注釋結(jié)果分為25 類。功能性強(qiáng)的前五類分別是:G:碳水化合物轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝,均值963750個(gè);R:一般功能預(yù)測(cè),均值為794154個(gè);E:氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)與代謝,均值743039個(gè);K:轉(zhuǎn)錄,均值726421個(gè);J:翻譯,均值669363個(gè);此外發(fā)現(xiàn)均值1005492個(gè)功能未知的基因,有待今后進(jìn)一步研究。

圖6 COG功能分類統(tǒng)計(jì)圖Fig.6 COG functional classification statistical map

注:A. RNA加工與修飾;B.染色質(zhì)結(jié)構(gòu)與動(dòng)力學(xué);C.能量產(chǎn)生與轉(zhuǎn)化;D.細(xì)胞周期調(diào)控、細(xì)胞分裂,染色體分隔;E.氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)與代謝;F.核苷酸轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝;G.碳水化合物轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝;H.輔酶轉(zhuǎn)運(yùn)與代謝;I.脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)與代謝;J.翻譯,核糖體結(jié)構(gòu)和生物合成;K.轉(zhuǎn)錄;L.復(fù)制,重組和修復(fù);M.細(xì)胞壁/細(xì)胞膜的生成;N.細(xì)胞運(yùn)動(dòng);O.翻譯后修飾,蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)換,伴侶;P.無機(jī)離子轉(zhuǎn)運(yùn)與代謝;Q.次級(jí)代謝產(chǎn)物的合成、轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝;R.一般功能預(yù)測(cè);S.未知功能;T.信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制;U.細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)運(yùn)、分泌和囊泡運(yùn)輸;V.防御機(jī)制;W.胞外結(jié)構(gòu);Y.核結(jié)構(gòu);Z.細(xì)胞骨架。

2.3.2 KEGG數(shù)據(jù)庫注釋分析 KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)即京都基因和基因組百科全書,始于1955年,將基因、基因組信息以及更高層次的功能信息結(jié)合起來,對(duì)基因的功能進(jìn)行系統(tǒng)化分析[32]。表2是KEGG代謝通路Level 2豐度分析結(jié)果。Level 2豐度分析共有41種代謝通路,表2展示a～f代謝通路豐度值前15的結(jié)果。主要代謝通路有膜運(yùn)輸、碳水化合物代謝、復(fù)制和修復(fù)、氨基酸代謝、翻譯、特征差和核苷酸代謝等。

其中,a～f碳水化合物代謝路徑豐度值占比分別為:14.97%、15.29%、14%、15.33%、15.19%、14.79%。有關(guān)研究表明:能夠代謝碳水化合物及酶活性種類最多的菌種是鼠李糖乳桿菌和副干酪乳桿菌,而植物乳桿菌碳水化合物利用能力和酶活性卻相對(duì)較少;乳酸桿菌對(duì)碳水化合物的代謝特征也可為特異性益生元的選擇提供參考[33]。a～f氨基酸代謝豐度值占比分別為:9.14%、8.74%、9.94%、8.68%、8.77%、9.09%。氨基酸經(jīng)過不同的代謝途徑,在轉(zhuǎn)氨酶、裂解酶和脫氫酶等的作用下產(chǎn)生各種揮發(fā)性香氣成分[34]。

通過KEGG數(shù)據(jù)庫分析,a～f中共有780余種酶,表3是豐度均值前50的酶類。由表3看出乙醛脫氫酶/乙醇脫氫酶、醇脫氫酶等豐度均值較高,由此推測(cè)豆汁兒中的風(fēng)味物質(zhì)主要來源于氨基酸代謝。乳酸桿菌α-半乳糖苷酶和β-半乳糖苷酶的轉(zhuǎn)糖基作用可用于生產(chǎn)益生元α-低聚半乳糖和β-低聚半乳糖[33]。β-半乳糖苷酶屬于糖苷水解酶,不僅能將乳糖水解為半乳糖和葡萄糖,而且能催化轉(zhuǎn)糖苷反應(yīng)合成半乳糖寡糖(Galactooligosaccharide,GOS),GOS是一種雙歧因子,能促進(jìn)腸道內(nèi)雙歧桿菌增殖,對(duì)人類的健康有許多益處[35]。由表3可知,a～f中β-半乳糖苷酶豐度均值較高,由此推測(cè)在豆汁兒發(fā)酵過程中,乳桿菌目(Lactobacillales)的酶活性特征可促使β-低聚半乳糖及GOS的產(chǎn)生,益于腸道菌群健康。

表2 KEGG數(shù)據(jù)庫主要代謝通路豐度值Table 2 Abundance of main metabolic pathways in KEGG database

表3 KEGG數(shù)據(jù)庫主要酶豐度值Table 3 Abundance of main enzyme in KEGG database

3 結(jié)論

通過微生物多樣性檢測(cè)分析,微生物16S rDNA測(cè)序可以初步斷定:豆汁兒中乳桿菌目(Lactobacillales)占比95.8%以上,是優(yōu)勢(shì)菌目;進(jìn)一步分析(圖4所示)表明,乳桿菌屬(Lactobacillus)是豆汁兒中的優(yōu)勢(shì)菌屬;食竇魏斯氏菌(Weissellacibaria)和沙克乳酸桿菌(Lactobacillussakei)是優(yōu)勢(shì)菌種(表1和圖5所示)。通過豆汁兒中乳桿菌目(Lactobacillales)的功能預(yù)測(cè)分析結(jié)果推測(cè):豆汁兒中的風(fēng)味物質(zhì)來源于氨基酸代謝，發(fā)酵過程中產(chǎn)生β-低聚半乳糖及GOS,有益于腸道菌群健康。