百草枯中毒致肺纖維化臨床治療及分子機(jī)制研究進(jìn)展

李辭茹綜述，聶時(shí)南審校

0 引 言

百草枯中毒造成機(jī)體損傷的分子機(jī)制尚無完全明確，目前認(rèn)為主要參與體內(nèi)細(xì)胞氧化還原反應(yīng)，形成大量活性氧自由基(reactive oxygen species,ROS)及過氧化物離子，引起組織細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化，導(dǎo)致多器官功能不全或死亡[1-2]。因肺組織對(duì)百草枯的主動(dòng)攝取和蓄積特性，靶器官為肺，嚴(yán)重?fù)p傷肺泡上皮細(xì)胞，從而肺表面活性物質(zhì)生成減少，患者逐漸出現(xiàn)不可逆性肺纖維化和呼吸衰竭，最終死于頑固性低氧血癥。此外，百草枯已被證明會(huì)使炎癥反應(yīng)基因表達(dá)水平升高，如白細(xì)胞介素(interleukin，IL)-1、IL-6、IL-8，腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor，TNF)TNF-α、TNF-β，干擾素(interferon，IF)-1，轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(transforming growth factor，TGF)TGF-β和核因子(nuclear factor,NF)-κβ，同時(shí)促炎因子又可以誘導(dǎo)ROS形成[3-5]。

目前百草枯中毒沒有針對(duì)性的解毒劑，通常采取綜合治療，例如通過洗胃和血液凈化來減少毒物吸收，給予糖皮質(zhì)激素和免疫抑制劑等治療以減輕肺損傷和晚期的纖維化，同時(shí)給予對(duì)癥支持治療。然而，這些治療手段均不是特異性的有效治療策略且有一定的不良反應(yīng)。因而探尋百草枯中毒所致肺纖維化的早期治療和分子機(jī)制研究對(duì)尋找新的治療手段和方法，以期幫助改善患者預(yù)后、降低死亡率，是臨床迫切需要解決的問題[6- 7]。

1 百草枯中毒致肺纖維化臨床治療研究

近年來，臨床醫(yī)師為了治療百草枯中毒患者的肺纖維化，采用了血液凈化技術(shù)及多種藥物并進(jìn)行了相關(guān)的研究，主要有以下幾種：

1.1 血液凈化治療血液凈化技術(shù)根據(jù)治療時(shí)間分為連續(xù)血液凈化和常規(guī)的間斷血液凈化，包括血液透析、血液濾過、血液透析濾過、血液灌流、血漿置換及免疫吸附等。田英平等[8]回顧性分析了113例急性百草枯中毒患者病歷資料，就血液凈化治療方面篩選出57例患者(洗胃時(shí)間與服毒量無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異)，其中33例患者在中毒8h內(nèi)行血液灌流(hemoperfusion，HP)聯(lián)合血液透析治療， 1次/d，2～4 h/次，連續(xù)5 d，存活例數(shù)為22例；另外24例患者在中毒24 h行血液灌流+血液透析治療，存活例數(shù)僅為3例。表明血液凈化的時(shí)機(jī)是很重要的，而且盡早應(yīng)用血液凈化效果越好。黃昌保等[9]進(jìn)行了一項(xiàng)前瞻性單中心隨機(jī)對(duì)照研究，納入119例急性百草枯中毒患者，分成連續(xù)性靜脈-靜脈血液凈化 (continuous veno-venous blood purification，CVVH)治療組和常規(guī)治療組，發(fā)現(xiàn)CVVH組患者腎損傷、低氧血癥及多器官功能衰竭發(fā)生率較常規(guī)組低，以及CVVH組行CVVH次數(shù)和時(shí)間長(zhǎng)短與急性百草枯中毒患者預(yù)后無明顯線性關(guān)系。Koo等[10]評(píng)估了預(yù)防性CVVH對(duì)急性百草枯中毒患者的療效，納入80例中毒患者，中毒24 h內(nèi)行HP治療，繼而分為HP組和HP-CVVH組，最后發(fā)現(xiàn)HP后的預(yù)防性CVVH可以預(yù)防百草枯中毒患者循環(huán)衰竭導(dǎo)致的早期死亡并延長(zhǎng)生存時(shí)間，但不能預(yù)防呼吸衰竭引起的晚期死亡。蘭超等[11]綜合評(píng)價(jià)了血液灌流聯(lián)合CVVH治療急性百草枯中毒患者的療效，納入21篇文獻(xiàn)，包括隨機(jī)對(duì)照臨床試驗(yàn)、隊(duì)列研究及病例分析等，最后發(fā)現(xiàn)血液灌流聯(lián)合CVVH較單獨(dú)血液灌流治療百草枯中毒，可以明顯延長(zhǎng)患者生存時(shí)間，降低急性呼吸窘迫綜征及多器官功能衰竭發(fā)生率。

1.2 抗氧化劑Schapochnik等[12]發(fā)現(xiàn)維生素D能減少百草枯中毒致肺纖維化小鼠支氣管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid，BALF)中的白細(xì)胞數(shù)量，降低百草枯中毒小鼠纖維化肺組織中IL-6、IL-17、TGF-β和基質(zhì)釋放金屬蛋白酶-9(matrix releasing metalloproteinase-9，MMP-9)水平以及減輕膠原沉積。表明維生素D能減弱促炎因子白介素分泌、TGF-β促纖維化，減少膠原沉積和MMP-9，二者能破壞動(dòng)物的肺組織結(jié)構(gòu)。同時(shí)，使用維生素D治療后，BALF中的resolvin D水平升高，促進(jìn)炎癥消退和組織修復(fù)，而且降低了氣道高反應(yīng)性[13]。提示維生素D治療百草枯中毒致肺纖維化有潛在療效，但還有待臨床研究進(jìn)一步證實(shí)[14]。另外，N-乙酰半胱氨酸(N-acetylcysteine，NAC)是一種常用的抗氧化劑，NAC在細(xì)胞內(nèi)脫去N-乙酰基，形成L-半胱氨酸，參與合成谷胱甘肽，發(fā)揮抗氧化作用。體外實(shí)驗(yàn)表明，予PQ染毒大鼠NAC治療，顯微鏡下觀察凋亡細(xì)胞，NAC治療組較PQ組肺組織細(xì)胞凋亡率明顯下降，表明NAC抑制PQ中毒大鼠肺組織細(xì)胞凋亡[15-16]。目前尚無NAC用于PQ中毒致肺纖維化的臨床報(bào)道。

1.3 糖皮質(zhì)激素及免疫抑制劑糖皮質(zhì)激素及環(huán)磷酰胺具有強(qiáng)大的免疫抑制作用，是臨床上使用最為廣泛而有效的抗炎和免疫抑制劑。Gao等[17]發(fā)現(xiàn)沖擊療法聯(lián)合長(zhǎng)期低劑量環(huán)磷酰胺(cyclophosphamide，CTX)治療會(huì)減輕大鼠肺損傷，百草枯中毒小鼠肺組織病理改變中，沖擊療法聯(lián)合長(zhǎng)期低劑量CTX組與沖擊療法組、百草枯組相比，其肺泡間隔炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)程度和肺泡壁厚度明顯減少[18]。王文生等[19]進(jìn)行了一項(xiàng)回顧性分析，納入PQ中毒患者55例，分為大劑量甲潑尼龍聯(lián)合環(huán)磷酰胺組、常規(guī)治療組，比較兩組患者I型呼吸衰竭、低氧血癥、急性呼吸窘迫綜合征(acute respiratory distress syndrome，ARDS)、機(jī)械通氣的發(fā)生例數(shù)，以及胸部影像學(xué)表現(xiàn)，發(fā)現(xiàn)免疫抑制劑治療組發(fā)生低氧血癥、ARDS及機(jī)械通氣的例數(shù)，以及入院后發(fā)生多器官功能衰竭例數(shù)低于常規(guī)治療組，胸部影像學(xué)表現(xiàn)前者較后者肺部磨玻璃陰影、纖維條索等減少，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明大劑量甲潑尼龍聯(lián)合環(huán)磷酰胺治療PQ中毒有一定療效，但具體使用時(shí)間和劑量等還有待大樣本臨床研究進(jìn)一步證實(shí)。

另外，有研究人員綜合評(píng)價(jià)了免疫抑制劑對(duì)PQ中毒患者M(jìn)ODS發(fā)生率的影響，排除后納入3項(xiàng)隨機(jī)對(duì)照試驗(yàn)、5項(xiàng)非隨機(jī)對(duì)照試驗(yàn)和2項(xiàng)前瞻性研究，發(fā)現(xiàn)免疫抑制劑組PQ中毒患者M(jìn)ODS發(fā)生率較對(duì)照組低，提示使用免疫抑制劑治療可以降低PQ中毒患者M(jìn)ODS發(fā)生率。另外還發(fā)現(xiàn)，在使用環(huán)磷酰胺劑量為15 mg/(kg·d)及糖皮質(zhì)激素或環(huán)磷酰胺使用時(shí)間為2d時(shí)，百草枯中毒患者病死率明顯降低，有待進(jìn)一步大規(guī)模臨床研究證實(shí)，值得關(guān)注的是，該發(fā)現(xiàn)與急性百草枯診治專家共識(shí)(2013)有共同之處，同時(shí)有一定進(jìn)展[20-21]。

1.4 中藥治療Chen等[22]發(fā)現(xiàn)雷公藤內(nèi)酯醇(triptolide,TPL)，一種中藥提取物，通過抑制肺上皮細(xì)胞的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)發(fā)揮抗肺纖維化作用。體外實(shí)驗(yàn)表明，百草枯組纖維細(xì)胞標(biāo)記物波形蛋白發(fā)生上調(diào)，上皮細(xì)胞標(biāo)記物E鈣粘素(E-cadherin，E-cad)下調(diào)。然而，由百草枯引起的這些變化可以被TPL逆轉(zhuǎn)，雷公藤內(nèi)酯醇直接與TGF-β結(jié)合，隨后增加E-cadherin的表達(dá)并降低體內(nèi)薄荷素表達(dá)。在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，TPL改善了小鼠的存活狀態(tài)并抑制了肺纖維化。表明TPL對(duì)PQ中毒致肺纖維化有潛在治療作用[23-24]。目前尚無雷公藤應(yīng)用于PQ中毒致肺纖維化的臨床研究。Shen等[25]建立PQ中毒小鼠模型，分為高劑量氯喹組、對(duì)照組，體內(nèi)實(shí)驗(yàn)表明，高劑量氯喹組中發(fā)現(xiàn)氯喹顯著減輕百草枯誘導(dǎo)的肺損傷。百草枯誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)被氯喹抑制，如白細(xì)胞數(shù)量減少，TNF-α、IL-1β和IL-6水平降低。支氣管肺泡灌洗液中，一氧化氮含量降低，肺內(nèi)一氧化氮合酶表達(dá)下調(diào)。此外，氯喹治療組抗氧化酶SOD活性增強(qiáng)，肺組織中過氧化物丙二醛的水平下降。同時(shí)，抗氧化蛋白(nuclear factor erythroid-2 related factor 2，Nrf2)的表達(dá)也上調(diào)。馬松染色的結(jié)果表明，氯喹顯著減輕了百草枯誘導(dǎo)的肺纖維化。免疫組織化學(xué)染色顯示，促纖維化蛋白TGF-β和α-SMA的表達(dá)下調(diào)。表明氯喹有效地抑制了百草枯誘導(dǎo)的小鼠肺損傷[26]。但目前尚無臨床研究證明氯喹治療PQ中毒致肺纖維化的作用。

1.5 其 他He等[27]系統(tǒng)評(píng)價(jià)并分析了11項(xiàng)間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells，MSC)治療百草枯中毒動(dòng)物模型臨床前研究，綜合生存率、肺干重/濕重、纖維化評(píng)分、氧化應(yīng)激反應(yīng)、炎癥反應(yīng)，來評(píng)估 MSC治療療效。其中大多數(shù)表示，MSC治療可提高生存率并降低肺濕/干重、減輕組織病理學(xué)纖維化改變。MSC組在急性期后7和14 d，血丙二醛水平下降，同時(shí)血超氧化物歧化酶和谷胱甘肽水平升高；血液或肺組織中的IL-1β，TNF-α和TGF-β1水平均有不同程度降低。提示MSCs對(duì)PQ中毒致肺損傷小鼠有減輕肺纖維化作用，可能與減少氧化應(yīng)激和炎性細(xì)胞因子水平有關(guān)。表明MSC在PQ中毒方面有潛在治療作用，并有助于增加臨床研究的基本原理。

2 百草枯中毒致肺纖維化分子機(jī)制研究進(jìn)展

由于目前治療措施的乏善可陳，故而對(duì)百草枯中毒所致的肺纖維化的分子機(jī)制的研究，也一直是百草枯中毒基礎(chǔ)研究的熱點(diǎn)，近年來的研究主要包括以下幾個(gè)方面：

2.1 Wnt/β-catenin信號(hào)通路研究表明，β-連環(huán)蛋白(β-catenin)是Wnt通路的關(guān)鍵分子，MMP蛋白是肺纖維化的標(biāo)記物之一。黃晶等[28]通過建立百草枯誘導(dǎo)大鼠肺纖維化模型，發(fā)現(xiàn)應(yīng)用蛋白芯片技術(shù)檢測(cè)百草枯中毒組大鼠肺組織中蛋白表達(dá)水平及細(xì)胞因子水平，結(jié)果顯示：百草枯肺損傷大鼠肺組織內(nèi) IL-1β、β-catenin、TGF-β1 和MMP-2等細(xì)胞因子表達(dá)水平顯著升高。初步證實(shí)百草枯中毒后Wnt 信號(hào)通路被激活。Western-blot結(jié)果顯示：與對(duì)照組比較，百草枯組β-catenin、MMP表達(dá)水平升高，抑制劑組降低，與百草枯組比較，抑制劑組β-catenin、MMP 表達(dá)水平降低。結(jié)合百草枯大鼠肺組織大體標(biāo)本、蘇木精-伊紅染色及馬松染色結(jié)果提示:與百草枯中毒組相比，抑制劑組肺組織質(zhì)地軟、更紅潤(rùn)，結(jié)構(gòu)破壞較少，膠原蛋白沉積減少，肺泡間質(zhì)纖維化程度降低，證實(shí)抑制Wnt 信號(hào)通路可以減輕百草枯誘導(dǎo)的肺纖維化[29]。

2.2 肺上皮細(xì)胞的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)EMT是指上皮細(xì)胞通過特定程序轉(zhuǎn)化為具有間質(zhì)表型細(xì)胞，這種轉(zhuǎn)變賦予上皮細(xì)胞侵襲性，在組織重塑、腫瘤轉(zhuǎn)移、肺纖維化中發(fā)生EMT的細(xì)胞失去了E-鈣粘蛋白和上皮細(xì)胞連接組成部分，細(xì)胞產(chǎn)生間充質(zhì)細(xì)胞骨架且具備運(yùn)動(dòng)性和侵入性[30-31]。Chen等[32]發(fā)現(xiàn)PQ中毒肺纖維化小鼠伴有EMT發(fā)生。TPL減輕了百草枯誘導(dǎo)的小鼠肺纖維化，表現(xiàn)為小鼠肺泡組織和人正常肺上皮細(xì)胞中EMT表型表達(dá)水平降低。進(jìn)一步驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)TPL結(jié)合TGF-β1并抑制后者下游轉(zhuǎn)導(dǎo)的SMAD信號(hào)通路，表明百草枯通過激活TGF-β1誘發(fā)了EMT，并隨后導(dǎo)致肺纖維化。

2.3 NF-κB信號(hào)通路Yang等[33]發(fā)現(xiàn)敲除Angptl2能抑制NF-κB信號(hào)途徑介導(dǎo)的炎癥、氧化應(yīng)激和纖維化過程，減輕百草枯誘導(dǎo)的小鼠肺損傷。組織學(xué)改變證明，Angptl2缺失能抑制百草枯誘導(dǎo)的肺損傷，可能與抑制NF-κB信號(hào)途徑從而減輕炎癥，氧化應(yīng)激和纖維化有關(guān)。提高NF-κB信號(hào)途徑活性可以減弱Angptl2缺失的作用，表明Angptl2調(diào)節(jié)百草枯誘導(dǎo)的肺損傷依賴于NF-κB信號(hào)通路的激活。在百草枯處理的細(xì)胞中，敲除Angptl2能減輕氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)及TGF-β1表達(dá)降低，然而，使用抑制劑阻斷NF-κB信號(hào)通路活化會(huì)得到相反的結(jié)果。由于炎癥反應(yīng)與氧化應(yīng)激之間可能存在循環(huán)關(guān)系，還有待進(jìn)一步研究以深入揭示Angptl2調(diào)節(jié)PQ中毒致肺損傷發(fā)生發(fā)展的潛在機(jī)制。

2.4 Akt-Nrf-2信號(hào)通路Li等[34]發(fā)現(xiàn)，二萜銀杏內(nèi)酯葡甲胺注射液(diterpenoid ginkgolide meglumine,DGMI)可以減輕百草枯誘導(dǎo)的大鼠肺纖維化，結(jié)果顯示DGMI的給藥能增加百草枯組大鼠的存活率。和百草枯組相比，DGMI組大鼠肺組織中丙二醛、IL-1β、IL-6、TNF-α水平降低及SOD水平升高。蘇木精-伊紅染色和馬松染色顯示DGMI減輕組織學(xué)損傷，免疫組織化學(xué)染色顯示DGIM組較PQ組肺組織中Akt、Nrf-2表達(dá)增加，提示DGMI改善肺損傷及纖維化可能與其激活A(yù)kt-Nrf-2通路有關(guān)，具體分子機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

3 結(jié) 語

綜上所述，隨著對(duì)百草枯中毒致肺纖維化分子機(jī)制深入研究，目前其發(fā)病機(jī)制研究雖然已取得部分進(jìn)展，但具體潛在分子機(jī)制還未完全闡明。對(duì)于百草枯中毒的早期臨床治療，目前出現(xiàn)了一些治療方案，對(duì)改善百草枯中毒患者預(yù)后有一定療效，但特效且針對(duì)性的治療還未發(fā)現(xiàn)，仍在前期探尋階段。透徹認(rèn)識(shí)百草枯中毒所致肺纖維化的發(fā)病機(jī)制，并針對(duì)性指導(dǎo)早期臨床治療，還需要基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)科研人員及醫(yī)學(xué)工作者們共同深入探索。