CRISPR/Cas9 和堿基編輯器
——農(nóng)業(yè)動物研究領(lǐng)域的新利器

江浩筠，幸宇云

（江西農(nóng)業(yè)大學(xué) 省部共建豬遺傳改良與養(yǎng)殖技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西 南昌 330045）

自20世紀(jì)80年代起，轉(zhuǎn)基因技術(shù)及其產(chǎn)品逐漸進(jìn)入公眾的視野，引發(fā)了大眾的廣泛專注，也產(chǎn)生了針對轉(zhuǎn)基因技術(shù)安全性的激烈爭論。當(dāng)今時(shí)代，日新月異的技術(shù)革新正向我們昂首走來，3D打印、人工智能、云計(jì)算、人造肉、商業(yè)載人航天飛船等，在各類新聞報(bào)道中不斷涌現(xiàn)。作為在現(xiàn)代生物技術(shù)中占有重要地位的轉(zhuǎn)基因技術(shù)，也產(chǎn)生了革命性的技術(shù)創(chuàng)新，逐步升級成更高效、更安全的基因組編輯技術(shù)，近幾年又衍生出堿基編輯技術(shù)，使得科研人員能“輕而易舉”地對基因組進(jìn)行特定位置單個(gè)堿基的精準(zhǔn)修飾。本文以科普的寫作手法，簡述了轉(zhuǎn)基因技術(shù)由“傳統(tǒng)粗放”到“現(xiàn)代精細(xì)化”的發(fā)展歷程，剖析了基因組編輯技術(shù)相比傳統(tǒng)轉(zhuǎn)基因技術(shù)在生物安全性上的優(yōu)勢，并重點(diǎn)闡述了基因組編輯的代表性技術(shù)——CRISPR/Cas9及其衍生技術(shù)（堿基編輯器）在農(nóng)業(yè)動物研究領(lǐng)域可以發(fā)揮的作用。

1 傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)基因技術(shù)及應(yīng)用

轉(zhuǎn)基因技術(shù)是指將人工分離和修飾過的基因?qū)氲绞荏w生物中，使導(dǎo)入的外源基因在受體中表達(dá)并引起性狀改變的技術(shù)。自1982年全世界第一只產(chǎn)生明顯性能改變的轉(zhuǎn)基因動物[1]和1983年全球第一例轉(zhuǎn)基因植物[2]研制成功以來，轉(zhuǎn)基因技術(shù)在生物技術(shù)領(lǐng)域發(fā)揮了舉足輕重的作用，對人類生活產(chǎn)生了重要的影響。在植物領(lǐng)域，抗蟲棉花、抗蟲水稻、抗蟲玉米、抗除草劑大豆、抗病毒木瓜、耐儲存番茄等轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品， 早已滲入到公眾的日常生活中。 以美國為例， 美國是最早進(jìn)行轉(zhuǎn)基因作物商業(yè)化種植的國家，也一直是轉(zhuǎn)基因作物的種植和消費(fèi)大國，轉(zhuǎn)基因食品已成為美國民眾餐桌上的“家常便飯”[3-4]。在動物研究領(lǐng)域，轉(zhuǎn)基因技術(shù)也發(fā)揮了出色的作用。2006年，利用轉(zhuǎn)基因山羊乳汁中產(chǎn)生的抗人凝血酶III蛋白，成為了國際上首例獲準(zhǔn)上市的由轉(zhuǎn)基因動物生產(chǎn)的基因工程蛋白藥物，為患有先天性抗凝血酶缺失癥的病人帶來了福音；又如，科學(xué)家們研制的各種轉(zhuǎn)基因小鼠模型，為人類健康和醫(yī)學(xué)發(fā)展做出了重要的貢獻(xiàn)。不過對于科研工作者，轉(zhuǎn)基因技術(shù)有個(gè)“令人頭疼”的地方，那就是外源基因整合入受體生物時(shí)，往往比較“隨心所欲”，整合的位置和數(shù)量都不太容易操控。

雖然轉(zhuǎn)基因技術(shù)為人類社會做出了重要的貢獻(xiàn)，從第一種轉(zhuǎn)基因食品上市至今也有近30年的歷史，但不少民眾對轉(zhuǎn)基因食品的安全性仍存在疑慮。擔(dān)心的焦點(diǎn)問題之一是，食用轉(zhuǎn)基因食品后，轉(zhuǎn)入基因所表達(dá)的蛋白質(zhì)是否會對人的健康產(chǎn)生不利影響？另外，轉(zhuǎn)入的基因一般需要“安裝”在一個(gè)載體上，載體中的骨架序列也會進(jìn)入到受體中，這些序列是否會存在一些潛在的威脅呢？非常明晰的是，所有生命體的DNA序列都是由A、T、C、G四個(gè)堿基按不同的排列組合所構(gòu)成，而我們每天所進(jìn)食的動植物產(chǎn)品，也都是由DNA及其所表達(dá)的蛋白質(zhì)所組成。這些物質(zhì)進(jìn)入人體后，都將被酶分解成小分子；從這個(gè)角度看，轉(zhuǎn)基因食品和傳統(tǒng)的食品是無差別的。還有，自然界中廣泛存在的雜交動植物品種，即是不同品種之間大量DNA的重新組合，這本身就是一種“廣義的轉(zhuǎn)基因”。需要說明的是，所有的轉(zhuǎn)基因食品在上市前均需經(jīng)過嚴(yán)格、系統(tǒng)、復(fù)雜的生物安全評價(jià)，只有評估合格的才能走向市場；轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品上市至今，其中的轉(zhuǎn)基因大豆、玉米和油菜等大規(guī)模生產(chǎn)、食用，均未發(fā)現(xiàn)安全性問題。正是由于轉(zhuǎn)基因技術(shù)有目共睹的貢獻(xiàn)及長期論證后的安全可靠，2016年近百位諾貝爾獎獲得者聯(lián)名簽署公開信支持轉(zhuǎn)基因技術(shù)，截止2019年11月，簽名的諾貝爾獎得主人數(shù)達(dá)到了151位，這代表了科學(xué)家群體共同的聲音。

2 基因組編輯技術(shù)及其在動物研究領(lǐng)域的應(yīng)用

傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)基因技術(shù)會帶入除目標(biāo)基因之外的多余序列，且整合一般是隨機(jī)的，這是導(dǎo)致安全爭論的重要原因之一。那是否有更精準(zhǔn)的技術(shù)以克服上述問題呢？答案是肯定的，這就是基因組編輯技術(shù)。基因組編輯是指利用特異性的核酸酶切割目標(biāo)DNA序列，然后通過不帶“模板”的修復(fù)敲除基因、或通過帶“模板”的修復(fù)以修飾基因組。相比傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)基因技術(shù)，基因組編輯技術(shù)的安全性得到了顯著提升?；蚪M編輯技術(shù)有“指哪打哪”的技術(shù)特長；另外，修復(fù)“模板”的兩端（稱為同源臂）與受體的DNA序列完全相同，同源臂之間是想要導(dǎo)入的目標(biāo)序列，除目標(biāo)序列外不會帶入多余的序列。迄今已成功應(yīng)用的基因組編輯技術(shù)有ZFN、TALEN和CRISPR-Cas，這3種技術(shù)分別在2002、2011和2012年被報(bào)道成功應(yīng)用[5]。在這3種技術(shù)中，CRISPR-Cas“家族”中的CRISPR-Cas9系統(tǒng)，因其操作簡單、效率高、成本低等原因而備受推崇。CRISPR-Cas9系統(tǒng)是在CRISPR上“裝載”一段目標(biāo)DNA中的特有序列（約20個(gè)堿基），這段特有序列在CRISPR中發(fā)揮“精確制導(dǎo)”的作用，指揮Cas9酶將特定位置的DNA雙鏈切開一個(gè)口子，然后在修復(fù)的過程中通過人為設(shè)計(jì)的“模板”以精準(zhǔn)修飾基因組，或不添加“模板”以實(shí)現(xiàn)基因敲除。

CRISPR-Cas9可以說是生命科學(xué)領(lǐng)域中的一項(xiàng)革命性技術(shù)，該技術(shù)從誕生到現(xiàn)在不到10年的時(shí)間，但其應(yīng)用呈現(xiàn)出爆發(fā)式增長，在許多研究領(lǐng)域都取得了眾多“亮眼”的成果，其中包括在農(nóng)業(yè)動物領(lǐng)域。這里列舉幾項(xiàng)代表性成果。結(jié)核病是一種人畜共患病，該病是奶牛場每年的必檢疫病，因?yàn)椴∨？赡芡ㄟ^奶源將結(jié)核傳染給人。研究表明，動物體內(nèi)NRAMP1（天然抗性相關(guān)巨噬蛋白）基因的表達(dá)量若提高，可以增強(qiáng)抗結(jié)核的能力。西北農(nóng)林科技大學(xué)張涌院士團(tuán)隊(duì)，利用CRISPR-Cas9技術(shù)，將牛一個(gè)拷貝的NRAMP1基因定點(diǎn)“放置”在DNA序列中的一個(gè)相對安全的位置上 （這種位置在基因組中俗稱為“安全港”） ，疊加牛體內(nèi)原有的NRAMP1基因后， 基因編輯牛表現(xiàn)出更強(qiáng)的抗結(jié)核感染能力[6]。 在比利時(shí)藍(lán)牛群體中，有部分個(gè)體身上（特別是臀部）的肌肉一塊塊突出，被稱為“雙肌臀”[7]；科學(xué)家們研究發(fā)現(xiàn)，比利時(shí)藍(lán)牛的這種表型是由于MSTN（肌肉生長抑制素）基因的自然缺失突變所造成的。在羊、狗等動物中也存在因該基因自然突變導(dǎo)致的“雙肌”現(xiàn)象，但在豬中暫未發(fā)現(xiàn)類似的自然突變。多個(gè)科研團(tuán)隊(duì)利用CRISPR-Cas9技術(shù)，精準(zhǔn)模擬了MSTN的自然缺失突變，使編輯豬也獲得了“雙肌”表型[8-10]。豬肉是全球餐桌上重要的肉類來源之一，近些年全球每年的生豬出欄量都超過了10億頭。另外有意思的是，與小型哺乳動物相比，豬在遺傳、體型大小、解剖特點(diǎn)、生理代謝和疾病特征上都與人更為相似，因此被公認(rèn)為是一種理想的疾病模型動物。亨廷頓舞蹈癥是一種罕見病，患者表現(xiàn)出不停地“手舞足蹈”等病癥，病情會逐步惡化直至死亡。研究表明，該病是由于一個(gè)名為Htt基因中CAG的序列重復(fù)次數(shù)異常增加所造成的，該突變造成患者腦部的一種神經(jīng)元選擇性死亡，從而產(chǎn)生“舞蹈癥”。中科院賴良學(xué)研究員課題組和美國華人李曉江教授團(tuán)隊(duì)合作，利用CRISPR-Cas9技術(shù)，用患者的CAG重復(fù)序列替換掉豬相應(yīng)位置的序列，獲得的基因編輯豬也表現(xiàn)出“舞蹈癥”及典型的腦部特定神經(jīng)元選擇性死亡[11]。而腦部特定神經(jīng)元選擇性死亡這一典型病理特點(diǎn)， 是過去在小鼠等動物模型長期研究中都無法獲得的。 該研究成果一經(jīng)報(bào)導(dǎo)，在國際上引起了轟動。上述幾個(gè)例子中，都是先在實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)的細(xì)胞中，利用基因組編輯技術(shù)“修改”序列，然后針對編輯好的細(xì)胞開展克隆工作以獲得基因編輯個(gè)體。這幾個(gè)例子生動地說明，基因組編輯技術(shù)在農(nóng)業(yè)動物品種改良中可以發(fā)揮出“立竿見影”的效果。通過該技術(shù)創(chuàng)制的精準(zhǔn)動物疾病模型，可以很好地服務(wù)于人類健康醫(yī)學(xué)和藥物研發(fā)。

3 堿基編輯器及其在動物研究領(lǐng)域的應(yīng)用

CRISPR-Cas9 技術(shù)因其出彩的表現(xiàn)而倍受科研人員的喜愛，然而，該技術(shù)在實(shí)施精準(zhǔn)修飾時(shí)要將DNA 雙鏈都打斷，這引發(fā)了一些人對基因組穩(wěn)定性是否會受到威脅的疑慮；另外，在精準(zhǔn)修飾時(shí)一定要添加修復(fù)“模板”，即使是只“修改”DNA 序列中的一個(gè)堿基，“模板”在發(fā)揮作用時(shí)也可能“不聽使喚”。該技術(shù)是否有進(jìn)一步升級的空間呢？美國基因組編輯技術(shù)大咖之一——哈佛大學(xué)的 David Liu（劉如謙）教授的團(tuán)隊(duì)實(shí)現(xiàn)了新突破。他們分別利用胞嘧啶脫氨基酶和腺嘌呤脫氨基酶，與人為突變后的CRISPR-dCas9（Cas9 蛋白喪失切割功能）或 CRISPR-nCas9（Cas9 蛋白只切割 DNA 的一條鏈）系統(tǒng)相結(jié)合，使 DNA 序列中的 C 轉(zhuǎn)變成 T[12]、 A 轉(zhuǎn)變成 G[13]。 堿基編輯器有如“一支帶橡皮擦的鉛筆”，將目標(biāo)位置上 C/A堿基的組成元件修改后即變成了 T/G 堿基；該過程無需切割 DNA雙鏈，也不需要修復(fù)“模板”的參與，且 效率非常高。這 種利器可以精準(zhǔn)地改變DNA序列中某個(gè)特定堿基，且 不導(dǎo)入任何的外來序列，從這點(diǎn)來說是非常安全的。要知道，在每個(gè)人的人生長河中，都可能自然產(chǎn)生成千上萬個(gè)以上的突變。此外，通過堿基編輯器，可以在一個(gè)基因中將 CAG 中的 C 改變成 T，由于 TAG 屬于基因的終止密碼子，這樣的改變使得基因的表達(dá)提前被終止了，這等同于基因敲除，但又不會導(dǎo)致雙鏈 DNA的斷裂。

堿基編輯技術(shù)問世以來被寄予了厚望，因?yàn)橐话胍陨先祟惣膊〉陌l(fā)生都是由于單個(gè)堿基突變所造成的，堿基編輯器為這些疾病的治療提供了無限想像的空間。農(nóng)業(yè)動物領(lǐng)域的很多重要經(jīng)濟(jì)性狀也是由單個(gè)堿基的變化來調(diào)控的，利用堿基編輯器改良品種性狀或研制人類疾病模型，具有巨大的應(yīng)用潛力。例如，SOCS2基因與生長發(fā)育顯著相關(guān)，科研人員利用堿基編輯技術(shù)，將綿羊該基因中的一個(gè)重要位點(diǎn)由C“修改”成 T 后，基因編輯羊生長速度明顯高于未經(jīng)編輯的羊[14]。針對兔的MSTN基因，科研人員通過堿基編輯器，將一個(gè) C“修改”成 T 后，提前產(chǎn)生了終止密碼子，與上述通過 CRISPR-Cas9 技術(shù)獲得的基因敲除豬相似，基 因編輯兔也表現(xiàn)出“雙肌”表型，但 后者僅僅是“修改”了一個(gè)堿基，沒 有切斷DNA雙鏈[15]。 中國農(nóng)業(yè)大學(xué)吳森老師課題組，利用堿基編輯器，將豬TWIST2中的一個(gè) C 轉(zhuǎn)變成 T 后，基因編輯豬表現(xiàn)出眼瞼缺損-巨口綜合征，精準(zhǔn)地模擬了該基因突變在人中所產(chǎn)生的表型[16]。另外，堿基編輯器還有一個(gè)明顯的優(yōu)勢，那就是由于其編輯的高效性，該技術(shù)可以較輕松地同時(shí)編輯多個(gè)位點(diǎn)。

4 結(jié) 語

CRISPR-Cas9 技術(shù)問世至今不到十年的時(shí)間，而堿基編輯器的發(fā)展歷程就更短；即使在這么短的時(shí)間內(nèi)，這兩種技術(shù)體系已表現(xiàn)出勢不可擋的發(fā)展態(tài)勢。誠然，任何一種新鮮事物，其在誕生的初期都會或多或少存在一些問題，對于 CRISPR-Cas9 和堿基編輯技術(shù)，目前表現(xiàn)最為突出的問題就是可能存在脫靶的情況。不過我們堅(jiān)信，隨著科研人員在基因組編輯領(lǐng)域的不斷深入探索，將不斷會有更安全、更高效的基因組編輯工具出現(xiàn)，為整個(gè)人類社會提供更出彩的服務(wù)。