轉(zhuǎn)化生長因子5在發(fā)育性髖關(guān)節(jié)發(fā)育不良中的作用研究進展

姚佳煒, 邱波

武漢大學人民醫(yī)院骨科, 武漢 430060

發(fā)育性髖關(guān)節(jié)發(fā)育不良(DDH)是一種十分復雜的發(fā)育障礙，是指股骨頭和髖臼的大小、形狀、方向或軟組織的異常所導致的脫位或半脫位。兒童先天性的髖關(guān)節(jié)發(fā)育不良可造成股骨和髖臼周圍組織如軟骨、滑膜發(fā)育的異常，進而引發(fā)早期骨關(guān)節(jié)炎(osteoarthritis，OA)，致使患兒的雙側(cè)下肢疼痛、畸形甚至殘疾；青壯年期的髖關(guān)節(jié)發(fā)育不良會引起病患步態(tài)的異常、兩側(cè)肢體的力量和長度不等、脊柱側(cè)凸及膝關(guān)節(jié)炎，嚴重影響患者的生活質(zhì)量[1]。早期診斷患DDH的新生兒可通過簡單的夾板治療獲得較好的、安全的療效；但若閉合復位失敗，或年齡大于18個月的幼兒則需要進行外科手術(shù)。但是對于DDH兒童，多種切開復位型外科手術(shù)都有引起后續(xù)的股骨頭壞死(osteonecrosis of the femoral head，F(xiàn)HO)的風險，這也是醫(yī)源性的嚴重的并發(fā)癥之一，且難以治愈[2]。而出生時髖關(guān)節(jié)全脫位發(fā)生率為0.1%～0.5%，半脫位與發(fā)育不良的發(fā)生率為1%，超聲篩查報告篩查人群發(fā)病率為2.5%～5%[3]。因此，早期預防和診斷是治療DDH的關(guān)鍵。

早期專業(yè)的臨床體格檢查對于DDH的發(fā)現(xiàn)具有重要意義。目前動靜態(tài)的超聲檢查是診斷DDH的主要手段，但對于新生兒與兒童的體格檢查則需要專業(yè)經(jīng)驗較高的專家進行篩查，這是由于超聲檢查無法評估患兒的預后，可能造成一些無DDH危險因素且預后較好的患兒因醫(yī)務(wù)人員主觀診斷的偏差而選擇不恰當?shù)倪^度治療[2]。DDH會影響一個家庭的多個成員，并且具有較強的遺傳基礎(chǔ)，現(xiàn)有研究表明此種疾病具有不完全外顯率的常染色體顯性遺傳模式[4]。通過基因譜分析可篩選出與DDH相關(guān)的易感基因，再用超聲檢查篩選具有易感基因患兒，從而改善單純應(yīng)用超聲檢查所造成的醫(yī)務(wù)人員選擇過度治療方案的問題[2]?，F(xiàn)已通過關(guān)聯(lián)研究篩選出了許多易感基因，如PAPPA2、COL2AL、HOXD9、GDF5和TGFBI，這些基因的發(fā)現(xiàn)有助于預防DDH患者進一步的發(fā)展[5]。其中，Hatzikotoulas等[4]通過鑒定GDF5啟動子變異與DDH之間的復制證據(jù)，已確定GDF5與DDH之間的關(guān)聯(lián)。

轉(zhuǎn)化生長因子-β家族(transforming growth factor-β，TGF-β)是由哺乳動物33個基因編碼的，其在控制細胞增殖、分化，傷口愈合和纖維化等方面具有多重作用[6]。GDF5屬于TGF-β家族的一員，可促進軟骨和骨的發(fā)育、修復與維持，并且與骨形態(tài)發(fā)生蛋白(bone morphogenetic protein，BMP)密切相關(guān)[7]。BMPs為骨衍生物中的骨誘導成分，在各種器官(如骨、血管)、組織(如軟骨、骨骼肌)的形成和維持中起重要作用[8]。因此，早期發(fā)現(xiàn)患兒GDF5基因的缺失、增強、替換等變異對于DDH發(fā)現(xiàn)和診斷具有重要意義，對于其治療也有一定的指導作用?；诖耍疚闹饕懻揋DF5基因及其調(diào)節(jié)基因在DDH發(fā)病機制中產(chǎn)生的作用，以及如何利用GDF5制定針對DDH的治療方案，以期為DDH的臨床治療提供新的策略。

1 GDF5在基因?qū)用鎸DH的影響

1.1 GDF5的基因型

GDF5位于20號染色體的20q11.2上，GDF5基因的5′非翻譯區(qū)(5′-untranslated region，5′UTR)單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism，SNP)位點rs143383和等位基因的存在與DDH密切相關(guān)。Dai等[9]在病例對照研究中發(fā)現(xiàn)GDF5SNP與漢族人群中的DDH相關(guān)聯(lián)，隨著T等位基因頻率的顯著增加，其DDH的嚴重程度也隨之增加，表明GDF5SNP與DDH的嚴重程度相關(guān)。近期Sadat-Ali等[10]收集分析了473份沙特阿拉伯人的血液樣本，其中100份來自于已被確診為DDH患者的血液樣本，200份來源于其父母，73份來自于其兄弟姐妹，100份源于健康者，來研究患者基因型與親屬基因型的關(guān)聯(lián)性。研究發(fā)現(xiàn)TT基因型與CC基因型相比具有更高的發(fā)展為DDH的風險，而且首次發(fā)現(xiàn)基因型TT和T等位基因在患者與其父親中過度表達。因此，GDF5中TT基因型的胎兒在出生后有患DDH的風險，且父系間的遺傳效應(yīng)更為明顯，風險也更高。

1.2 GDF5基因SNP位點rs143383缺陷

位于GDF5基因的上游5′UTR中rs143383的C至T對編碼GDF5具有功能性，其對于骨骼肌肉系統(tǒng)的作用具有多重性，與膝髖關(guān)節(jié)炎、DDH、腰椎間盤退變和肌腱病變相關(guān)[11]。GDF5基因SNP位點rs143383缺陷導致GDF5的減少，GDF5與BMP受體Ⅱ型、BMP受體ⅠB型和BMP受體ⅠA型的結(jié)合減少，從而阻礙了Smad1/5/8的磷酸化。而磷酸化的Smad1/5/8可與Smad1/4復合，此復合物易位到細胞核可調(diào)節(jié)靶基因的轉(zhuǎn)錄[12]。這些靶基因包括COL2AL和ACAN，負責編碼軟骨主要結(jié)構(gòu)蛋白的Ⅱ型膠原蛋白和聚集蛋白聚糖等。GDF5的減少阻遏了軟骨細胞的形成與發(fā)育、肌腱和骨骼的愈合，從而成為DDH的風險因素。這也提示了GDF5基因中5′UTR SNP位點rs143383的缺乏會導致膝髖關(guān)節(jié)軟骨與滑膜的發(fā)育不良，進而引起患兒在早期發(fā)育中形成DDH。因此，外源給予GDF5為減輕DDH或OA遺傳缺陷提供了治療的可能[13]。

1.3 GDF5/CDMP-1基因表達的增強

作為GDF5的同源物，軟骨源形態(tài)發(fā)生蛋白-1(cartilage-derived morphogenetic protein-1，CDMP-1)能夠促進軟骨細胞的肥大與增殖，并且在四肢骨骼的縱向生長和軟骨形成的空間結(jié)構(gòu)化模式中起關(guān)鍵作用。Tsumaki等[14]通過對轉(zhuǎn)基因小鼠導入3種不同的啟動子/增強子重組CDMP-1序列(742-CDMP1/742-CDMP1-Int/COL2A1-CDMP1)來研究轉(zhuǎn)基因小鼠的表型變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)3種CDMP-1的轉(zhuǎn)基因小鼠都顯示軟骨發(fā)育不良、軟骨細胞增殖并向肥厚型軟骨細胞分化;轉(zhuǎn)基因小鼠在體型與骨骼畸形程度上因表達水平的不同而存在差異；轉(zhuǎn)基因小鼠在遠端骨骼上的擴張比近端更加突出。這種GDF5的人類同源物CDMP-1可調(diào)節(jié)骨骼元素的形成、生長和分化，控制著肢體遠端部分骨骼如四肢、髖膝關(guān)節(jié)等軟骨的發(fā)育和空間構(gòu)象。在人類正常發(fā)育中，GDF5/CDMP-1不在脊柱中表達，只調(diào)節(jié)肢體遠端的骨骼形狀和大小，而且在人類中BMP獨特的表達模式和特定的受體親和力在不同骨架成分的形成中起重要作用，即BMP的空間調(diào)節(jié)作用[14]。GDF5/CDMP-1基因表達的增強會造成四肢骨骼(如股骨)的肥大、髖關(guān)節(jié)囊的異常，最終造成其髖關(guān)節(jié)的脫位及半脫位。

1.4 DNA的高度甲基化

GDF5的DNA甲基化在表觀遺傳學上與DDH易感性有關(guān)。表觀遺傳學是一種不改變DNA序列只影響基因表達的過程。甲基(CH3)通過DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶(DNA methyltransferase，DNMT)，轉(zhuǎn)移到胞嘧啶上形成5-甲基胞嘧啶。Baghdadi等[15]挑選45名DDH患者和45名健康患者的股骨頸軟骨進行DNA的甲基化分析對照，發(fā)現(xiàn)DDH患者的GDF5啟動子高度甲基化，這種甲基化導致GDF5的表達降低。位于GDF5基因的5′UTR的甲基化所引起的rs143383等位基因的表達失衡是由阻遏蛋白SP1、SP3和DEAF1所介導的。SP1、SP3和DEAF1阻遏蛋白抑制GDF5的表達，SP1抑制rs143383中T等位基因比C等位基因作用更強，而SP3抑制C等位基因作用比T等位基因更為明顯。在5′UTR甲基化時，SP1、SP3和DEAF1減弱了對等位基因的差異性抑制[11]。因此，在5′UTR甲基化下，GDF5的T等位基因相對于C等位基因被抑制的作用減弱，表現(xiàn)為相對增強，從而形成TC型基因型,與TT型基因型的兒童具有相同的患病風險。

1.5 GDF5的調(diào)節(jié)基因SOX基因

SOX(SRY-related high mobility group-box gene)基因調(diào)節(jié)許多細胞類型的規(guī)范和分化，在睪丸、中樞神經(jīng)系統(tǒng)、少突膠質(zhì)細胞、軟骨細胞和神經(jīng)嵴細胞的發(fā)育中起著重要作用，其中，SOX9基因編碼的蛋白是調(diào)控軟骨在各階段發(fā)育過程中的主要調(diào)節(jié)因子[16]。研究表明，SOX5基因的過表達會顯著增強基質(zhì)金屬蛋白酶-9(matrix metalloproteinase-9，MMP-9)基因的表達，從而促進軟骨細胞外基質(zhì)的降解，造成軟骨組織結(jié)構(gòu)的破壞、關(guān)節(jié)內(nèi)畸形，直至發(fā)展成DDH。Kan等[17]研究SOX基因過表達的小鼠前軟骨細胞系A(chǔ)TDC5與人宮頸癌Hela細胞來檢查GDF5啟動子的轉(zhuǎn)錄活性，發(fā)現(xiàn)SOX4、SOX11、SOX12基因?qū)DF5啟動子具有較強的活性，其中SOX11的作用最強。將SOX11引入逆轉(zhuǎn)錄病毒并感染軟骨形成ATDC5和成纖維細胞中，GDF5蛋白的表達增加；相反，抑制逆轉(zhuǎn)錄病毒的短發(fā)夾RNA(short hairpin RNA，shRNA)抑制ATDC5細胞中內(nèi)源性SOX11活性，GDF5mRNA的水平被抑制[17]。SOX蛋白家族與GDF5基因的結(jié)合位點位于GDF5基因的5′UTR區(qū)域中，以調(diào)節(jié)GDF5基因的轉(zhuǎn)錄活性[18-19]。在關(guān)節(jié)的形成過程中，Wnt9a/β連環(huán)蛋白與GDF5蛋白基于對軟骨細胞的作用，從而調(diào)控關(guān)節(jié)軟骨組織的分化和維持關(guān)節(jié)形態(tài)發(fā)育中關(guān)節(jié)空間的穩(wěn)定[20]。關(guān)節(jié)軟骨組織的形成是由內(nèi)分泌蛋白GDF5刺激軟骨細胞形成的，SOX11蛋白是通過增強GDF5表達來促進關(guān)節(jié)軟骨成熟，是關(guān)節(jié)發(fā)育后期所涉及的蛋白之一。檢測在全膝關(guān)節(jié)置換術(shù)后小鼠和人類樣本的膝關(guān)節(jié)炎試驗?zāi)Ｐ偷谋磉_模式表明在降解的軟骨組織中，SOX基因家族的表達也降低[17]。SOX基因表達的增強或減弱既可直接影響關(guān)節(jié)內(nèi)軟骨的發(fā)育，又可通過調(diào)節(jié)GDF5啟動子的活性，來調(diào)控軟骨細胞的增殖與分化。因此，SOX的異常表達可造成關(guān)節(jié)內(nèi)軟骨的發(fā)育不良，是DDH在基因水平上的潛在發(fā)病因素之一。

2 基于GDF5的DDH治療策略

2.1 rhGDF5關(guān)節(jié)內(nèi)注射

作為胚胎早期關(guān)節(jié)形成發(fā)育標記物，GDF5參與維持骨修復和軟骨發(fā)育，并在滑膜關(guān)節(jié)發(fā)育中起重要作用[21]。而GDF5基因的突變和缺陷也會導致軟骨的發(fā)育不良，從而阻止正常的骨骼發(fā)育并產(chǎn)生嚴重的關(guān)節(jié)病變。在關(guān)節(jié)內(nèi)直接補充重組人GDF5(recombinant human GDF5，rhGDF5)潛在激活合成代謝反應(yīng)以預防疾病進展和促進軟骨修復，可作為一項治療OA和DDH的方法。Parrish等[22]對大鼠實施內(nèi)側(cè)半月板切除術(shù)以建立大鼠內(nèi)側(cè)半月板橫斷(medial meniscus transection，MMT)關(guān)節(jié)不穩(wěn)定OA模型，同時對照組給予關(guān)節(jié)內(nèi)注射具有甘氨酸緩沖液的海藻糖溶液，干預組給予關(guān)節(jié)內(nèi)注射rhGDF5。結(jié)果顯示對大鼠關(guān)節(jié)內(nèi)注射rhGDF5可顯著刺激軟骨修復，且療效與其注射劑量相關(guān)。因MMT大鼠模型中軟骨的修復對rhGDF5關(guān)節(jié)內(nèi)注射劑量和注射方案的依賴性作用，給藥劑量范圍和其他注射方法需要進一步的研究。這一研究成果也提示rhGDF5具有治療髖關(guān)節(jié)發(fā)育不良的潛力。

2.2 硫酸乙酰肝素與GDF5作用

研究表明，GDF5能夠刺激聚集蛋白聚糖基因的表達但不會增強Ⅹ型膠原蛋白的表達[23]。這一特性使其成為關(guān)節(jié)軟骨改善組織工程策略的靶標。硫酸乙酰肝素是由交替的葡糖胺和糖醛酸殘基組成的線性多糖，它與多種蛋白質(zhì)配體相結(jié)合而使其呈遞、保護、寡聚化或構(gòu)象激活，從而對蛋白質(zhì)配體產(chǎn)生多種影響[24]。Ayerst等[25]通過研究肝素在臨床和組織中的應(yīng)用發(fā)現(xiàn)肝素可抑制細胞表面硫酸乙酰肝素(heparin sulfate，HS)與GDF5的結(jié)合，并抑制GDF5誘導的Smad1/5/8信號的傳導，而HS蛋白聚糖對于GDF5定位于細胞并誘導間充質(zhì)細胞衍生為軟骨細胞至關(guān)重要。HS能夠?qū)DF5定位于骨骼細胞系細胞上，并且會刺激聚集蛋白聚糖的表達而不會影響Ⅹ型膠原蛋白的表達[25]。這一研究有助于指導臨床同時使用肝素與硫酸乙酰肝素，也為誘導基質(zhì)細胞分化為正常軟骨細胞而不是形成肥大細胞提供了方案，即為治療因軟骨細胞發(fā)育異常引起的DDH給予了治療方向。

2.3 GDF5基因修飾干細胞

關(guān)節(jié)軟骨的發(fā)育不良、外傷、缺損和老化可能會導致嚴重的臨床問題，如髖關(guān)節(jié)軟骨的發(fā)育不良致使髖關(guān)節(jié)的脫位及半脫位等?；|(zhì)相關(guān)的自體軟骨細胞移植(matrixassociated autologous chondrocyte transplantation，MACT)是目前用于治療創(chuàng)傷性軟骨缺損的最有效的方法之一[26]。在各種移植細胞的來源中，脂肪來源干細胞(adipose stem cells，ADSCs)因具有較高的產(chǎn)量和便于收集的優(yōu)點，而被認為是一種既易獲取又易培養(yǎng)的優(yōu)質(zhì)干細胞[27]。Yang等[28]用攜帶GDF5的腺病毒感染hADSCc以建立帶有GDF5基因的改良ADSCs，來探究被GDF5修飾后的ADSCs是否能夠促進其干細胞向軟骨的分化及增殖。在培養(yǎng)3周后發(fā)現(xiàn)干預組(即被GDF5修飾的ADSCs)所產(chǎn)生的硫酸化糖胺聚糖(sulfated glycosaminoglycan，sGAG)高于對照組(即未被修飾的ADSCs)，且干預組ADSCs相比對照組，更易聚集形成細胞團，細胞團的形狀也更加規(guī)則。這項研究表明被GDF5修飾的hADSCs更有利于向軟骨分化。GDF5基因修飾的干細胞對于修復DDH中軟骨發(fā)育不良方面具有巨大潛力，但仍需更多的研究去挖掘與支持，以用于臨床患兒的治療。

3 展望

DDH與患者的性別、家族遺傳史及出生時體位等多種危險因素相關(guān)，且目前多種切開復位手術(shù)治療方案存在遠期危險并發(fā)癥(如股骨頭壞死等)，早期的發(fā)現(xiàn)與診斷仍然是阻止DDH進展的重點。早期的臨床體格檢查與動靜態(tài)的超聲檢查是目前DDH主要的診斷方法，也是用于評判對患者采取何種手術(shù)方式及預后的指標?；蜃V中GDF5基因分析可與超聲檢查結(jié)合，用于準確并及時對具有GDF5變異基因的患者實施早期評估和干預，從而避免DDH進一步的進展及醫(yī)務(wù)人員進行的不恰當?shù)倪^度治療。這為醫(yī)務(wù)人員實施個體化治療與精準醫(yī)療提供了便利，也提高了患者的醫(yī)療獲益，但具體在臨床上的應(yīng)用及普及仍有許多待解決的問題。

GDF5在骨骼和肌肉的發(fā)育過程中起著重要的作用，控制著軟骨和骨的發(fā)育、修復與維持，并對髖部的形態(tài)發(fā)育具有調(diào)控作用[29]。位于GDF5基因的5′UTR SNP位點rs143383中T等位基因與DDH密切相關(guān)，TT型基因型的新生兒具有更高的患有DDH的風險[9]。但此項研究采集的標本所屬人種較為單一，此結(jié)論是否適用于其他人種還有待證實與考核。另外，SNP位點rs143383的缺陷、GDF5基因的5′UTR的甲基化、CDMP-1基因與SOX基因表達的增強或減弱均可導致髖膝關(guān)節(jié)軟骨的發(fā)育不良，進而引起DDH的發(fā)生。上述研究為研究人員深入了解DDH的發(fā)病機制拓寬了道路，但目前研究仍集中于基因分子層面，其下游相關(guān)信號通路激活的方式，體內(nèi)是否存在影響GDF5基因、CDMP-1基因、SOX基因表達的其他基因，以及GDF5等基因在體內(nèi)編碼的蛋白水平的實際變化還知之甚少，因此GDF5基因在DDH發(fā)病機制上的作用仍有許多值得探究的空間。

此外，在小鼠關(guān)節(jié)內(nèi)直接注射GDF5注射劑來改善軟骨的發(fā)育，或采用GDF5修飾的干細胞以促進軟骨細胞的增殖與分化等方案，為DDH的治療提供了新的治療策略?；贕DF5來制定DDH的治療方案目前研究報道甚少，且上述多種策略仍處于細胞和小鼠的基礎(chǔ)實驗，其對于DDH的治療療效及臨床可行性方面仍需要大量研究去探索和驗證。但基于GDF5在促進軟骨發(fā)育上的顯著作用，其相關(guān)治療策略在DDH治療上具有巨大潛力。