山羊精液冷凍保存技術(shù)研究進(jìn)展

紀(jì)云飛

陜西省榆林市草原工作站，陜西榆林719000

我國(guó)對(duì)山羊精液冷凍保存技術(shù)的研究是從20世紀(jì)80年代開(kāi)始的，然而，到目前為止，在大多數(shù)試驗(yàn)中，山羊的凍精解凍后的活率都不能穩(wěn)定地超過(guò)50%[1]。山羊精液的冷凍保存流程主要有：精液采集、精液質(zhì)量檢查、冷凍、復(fù)蘇及復(fù)蘇后的活率檢查等環(huán)節(jié)。影響山羊精液冷凍保存效率的因素眾多，本文將從山羊精液冷凍保存的流程出發(fā)，對(duì)我國(guó)山羊精液冷凍保存技術(shù)多年來(lái)的研究進(jìn)展及影響山羊精液質(zhì)量的因素進(jìn)行小結(jié)，以期為該技術(shù)后續(xù)快速發(fā)展提供幫助。

1 山羊精液冷凍前的準(zhǔn)備

山羊精液冷凍之前需要先采集精液，然后判斷精液是否適合冷凍保存。對(duì)于適合冷凍保存的精液用一定的程序進(jìn)行冷凍保存，而不適合冷凍保存的精液則棄掉。該階段主要包括：假陰道的安裝、精液采集、精液質(zhì)量的外觀評(píng)定及精子活力鏡檢。

1.1 假陰道安裝

山羊假陰道的外殼為黑色膠皮水管，長(zhǎng)約28 cm，內(nèi)徑5.2 cm。外殼中部外有一孔，安裝氣門及注水用。內(nèi)胎為厚約1 mm 的膠皮，內(nèi)徑為5.0 cm的膠皮管。安裝時(shí)將其放進(jìn)外殼內(nèi)，再將其開(kāi)口端翻出，套在外殼口子上，用橡皮筋固定，另一端安裝集精杯，以便握在手中。將45～50 ℃的熱水從外殼上的小口注入假陰道，然后裝上氣閥，吹氣，使內(nèi)胎膨脹突出于假陰道，呈三角形或四邊形，在假陰道開(kāi)口端向內(nèi)1/3 處涂抹凡士林，手指伸入感到溫暖，有潤(rùn)滑感，有一定的壓力，此時(shí)內(nèi)胎溫度為40～42 ℃[2]。

1.2 精液采集

用手握假陰道采精時(shí)，采精員應(yīng)蹲在羊臺(tái)畜右后側(cè)，當(dāng)公羊爬跨臺(tái)畜時(shí)使假陰道與公羊陰莖伸出方向成一條直線，并將其緊靠、固定于臺(tái)畜臀部右側(cè)，用掌心托住包皮迅速將陰莖導(dǎo)入假陰道內(nèi)，切勿用手抓握陰莖。當(dāng)公羊向前俯沖后，即行射精。采精動(dòng)作力求迅速、敏捷、準(zhǔn)確，防止公羊陰莖突然彎折而受到損傷。射精時(shí)將假陰道集精杯一端向下傾斜，當(dāng)公羊跳下時(shí)，假陰道隨著陰莖后移，放掉假陰道內(nèi)的空氣，陰莖自行軟縮脫出后，即可取下假陰道。

1.3 精液質(zhì)量的外觀評(píng)定

顏色：通過(guò)肉眼辨別精液的顏色，絨山羊的精液通常為乳白色或灰白色。如果呈現(xiàn)紅色或絳紅色則說(shuō)明公羊患有炎癥，應(yīng)舍棄精液。

云霧狀：取原精液1 滴滴于載玻片上，在低倍鏡下觀察液滴的邊緣部分，精子上下翻騰滾動(dòng)如云霧狀，云霧狀越明顯，說(shuō)明密度越大，活力越好。

射精量：可將所采集的種公羊精液吸入1～2 mL 一次性注射器中，通過(guò)注射器的刻度讀出山羊射精量。

氣味：通過(guò)嗅覺(jué)辨別山羊精液氣味。正常精液略帶腥味，羊精液略有膻味，但無(wú)其他異味。

其他：精液中不應(yīng)有毛發(fā)、塵土和其他污染物。

1.4 精子活力鏡檢

取半滴原精液于載玻片上，用等溫的2～3 滴0.9%生理鹽水稀釋，蓋上蓋玻片，將稀釋好的精液置于顯微鏡下37 ℃恒溫載物臺(tái)上，在400 倍鏡下檢查至少5 個(gè)視野，估計(jì)每個(gè)視野下直線運(yùn)動(dòng)精子占總精子數(shù)的比例。統(tǒng)計(jì)5 個(gè)視野下精子的平均活力，即為精子活力。檢查合格的精液才能用于冷凍保存，一般要求精子活力在60%以上。

2 山羊精液的冷凍保存及復(fù)蘇

2.1 山羊精液的冷凍

山羊精液的冷凍保存通常有2 種方式，即顆粒冷凍和細(xì)管冷凍，實(shí)際操作中為防止微生物的污染，通常選用細(xì)管冷凍。楊素芳等[3]通過(guò)比較一步稀釋法和兩步稀釋法冷凍保存山羊精液復(fù)蘇后的效果，證實(shí)了兩步法稀釋能較好地凍存山羊精液。然而，為了生產(chǎn)中應(yīng)用的方便，目前關(guān)于山羊精液冷凍保存多采用一步稀釋法稀釋。但稀釋比例、稀釋液的種類及添加劑等各有不同，且鑒于各實(shí)驗(yàn)室的冷凍習(xí)慣、儀器設(shè)備的良莠不齊，所使用的冷凍程序等也各有不同。

張圣朝[2]用精液∶稀釋液=1∶3 的比例，選出最適用于阿爾巴斯白絨山羊凍精稀釋液的配方：Tris 3.028 5 g，檸檬酸1.659 3 g，果糖0.75 g，蔗糖2.567 3 g，青、鏈霉素各10 萬(wàn)單位，雙蒸水100 mL，pH 值6.6。最佳的卵黃含量為25%，最佳的甘油含量為6%。采用此配方冷凍阿爾巴斯絨山羊精液后精子活力能夠達(dá)到33%。向該稀釋液中添加海藻多糖、谷氨酸、Vc等添加劑后能夠明顯提高精液的質(zhì)膜完整率及頂體完整率，然而活力甚至達(dá)不到基礎(chǔ)液的活力。席利萌[4]通過(guò)對(duì)奶山羊精液的冷凍保存研究，結(jié)果證實(shí)了3%的乙二醇和6%的甘油均可作為冷凍保護(hù)劑對(duì)山羊精液冷凍具有明顯的促進(jìn)作用，添加紅景天多糖后可明顯改善山羊精液冷凍后的活力。柴局[5]通過(guò)對(duì)內(nèi)蒙古絨山羊精液冷凍保存的研究，證實(shí)了Tris 3.07 g、檸檬酸1.64 g、葡萄糖0.5 g、果糖0.66 g，卵黃5%作為冷凍稀釋液冷凍山羊精液能夠達(dá)到最優(yōu)效果，復(fù)蘇后精子活力達(dá)到了41.2%，添加62.5 mmol/L 海藻糖后其活力能夠達(dá)到44%，添加5 mmol/L L-谷氨酸后其活力能夠達(dá)到48%。徐振軍等[6]用葡萄糖3 g、檸檬酸3 g 及100 mL 去離子水制成基礎(chǔ)液，按照基礎(chǔ)液40 mL，各加入10 mL 新鮮卵黃，青霉素、鏈霉素各50 000 IU，搖勻后再分別取上液94 mL，加甘油6 mL 制成冷凍稀釋液，對(duì)山羊精液冷凍后其活力能夠達(dá)到50%以上。

目前認(rèn)為卵黃中含有一些物質(zhì)能與精清中的蛋白質(zhì)結(jié)合而對(duì)精子起毒副作用，孟克格日樂(lè)等[7]通過(guò)不同的離心方法離心精液去除精漿，證實(shí)了750 r/min 離心1 次后凍存的精子在復(fù)蘇后其活力、質(zhì)膜完整率、線粒體活性等明顯高于1 500 r/min 組，提示山羊精液對(duì)離心的耐受率在低轉(zhuǎn)速下較高。薛健等[8]的研究也證實(shí)了去除部分精漿有助于提高山羊精液冷凍后的活力及受胎率，完全去除精漿后精子活力反而不高，可能是精子微環(huán)境發(fā)生巨大改變而產(chǎn)生不適應(yīng)的后果。

2.2 山羊精液冷凍后的復(fù)蘇

目前各家對(duì)于山羊精液的解凍方法不盡相同，尚未形成公認(rèn)的結(jié)論。常用的山羊冷凍精液解凍方法是從液氮中取出冷凍細(xì)管，立即放入39 ℃水浴或者55 ℃水浴中解凍，然后進(jìn)行各指標(biāo)的檢查。陳倩等[9]通過(guò)對(duì)不同解凍方法進(jìn)行篩選，發(fā)現(xiàn)采用70℃4 s 解凍法比37 ℃12 s、39 ℃8 s 這2 種解凍法解凍后精子的活力明顯要高些，證實(shí)了70 ℃4 s 的解凍方法能有效緩解解凍對(duì)精子的損傷，對(duì)保持精子的正常形態(tài)和活力較為有利，是絨山羊細(xì)管凍精適宜的解凍方法。然而也有學(xué)者認(rèn)為山羊精液的理想解凍溫度是40～50 ℃，溫度越高，則解凍后精液質(zhì)量越差[3]。

3 影響山羊精液冷凍保存效率的因素

影響山羊精液冷凍保存效率的因素總的來(lái)講可以分為2 個(gè)方面，即山羊精液自身對(duì)冷凍的耐受性和冷凍前山羊精液的質(zhì)量。一般來(lái)說(shuō)，山羊個(gè)體對(duì)于精液冷凍的適應(yīng)性有明顯差異，胡潤(rùn)環(huán)[10]對(duì)阿爾巴斯絨山羊精液冷凍的研究結(jié)果，揭示了不同個(gè)體的絨山羊精液冷凍后精子活力差異顯著，這可能與個(gè)體內(nèi)耐凍基因的差異有關(guān)[11]。

冷凍前山羊精液的質(zhì)量與冷凍后精液質(zhì)量關(guān)系密切，通常冷凍前精液質(zhì)量越高，冷凍后精液的質(zhì)量也越高。因此，要想獲得理想的冷凍效果，冷凍前山羊精液的質(zhì)量亦需要高。李碧波等[12]研究發(fā)現(xiàn)日糧能量水平對(duì)試驗(yàn)公羊的血清睪酮水平和有效精子數(shù)影響極顯著，對(duì)射精量和精子密度影響顯著。在12.08 MJ/d 的日糧能量水平下，山羊的射精量、精子密度和有效精子數(shù)均達(dá)到最佳。閆治川等[13]通過(guò)補(bǔ)硒試驗(yàn)證實(shí)給山羊公羊注射亞硒酸鈉維生素E 注射液后，血清硒水平迅速上升，第20 天達(dá)到最高峰。公羊血清T 和FSH 濃度顯著高于對(duì)照組，精子活力明顯升高，從而證實(shí)了硒元素對(duì)于公羊精液質(zhì)量的重要性。

由此可見(jiàn)，影響山羊精液質(zhì)量的因素眾多，只有對(duì)遺傳水平與營(yíng)養(yǎng)水平進(jìn)行聯(lián)合把控才能夠較好地調(diào)控山羊精液質(zhì)量，從而使其更適合于冷凍保存。

4 山羊精液冷凍保存技術(shù)的發(fā)展前景

鑒于目前山羊精液冷凍保存的效率參差不齊，各家所用冷凍方法具有較大差別，但大多集中于冷凍保護(hù)劑及添加劑的篩選方面。隨著對(duì)精液冷凍保存過(guò)程的認(rèn)識(shí)不斷加強(qiáng)及精液冷凍保存技術(shù)的不斷進(jìn)步，我們相信，一定能夠篩選到一種適合于山羊精液冷凍保存的稀釋液配方及與之相匹配的冷凍、復(fù)蘇程序，使得山羊精液的冷凍保存技術(shù)成為一種成熟的、程序化的常規(guī)工作，為我國(guó)羊養(yǎng)殖業(yè)的持續(xù)提升提供助力，促進(jìn)國(guó)民經(jīng)濟(jì)健康發(fā)展。