微小分子RNA與慢性髓性白血病關系的研究進展

王淑嫻，王方方綜述，郁多男審校

0 引 言

微小分子RNA(microRNA，miRNA)是一群由內(nèi)源性基因編碼的，長度大約為19～24個核苷酸的非編碼單鏈小分子RNA[1]。miRNA在轉錄后水平調(diào)控多種基因表達，幾乎參與所有的生物過程，包括細胞生長、發(fā)育、增殖、分化等[2]。miRNA的表達失調(diào)會引起不同的疾病，如心血管系統(tǒng)疾病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病、腫瘤等[3-5]。慢性髓性白血病(chronic myeloid leukemia，CML)是一種由多種病因引起的骨髓造血干細胞克隆性增殖性腫瘤[6]。近年來， miRNAs與CML關系的研究相繼展開。本文主要就miRNAs與CML關系的研究進展作一綜述。

1 miRNA

原始miRNA(pri-miRNA)在核內(nèi)經(jīng)DGCR8和Drosha催化形成前體RNA(pre-miRNA)。pre-miRNA在胞質(zhì)內(nèi)由RNA酶Dicer加工處理后形成成熟的miRNA后與Argonaute2(Ago2)相互作用形成RNA誘導的沉默復合體(RNA-induced silencing complex，RISC)。miRNA通過RISC降解靶基因的mRNA和(或)抑制翻譯介導基因沉默[7]。miRNA的異常表達會引起多種疾病的發(fā)生[3-5]。在許多人類腫瘤中miRNA異常表達，如食管鱗狀細胞癌患者miR-655低表達與差預后密切相關[8]；急性髓性白血病(acute myeloid leukemia，AML)患者miR-193-3p低表達，體外研究發(fā)現(xiàn)miR-193-3p通過靶向KIT-RAS-RAF-MEK-ERK(MAPK)信號級聯(lián)及下游的細胞周期調(diào)節(jié)因子CCND1，誘導AML細胞凋亡、抑制AML細胞增殖[9]。因此， miRNA有可能作為疾病診斷、判斷療效及預后的標志物，且有可能成為潛在的治療靶點[10]。

2 CML

CML是一種常見的血液惡性腫瘤，其特征是伴有費城染色體(philadelphia chromosome，Ph)的髓系造血祖細胞的異常擴增。臨床分期為：慢性期(chronic phase，CP)、加速期(accelerated phase，AP)、急變期(blast phase，BP)[11]。酪氨酸激酶抑制劑(tyrosine kinase inhibitors，TKIs)是治療CML的一線藥物[12]。針對CML不同的臨床分期，TKIs均有一定療效，但是也存在以下問題：①由于患者BCR-ABL1激酶結構域常發(fā)生點突變，產(chǎn)生突變基因，如F317L、V299L、E255K/V、F359V/C、G250E、Y253H以及T315I等，其中T315I同時對一、二代TKIs耐藥。這些突變基因的存在使一、二代TKIs無法發(fā)揮相應作用，導致CML的進展或復發(fā)[13-15]。第三代TKI帕納替尼對所有常見的BCR-ABL1單基因突變有效，包括具有高度抗性的T315I。但BCR-ABL1等位基因中復合突變的出現(xiàn)可能會對帕納替尼出現(xiàn)抗性，尤其是包含T315I的復合突變對目前所有的TKIs顯出更高水平的抗性[16]；②CML患者需要長期TKIs治療，而TKIs幾乎均存在不良反應，如骨髓抑制[17]、QT間期延長、胸腔積液、代謝紊亂、肝衰竭等[12,18]。這些不良反應在停藥或減少劑量后可逆轉，但部分患者可能因不耐受TKIs的不良反應而完全停止治療，導致疾病進展。因此，迫切需要找到新的生物靶向分子以進一步解決TKIs耐藥和改善TKIs不良反應。

3 與CML有關的miRNAs

3.1miRNA在CML發(fā)病機制中的作用

3.1.1miR-139-5pmiR-139-5p定位于染色體11q13.4[19]，被認為是腫瘤抑制因子。在乳腺癌、結直腸癌和食管鱗狀細胞癌中，miR-139-5p能抑制腫瘤細胞的遷移、侵襲和轉移[20]。為探究miR-139-5p在血液系統(tǒng)惡性腫瘤發(fā)病機制中的作用，Choi等[21]檢測了CML患者和健康對照者的骨髓和外周血中miR-139-5p的表達情況。結果發(fā)現(xiàn)CML-CP患者miR-139-5p的表達明顯下降。進一步研究發(fā)現(xiàn)，miR-139-5p不僅是早期造血過程中調(diào)控細胞增殖的關鍵因子，且能直接靶向抑制基因Brg1表達，由于Brg1是可促進cyclin D1表達及抑制p27表達的促癌基因，所以miR-139-5P能抑制CML細胞增殖，促進CML細胞凋亡。這些研究結果提示miR-139-5p具有有效的抗白血病作用，可能成為CML治療研究的新方向。

3.1.2miR-320amiR-320a定位于8p21.3，在多種腫瘤中異常表達，如肝細胞癌、胃癌和前列腺癌[22]。在CML中，miR-320a起到抑制腫瘤的作用。Xishan等[23]通過熒光定量逆轉錄聚合酶鏈反應(quantitative reverse transcription-PCR, qRT-PCR)檢測發(fā)現(xiàn)CML細胞系KCL-22、K562、KU812和MEG01及CML患者體內(nèi)的miR-320a表達均降低。Li等[24]發(fā)現(xiàn)，BCR-ABL1基因可通過誘導PI3K-AKT-NF-κB信號通路的磷酸化導致CML的發(fā)生和進展。Xishan等[23]在K562細胞中過表達miR-320a后，BCR-ABL1表達量和PI3K、AKT和NF-κB磷酸化水平降低，K562的集落形成能力下降，體內(nèi)實驗也驗證了這一結果。將過表達miR-320a的K562細胞(RV-miR-320a)皮下注射到裸鼠體內(nèi)，35 d后取瘤對比，發(fā)現(xiàn)RV-miR-320a組腫瘤體積及瘤體Ki67+細胞數(shù)明顯低于對照組，凋亡細胞增加。體內(nèi)外實驗結果表明，miR-320a通過PI3K/AKT/NF-κB信號通路降低腫瘤細胞增殖、增加腫瘤細胞凋亡而發(fā)揮抑癌作用。為進一步分析miR-320a與臨床預后的關系，Xishan等[23]采用Kaplan-Meier法對miR-320a高表達和低表達組的生存差異進行比較分析。結果發(fā)現(xiàn)miR-320a低表達的CML患者總生存期和無復發(fā)生存期明顯短于miR-320a高表達的CML患者。以上研究結果均提示miR-320a是CML中重要的抑癌基因。

3.1.3miR-362-5pmiR-362-5p可抑制神經(jīng)母細胞瘤細胞的增殖和遷移；下調(diào)腫瘤抑制因子CYLD，在胃癌和肝細胞癌中發(fā)揮致癌作用[25]。Yang等[26]采用qRT-PCR檢測白血病細胞系中miR-362-5p的表達水平，發(fā)現(xiàn)四種白血病細胞系BV173、K562、Ball-1和Jurkat中miR-362-5p高表達，以CML細胞系(BV173和K562)的表達水平最高。進一步采集40例新鮮CML患者外周血研究miR-362-5p在CML患者體內(nèi)的表達情況，檢測結果顯示 miR-362-5p表達水平明顯高于26例健康對照者。更重要的是，經(jīng)TKIs治療獲得完全血液學反應后，8例CML患者的miR-362-5p明顯下降。這些研究結果提示miR-362-5p可能參與CML的發(fā)病。該研究還發(fā)現(xiàn)，在異種移植模型中，降低miR-362-5p水平后，GADD45α表達上調(diào)，腫瘤生長被抑制。由于miR-362-5p的靶基因GADD45α被認為是腫瘤抑制因子[27]，而miR-362-5p促癌的機制可能是CML中高表達的miR-362-5p負向調(diào)節(jié)GADD45α，促進CML發(fā)生發(fā)展[26]。所以，Yang等[26]提出用miR-362-5p抑制劑下調(diào)miR-362-5p水平，以抑制癌細胞的增殖、增強癌細胞凋亡。因此，靶向miR-362-5p有可能成為治療CML的新策略。

3.2miRNA在TKIs耐藥的CML中的作用

3.2.1miR-126miR-126在乳腺癌、胃癌和胰腺腫瘤的生物學過程中發(fā)揮重要作用[28]。miR-126在CML中的作用及其應用也是近年的研究熱點。Zhang等[29]研究發(fā)現(xiàn)，CML白血病干細胞(leukemia stem cells，LSCs)中miR-126的表達水平低于正常的長期造血干細胞，其機制可能為BCR-ABL將SPRED1磷酸化，導致抑制了介導miRNA成熟的RAN/EXP-5/RCC1復合體，導致LSCs中成熟miR-126減少。進一步通過小鼠模型發(fā)現(xiàn)，骨髓中的內(nèi)皮細胞向LSCs提供miR-126。功能學實驗發(fā)現(xiàn)，miR-126可增強LSCs靜止能力，以擺脫TKI藥物的攻擊，且miR-126還可增強白血病細胞增殖的能力。根據(jù)以上研究結果，Zhang等[29]研發(fā)了miR-126抑制性藥物CpG-miR-126 inhibitor以增強TKI對于LSCs的攻擊作用，進而降低白血病細胞的產(chǎn)生。

3.2.2miR-199a/b-5pmiR-199a-5p和miR-199b-5p是同一個miRNA家族的兩個不同的成員，具有相同的種子序列，在頭頸癌、肝細胞癌和肺癌中被鑒定為腫瘤抑制性miRNAs[30]。Chen等[30]通過使用細胞學方法與酸性水泡細胞器染色來測量自噬比率，發(fā)現(xiàn)對伊馬替尼耐藥的K562R和KU812R細胞系相對于親代細胞有更高水平的保護性自噬，使伊馬替尼療效降低。為進一步確認K562R細胞中的自噬形成，用免疫印跡測定法檢測了自噬標記，結果發(fā)現(xiàn)與K562細胞相比，K562R細胞中的LC3-II，ATG5和p62水平有所提高，而抑制自噬后，K562R細胞對伊馬替尼的敏感性增高。該實驗通過qRT-PCR發(fā)現(xiàn)，miR-199a-5p和miR-199b-5p在K562R和KU812細胞中的表達水平均較低，而過表達miR-199a/b-5p，自噬減少同時凋亡增加，增強了K562R細胞中伊馬替尼的療效，其機制可能是過表達的miR-199a/b-5p直接靶向WNT2，抑制其下游信號通路來降低自噬和增強伊馬替尼敏感性。因此，miR-199a/b-5p有可能為改善伊馬替尼耐藥提供新方法。

3.2.3miR-451miR-451家族包括人類基因組中的兩個主要成員：hsa-miR-451a和hsa-miR-451b，定位于17號染色體上，與多種腫瘤發(fā)生密切相關，如肺癌、乳腺癌和結腸癌等[31]。Alves等[32]研究發(fā)現(xiàn)與對伊馬替尼敏感的K562細胞系相比，對伊馬替尼耐藥的模型K562-RC和K562-RD細胞系中miR-451的表達顯著降低，其中K562-RD細胞的miR-451的表達水平比對伊馬替尼敏感的細胞系K562低3.8倍(P=0.0048)。CML-BP和CML-AP患者的miR-451表達較CML-CP患者下降更明顯。此外，對伊馬替尼治療敏感的CML患者miR-451表達增高，而治療效果較差的患者miR-451的表達水平較低。以上結果提示miR-451的表達水平影響著CML對TKIs的治療反應，以及對CML的不同時期進展起到一定的作用。

4 結 語

目前治療CML的首選藥物是TKIs，雖然TKIs優(yōu)于干細胞移植等其他治療方法，但仍存在很多不足，其中最主要、最棘手的是耐藥問題。miRNAs在轉錄后水平的基因表達調(diào)控中發(fā)揮著重要作用，其參與CML的發(fā)生發(fā)展，在TKIs治療過程中參與調(diào)控耐藥過程，有的miRNAs增強TKIs的抗性，有的miRNAs增強CML細胞對TKIs的敏感性。在CML中，miRNAs不僅具有作為藥物靶點和生物標志物的巨大潛力，且具有診斷和(或)治療的價值，希望將來miRNAs能成為解決TKIs耐藥問題的新方法。