堿提桑黃菌絲體多糖的抗氧化活性

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(1.黃河水利職業(yè)技術(shù)學院環(huán)境工程學院,河南開封 475000;2.江蘇大學食品與生物工程學院,江蘇鎮(zhèn)江 212013)

桑黃菌(Phellinuslinteus)屬擔子菌亞門(Basidiomycotina)、多孔菌科、木層孔菌屬(Phellinus),是一種珍稀的藥用真菌,有“森林黃金”之美稱[1]?，F(xiàn)代藥理學研究證明,桑黃菌具有免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、抗炎、抗過敏、抗血管生成和抗氧化等多種生理活性[1]。其中,多糖是其主要生物活性成分之一[2-4]。由于受自身生物特性和外界環(huán)境的影響,野生桑黃菌子實體稀少,人工栽培周期長,無法滿足人們對珍稀桑黃菌資源的廣泛需求,對桑黃菌進行人工發(fā)酵培養(yǎng)以獲取桑黃菌絲體為其產(chǎn)業(yè)化開發(fā)提供了可能,且發(fā)酵周期短,不受季節(jié)和環(huán)境的限制,發(fā)酵所得菌絲體多糖與子實體多糖功效相當[1]。

目前,國內(nèi)外研究桑黃多糖還主要以水提物或水提多糖為研究對象探究其抗氧化活性,對于涉及其他提取介質(zhì)如酸、堿制備的多糖及其生物活性的研究也多以體外活性評價為主,限制了桑黃活性多糖的深度開發(fā)及應(yīng)用[5-7]。如Kozarski等[6]通過熱水提取和乙醇沉淀得到桑黃粗多糖,多糖含量為62.6%,在0.1～10 mg/mL濃度范圍內(nèi),桑黃粗多糖的DPPH自由清除率為77.9%～86.9%。同樣地,Luo等[7]通過熱水提取和乙醇沉淀得到P.baumiiPilát菌絲體多糖(PBMP),多糖含量為61.82%,灌胃400 mg/kg BW的PBMP能夠提高D-半乳糖誘導(dǎo)衰老小鼠血清中抗氧化酶活性和總抗氧化能力。由此可見,以往的研究大多采用水提醇沉的方法來制備桑黃多糖。

研究揭示[8-9],不同溶劑(如熱水、酸、堿)提取對多糖的得率、理化性質(zhì)、結(jié)構(gòu)特征、生物活性及功能特性均有著重要影響。其中堿性溶液在提取過程中能夠更好地破壞細胞壁中纖維素和半纖維素之間的氫鍵,這樣使不溶性多糖從細胞壁當中釋放出來,轉(zhuǎn)化為可溶性多糖[10],能夠使多糖的提取率明顯提升,已被科技工作者廣泛應(yīng)用。張俐娜等經(jīng)過多年研究建立了一種以1.25 mol/L NaOH/0.05% NaBH4堿性溶液提取香菇子實體多糖的新方法,并證實該方法具有高質(zhì)、高效、低成本的優(yōu)點,且提取的香菇多糖具有三螺旋結(jié)構(gòu)[11]。因此,在前期研究基礎(chǔ)上,為了進一步明確1.25 mol/L NaOH/0.05% NaBH4所制備多糖的功能活性,本文以液體發(fā)酵桑黃菌絲體為原料,采用1.25 mol/L NaOH/0.05% NaBH4為溶劑進行桑黃菌絲體多糖(PL-N)的提取與制備,分析PL-N的化學組成及基本理化性質(zhì),研究其體外清除自由基能力和對過氧化氫損傷神經(jīng)細胞的保護作用;在此基礎(chǔ)上,建立D-半乳糖誘導(dǎo)的小鼠衰老模型,評價PL-N的體內(nèi)抗氧化活性,為充分利用桑黃資源、開發(fā)桑黃活性多糖類功能性食品或醫(yī)藥保健品提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

桑黃菌絲體 江西康道生物科技有限公司;液體發(fā)酵所用桑黃(P.linteus)菌株(菌株編號:KCTC 6190) 韓國模式培養(yǎng)物保藏所;雌性ICR種小白鼠60只(SPF級、6～8周齡、體重(20±2) g 江蘇大學試驗動物中心,動物許可證號:UJS-LAER-2017032201;1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)、過氧化氫(H2O2)、胎牛血清(FBS) 美國Sigma公司;超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽-過氧化物酶(GSH-Px)、過氧化氫酶(CAT)、丙二醛(MDA)及總抗氧化能力(TAOC)等試劑盒 南京建成生物工程研究所;抗壞血酸(VC)、D-半乳糖 國產(chǎn)分析純,國藥集團化學試劑有限公司。

SECURA124-1CN分析天平 賽多利斯科學儀器(北京)有限公司;HH-A恒溫水浴攪拌器 江蘇金壇市中大儀器廠;DL-5C離心機 上海安亭科學儀器廠;TGL-16高速臺式冷凍離心機 長沙湘儀離心機儀器有限公司;101-3型電熱恒溫干燥箱 金壇市醫(yī)療儀器廠;LRH-250生化培養(yǎng)箱 上海恒科技有限公司;UV-1601紫外/可見分光光度計 北京瑞利分析儀器公司;Synergy HT多功能酶標檢測儀 美國Bio-Tek公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 堿提桑黃菌絲體多糖的提取與制備 桑黃菌絲體粉末通過石油醚回流處理6 h,去除脂類及色素,自然干燥12 h,備用。預(yù)處理的桑黃菌絲體粉末(100 g)按體積比1∶10 (W/V)加入1.25 mol/L氫氧化鈉/0.05%硼氫化鈉溶液,常溫提取3 h,2次。提取結(jié)束后,提取液用36%的乙酸中和至pH7.0,離心(4000×g,20 min),棄去沉淀。上清液減壓濃縮,加入4倍體積95%乙醇沉淀,4 ℃靜置過夜,離心(4000×g,20 min),取沉淀溶于水,Sevag試劑法脫蛋白9次,蒸餾水透析(截留分子量:8～14 kDa)48 h,冷凍干燥,得到堿提桑黃菌絲體多糖,記為PL-N[11]。

1.2.2 多糖基本理化性質(zhì)測定 采用苯酚硫酸法測定總糖含量[12];采用硫酸咔唑法測定糖醛酸含量[12];采用考馬斯亮藍染色法測定蛋白質(zhì)含量[12];采用酸降解聯(lián)合氣相色譜進行單糖組成分析[12]。

1.2.3 清除DPPH自由基活性的測定 清除DPPH自由基試驗方法參考Konwarh等[13]的方法。不同質(zhì)量濃度(0.05、0.1、0.5、1.5、2.0 mg/mL)的樣品液3 mL分別加入1 mL 0.1 mmol/L DPPH乙醇溶液中,放置暗處室溫反應(yīng)30 min,于517 nm條件下測定其吸光值,VC作為陽性對照。按式(1)計算DPPH自由基清除率:

清除率(%)=[1-(A1-A2)/A0]×100

式(1)

式中,A0、A1、A2分別是空白對照(去離子水+DPPH溶液)、樣品和DPPH、樣品和乙醇溶液的吸光值。

1.2.4 清除羥自由基活性的測定 清除羥自由基試驗參考閆景坤、Delattre等[12,14]的方法。向0.2 mL不同濃度(0.05、0.1、0.5、1.5、2.0 mg/mL)的樣品中加入0.2 mL 5 mmol/L FeSO4,混勻后再加入0.2 mL 1%(v/v)H2O2,混勻后置室溫下反應(yīng)60 min。反應(yīng)完成后,再加入1 mL去離子水,于510 nm處測定其吸光值,VC作為陽性對照。按式(2)計算羥自由基清除率:

清除率(%)=[(A0-A)/A0]× 100

式(2)

式中,A0、A分別是去離子水代替樣品和樣品的吸光值。

1.2.5 細胞保護試驗 體外細胞保護試驗參考Li等[15]的方法。多糖樣品預(yù)先用0.1 mol/L PBS溶解成10 mg/mL的濃度,用0.1 mol/L PBS新鮮配制100 mmol/L過氧化氫,備用。SH-SY5Y神經(jīng)細胞用含10%胎牛血清(FBS)的RPMI 1640培養(yǎng)液在37 ℃含CO2的培養(yǎng)箱中進行常規(guī)培養(yǎng)。將細胞以5×104個/孔細胞懸液接種到96孔板中,加入不同濃度的多糖溶液(10～80 μg/mL)預(yù)孵育24 h。隨后,加入終濃度為80 μmol/L H2O2培養(yǎng)24 h,以正常細胞作為陽性對照,以未添加多糖氧化損傷的細胞作為陰性對照。細胞存活率通過MTT法測定,以百分比表示,如式(3)所示:

細胞存活率(%)=[(A1-A0)/(A2-A0)]× 100

式(3)

式中,A0、A1、A2分別是陰性對照、氧化損傷及多糖處理、陽性對照的吸光值。

1.2.6 動物飼養(yǎng)與試驗設(shè)計 健康雌性ICR小鼠飼養(yǎng)在環(huán)境溫度(23.0±0.5) ℃、相對濕度55%±5%、具有12 h白晝、12 h黑夜的晝夜循環(huán)周期的試驗動物房中,試驗期間小鼠自由攝食和飲水。適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d以后,將60只小鼠隨機分為6組,每組10只,分別設(shè)定為第 Ⅰ 組,正常對照組:每天腹腔注射生理鹽水(10 mL/kg BW)、灌胃生理鹽水(25 mL/kg BW);第Ⅱ組,模型對照組:每天腹腔注射D-半乳糖(100 mg/kg BW)、灌胃生理鹽水(25 mL/kg BW);第Ⅲ組,陽性對照組:每天腹腔注射D-半乳糖(100 mg/kg BW)、灌胃維生素C(VC,100 mg/kg BW);第Ⅳ組、第Ⅴ組和第Ⅵ組,分別為PL-N低劑量組、PL-N中劑量組和PL-N高劑量組:每天分別腹腔注射D-半乳糖(100 mg/kg BW)、灌胃PL-N低、中、高劑量(100、200、400 mg/kg BW),每三天禁食稱重一次,連續(xù)飼養(yǎng)40 d[16]。

1.2.7 試樣采集與制備 試驗小鼠末次給藥后禁食12 h,稱重并斷頭處死,收集血液于1500×g離心10 min制備小鼠血清;取肝臟和腎臟稱重用小剪刀將肝臟和腎臟樣品剪碎,在研缽中倒入適量的經(jīng)過冰浴的生理鹽水快速充分研磨,然后用生理鹽水配成10%的組織勻漿液,4000×g離心10 min,取勻漿上清液分別測定有關(guān)生化指標[16]。

1.2.8 臟器指數(shù)的測定 將取出的肝臟、脾臟和胸腺用生理水洗凈,擦干,稱重,按照下面公式計算小鼠的各個臟器指數(shù):

肝臟、脾臟和胸腺指數(shù)(mg/g BW)=臟器質(zhì)量/小鼠體重量

1.2.9 血清、肝臟勻漿中的抗氧化指標檢測 肝臟勻漿中蛋白質(zhì)含量以及血清和肝臟勻漿中的谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)活力、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、過氧化氫酶(CAT)含量以及總抗氧化能力(TAOC)等指標采用南京建成生物工程研究所研制的抗氧化試劑盒,按試劑盒說明書要求檢測。

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗中所有數(shù)據(jù)都是三次測定的平均值(Mean)±標準偏差(SD),方差分析(ANOVA)用來評價各參數(shù)的顯著性。

2 結(jié)果與討論

2.1 堿提桑黃菌絲體多糖的基本理化性質(zhì)

通過研究表明,堿提桑黃菌絲體多糖的總糖和糖醛酸含量分別為84.92%±0.51%、16.92%±0.40%,且不含蛋白質(zhì)。Kim等[17]用堿溶液提法從裂褶菌中提取出來的水溶性多糖具有較高的多糖含量,與本研究具有一致性。單糖組成分析研究發(fā)現(xiàn),PL-N 主要由D-阿拉伯糖、D-木糖、D-葡萄糖和D-半乳糖組成,其分子摩爾比為5.5∶7.8∶1.8∶1。這些結(jié)果表明通過1.25 mol/L NaOH/0.05% NaBH4提取得到的PL-N為酸性為雜多糖,這和Kozarski等[6]和Wang等[18]得出的結(jié)論一致。

2.2 堿提桑黃菌絲體多糖的體外抗氧化活性

2.2.1 清除DPPH自由基能力 PL-N和VC的清除DPPH自由基能力如圖1所示。從圖1中可以看出,PL-N顯示出明顯的清除DPPH自由基能力,且呈劑量依賴關(guān)系。當濃度為2.0 mg/mL時,PL-N的DPPH自由基清除率為72.1%,顯示出良好的清除DPPH自由基能力,但是低于VC(0.1 mg/mL,94.1%)。Wang等[19]通過熱水提取和柱層析分離從桑黃(P.nigricans)菌絲體中得到3個多糖組分(PNMP1、PNMP2和 PNMP3),研究發(fā)現(xiàn),含有硫酸基團的PNMP2和PNMP3比中性多糖PNMP1具有較高的DPPH自由基清除能力。同樣地,PL-N為含有羧基的酸性雜多糖,也顯示出良好的DPPH自由基清除能力。多糖的清除自由基能力與它們的供氫能力有關(guān),基團高活性的能力意味著更強的供氫能力,多糖中糖醛酸、硫酸基團的存在能夠激活異頭碳上的氫原子,進而顯示出突出的清除自由基能力[19]。

圖1 PL-N的DPPH自由基清除能力Fig.1 DPPH free radical scavenging capacity of PL-N

2.2.2 清除羥自由基(·OH)能力 PL-N對羥自由基清除能力的試驗結(jié)果如圖2所示。從圖2中可以發(fā)現(xiàn),隨著樣品濃度的增加,PL-N的·OH清除能力呈增加趨勢,在測定的濃度(0～2 mg/mL)范圍內(nèi)呈現(xiàn)明顯的劑量依賴關(guān)系。在同樣的濃度下,VC顯示出很強的清除·OH能力,且在0.5 mg/mL時,達到最大清除率為91.2%。當樣品濃度為2.0 mg/mL時,PL-N的·OH清除率為83.3%,說明PL-N桑黃菌絲體多糖具有良好的清除·OH活性,這與清除DPPH自由基的作用是一致的。謝麗源等[20]考察了桑黃粗多糖(SH)、純化多糖組分(P-47000、P-8700)的體外清除自由基活性,研究表明,P-8700對羥自由基具有良好的清除效果,在濃度5.0 mg/mL時清除率達到53.42%,且高于SH和P-47000,但遠低于PL-N的(83.3%,2.0 mg/mL)。這可能是由于通過1.25 mol/L NaOH/0.05% NaBH4提取分離得到的PL-N具有較高的總糖和糖醛酸含量,糖醛酸含量的高低與清除自由基能力及抗氧化活性有著直接關(guān)系[12]。此外,多糖的單糖組成、分子量、結(jié)構(gòu)及其鏈構(gòu)象也對清除自由基能力起到一定作用。

表2 PL-N對衰老小鼠血清中抗氧化酶活性和丙二醛含量的影響Table 2 Effect of PL-N on the activities of antioxidant enzymes and the content of MDA in serums of senile mice

圖2 PL-N的羥自由基清除能力Fig.2 ·OH scavenging capacity of PL-N

2.2.3 細胞保護作用 圖3為不同濃度的PL-N對H2O2誘導(dǎo)的SH-SY5Y細胞的保護作用。與正常細胞相比,H2O2誘導(dǎo)的神經(jīng)細胞活性極顯著降低(P<0.01),但是用不同濃度(10～80 μg/mL)的PL-N進行預(yù)處理后其細胞活性出現(xiàn)了顯著提高(P<0.05)。在濃度為80 μg/mL時,用PL-N進行預(yù)處理后的細胞存活率為88.7%。結(jié)果表明,PL-N具有良好的細胞保護作用,從而顯示了其突出的抗氧化活性。這與前面的清除DPPH和羥自由基試驗具有很好的一致性。

圖3 不同濃度PL-N對過氧化氫誘導(dǎo)的 SH-SY5Y細胞損傷的保護作用Fig.3 Cytoprotective effects of different concentrations of PL-N on H2O2-induced SH-SY5Y cell injury注:與陰性對照相比,*表示顯著(P<0.05), **表示極顯著(P<0.01);與陽性對照相比, ##表示極顯著(P<0.01)。

2.3 堿提桑黃菌絲體多糖的體內(nèi)抗氧化活性

2.3.1 PL-N對模型小鼠臟器指數(shù)的影響 各組小鼠肝臟、胸腺、脾臟指數(shù)結(jié)果如表1所示,和正常組相比,D-半乳糖處理的模型組小鼠的三種臟器指數(shù)顯著降低(P<0.05);與模型組對比,陽性對照(VC)組、PL-N處理組的三種臟器指數(shù)均有不同程度的提高,中劑量和高劑量PL-N處理組顯著性提高(P<0.05),且均呈現(xiàn)一定的濃度依賴關(guān)系?？偟膩碇v,D-半乳糖處理的模型組的肝臟、胸腺和脾臟重量降低,功能衰退,灌胃不同劑量的PL-N對以上三種臟器的衰老均有一定程度的抑制作用,從而對機體的免疫器官起到保護作用。

表1 PL-N對D-半乳糖誘導(dǎo)衰老小鼠臟器指數(shù)的影響Table 1 Effect of PL-N on organ index of D-galactose-induced senile mice

注:與模型對照組相比,*表示顯著(P<0.05),**表示極顯著(P<0.01),***表示高度顯著(P<0.001);表2、表3同。

表3 PL-N對衰老小鼠肝臟中抗氧化酶活性和丙二醛含量的影響Table 3 Effect of PL-N on the activities of antioxidant enzymes and the content of MDA in livers of senile mice

堿提桑黃菌絲體多糖PL-N對衰老小鼠血清和肝臟中抗氧化酶活力的影響如表2和表3所示。從表2、表3中可以看出,與正常對照組相比,D-半乳糖誘導(dǎo)模型組衰老小鼠的血清和肝臟中抗氧化酶(SOD、CAT、GSH-Px)活性顯著減小(P<0.05),說明模型建造成功。與模型對照組相比,陽性對照組的抗氧化酶活力均極顯著提高(P<0.01);堿提桑黃菌絲體多糖PL-N各處理組小鼠血清和肝臟中抗氧化酶活力均顯著提高(P<0.05),其中PL-N高劑量組的效果最佳。這些結(jié)果表明,PL-N能夠提高D-半乳糖所致的氧化損傷小鼠體內(nèi)的SOD、CAT和GSH-Px活力,增強其體內(nèi)自由基清除能力。

通過測定丙二醛(MDA)量能夠反映機體內(nèi)脂質(zhì)過氧化的程度,間接地反映出細胞損傷的程度[24]。如表2和表3所示,正常對照組小鼠血清和肝臟中MDA含量均低于模型對照組,差異顯著(P<0.05),說明D-半乳糖致小鼠衰老模型建模成功。陽性對照組、PL-N低劑量、PL-N中劑量和PL-N高劑量組的小鼠血清和肝臟中MDA含量與模型對照組相比差異極顯著(P<0.01),且呈一定的劑量效應(yīng)關(guān)系。這些結(jié)果表明,堿提桑黃菌絲體多糖PL-N能夠顯著降低衰老小鼠血清和肝臟中的MDA含量,抑制生物膜脂質(zhì)過氧化反應(yīng),具有明顯的抗氧化作用。

2.3.3 PL-N對模型小鼠肝臟中總抗氧化能力的影響 各組小鼠肝臟中的總抗氧化能力(TAOC)如圖4所示,與正常對照組相比,模型對照組小鼠肝臟中的TAOC能力極顯著降低(P<0.01),表明在D-半乳糖的誘導(dǎo)損傷下,小鼠機體的總抗氧化能力明顯削弱;與模型對照組相比,陽性對照組的TAOC能力高度顯著提高(P<0.001);灌胃不同濃度PL-N后,與模型對照組相比,PL-N各處理組小鼠肝臟中的TAOC明顯增加。表明 PL-N能明顯抑制或者治療D-半乳糖誘導(dǎo)引發(fā)小鼠TAOC的降低,并能提高肝臟組織的TAOC水平。經(jīng)統(tǒng)計學處理,均有高度顯著性差異(P<0.001),且呈明顯的劑量效應(yīng)關(guān)系。結(jié)果表明PL-N能夠顯著增強機體總抗氧化能力的活性。

圖4 肝臟中的總抗氧化能力Fig.4 TAOC in liver注:與模型對照組相比,**表示極顯著(P<0.01), ***表示高度顯著(P<0.001)。

近年來,國內(nèi)外研究者通過建立D-半乳糖誘導(dǎo)的小鼠模型來評價不同桑黃菌來源和不同提取分離方法所得到的不同結(jié)構(gòu)特征的桑黃多糖的體內(nèi)抗氧化活性,并揭示其構(gòu)效關(guān)系,為功能性食品開發(fā)提供理論指導(dǎo)。Luo等[7]研究了桑黃菌絲體(P.baumiiPilát)多糖PBMP的理化性質(zhì)和體內(nèi)抗氧化活性,研究發(fā)現(xiàn),PBMP主要由葡萄糖、半乳糖、巖藻糖、甘露糖和鼠李糖組成的雜多糖,灌胃PBMP能夠明顯且呈劑量依賴地增加D-半乳糖誘導(dǎo)衰老小鼠的體內(nèi)抗氧化酶活性,降低血清和肝臟中丙二醛含量。同樣地,Yan等[25]通過熱水提取和柱層析分離從桑黃菌絲體(P.linteus)得到一高分子量(～290000 kDa)的水溶性雜多糖(PLP1-1),體內(nèi)抗氧化研究表明,PLP1-1能夠明顯地提高血清和肝臟中抗氧化酶(SOD、GSH-Px和CAT)活性,降低丙二醛含量。以往報道的研究結(jié)果均略低于本研究PL-N的,這可能是因為PL-N具有較高的多糖和糖醛酸含量,此外,通過該方法提取得到的多糖或許具有較為有序的鏈構(gòu)象,這也將有助于其高抗氧化活性的發(fā)揮。

3 結(jié)論

堿提桑黃菌絲體多糖PL-N的總糖和糖醛酸含量分別為84.92%±0.51%和16.92%±0.40%,且不含蛋白質(zhì);PL-N主要由D-阿拉伯糖、D-木糖、D-葡萄糖和D-半乳糖組成,其分子摩爾比為5.5∶7.8∶1.8∶1。體外清除自由基和細胞實驗研究表明,PL-N能夠明顯地清除DPPH和·OH自由基的能力和對過氧化氫損傷的神經(jīng)細胞的保護作用,揭示其具有良好的體外抗氧化活性。利用D-半乳糖所致的小鼠亞急性衰老模型,綜合評價PL-N的體內(nèi)抗氧化活性。研究發(fā)現(xiàn),PL-N灌胃40 d后,小鼠(胸腺、脾臟、肝臟)臟器指數(shù),血清和肝臟中的SOD、GSH-Px、CAT活性均顯著增加(P<0.05);MDA含量極顯著降低(P<0.01);小鼠肝臟中TAOC高度顯著提高(P<0.001),且呈劑量依賴關(guān)系。這些結(jié)果揭示 PL-N 具有明顯的體內(nèi)抗氧化活性,可作為功能性食品應(yīng)用于膳食、理療中。