恥垢分枝桿菌新型毒素-抗毒素系統(tǒng)MSMEG_3435-3436基因功能的初步研究

張藍(lán)月 耿藝漫 賈紅彥 肖婧 李自慧 潘麗萍 孫義成 張宗德

毒素-抗毒素(toxin-antitoxin，TA)系統(tǒng)是廣泛存在于細(xì)菌和古細(xì)菌等原核生物基因組中的一類小型功能性基因元件，在細(xì)菌持留性[1-2]、調(diào)節(jié)生物膜動(dòng)力學(xué)和適應(yīng)環(huán)境刺激[3-5]等多個(gè)方面發(fā)揮著重要作用。典型的毒素-抗毒素系統(tǒng)由不穩(wěn)定的抗毒素和穩(wěn)定的毒素組成，活性狀態(tài)下的毒素可抑制細(xì)菌生長(zhǎng)或介導(dǎo)細(xì)菌程序性死亡，從而殺滅細(xì)菌，而抗毒素則抑制該過程從而達(dá)到動(dòng)態(tài)平衡。

分枝桿菌屬中毒素-抗毒素系統(tǒng)的種類和數(shù)量存在很大差異。如結(jié)核分枝桿菌包含至少93個(gè)毒素-抗毒素系統(tǒng)[6]；麻風(fēng)分枝桿菌僅含有毒素假基因；而被用于研究結(jié)核分枝桿菌未知基因功能模式菌株的無致病性且代時(shí)短的恥垢分枝桿菌中[7]，目前僅驗(yàn)證了4個(gè)有功能的毒素-抗毒素系統(tǒng)[分別為MSMEG_1277-1278(Phd/Doc)、MSMEG_4447-4448(MazEF)、MSMEG_1283-1284(vapBC)和MSMEG_5635-5634][8-10]，1個(gè)不包括毒素的抗毒素-伴侶蛋白(antitoxin-chaperone, AC)和2個(gè)預(yù)測(cè)的未驗(yàn)證過功能的毒素-抗毒素系統(tǒng)(MSMEG_3435-3436、MSMEG_6762-6760)[3, 6]。因此，為了解毒素-抗毒素系統(tǒng)與分枝桿菌耐受和持留的關(guān)系[11]，本研究通過構(gòu)建恥垢分枝桿菌2個(gè)預(yù)測(cè)毒素-抗毒素系統(tǒng)過表達(dá)體系及敲除菌株探究其功能，為進(jìn)一步研究結(jié)核分枝桿菌毒素-抗毒素系統(tǒng)的功能提供分子工具和線索。

材料和方法

一、材料來源

用于本研究的菌株和質(zhì)粒見表1，引物見表2。

二、主要試劑和儀器

溶菌肉湯(lysogeny broth，LB)培養(yǎng)基，米氏肉湯分枝桿菌培養(yǎng)基(Middlebrook 7H9液體培養(yǎng)基)或7H10固體培養(yǎng)基(美國(guó)BD公司)；BamHⅠ、HindⅢ等限制性內(nèi)切酶及T4連接酶(美國(guó)NEB公司)；PCR產(chǎn)物純化試劑盒、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒、質(zhì)粒小提試劑盒(德國(guó)Qiagen公司)；電穿孔儀(美國(guó)Bio-Rad 公司)；crRNA由北京睿博興科生物技術(shù)有限公司合成?？股丶捌湎鄳?yīng)終濃度：卡那霉素(Km)25 μg/ml；潮霉素(Hyg) 50 μg/ml；脫水四環(huán)素鹽酸鹽(ATc) 100 ng/ml；5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷(X-gal) 20 mg/ml。

表1 用于本研究的菌株和質(zhì)粒的特點(diǎn)與來源

表2 用于本研究的引物及其序列

續(xù)表2

三、研究方法

1.毒素-抗毒素系統(tǒng)基因的克隆表達(dá)及功能檢測(cè)：分別將毒素基因MSMEG_3436、MSMEG_6760和毒素-抗毒素基因?qū)SMEG_3435-3436、MSMEG_6762-6760進(jìn)行PCR擴(kuò)增，再將PCR片段克隆入由誘導(dǎo)劑(ATc)誘導(dǎo)的pYC601載體啟動(dòng)子下游，經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證共構(gòu)建5個(gè)克隆(即pYC601-con、pYC601-Ms_3436、pYC601-Ms_6760、pYC601-Ms_3435-3436、pYC601-Ms_6762-6760)。將5個(gè)克隆分別電轉(zhuǎn)至恥垢分枝桿菌中，以pYC601-con空載體為對(duì)照，通過在7H9液體培養(yǎng)基中添加ATc以誘導(dǎo)基因表達(dá)并檢測(cè)其功能。具體操作為：挑取單克隆搖至細(xì)菌的生長(zhǎng)狀態(tài)穩(wěn)定期，再經(jīng)1∶100轉(zhuǎn)接2次使菌株?duì)顟B(tài)一致。將溶液在600 nm波長(zhǎng)處的吸光度值(A600)≈1.0的菌液分別轉(zhuǎn)接到100 ml含ATc (100 ng/ml)和不含ATc的7H9液體培養(yǎng)基培養(yǎng)中，使初始A600≈0.02，然后在36 h內(nèi)每間隔4 h測(cè)1次A600值，再以吸光度值為縱坐標(biāo)、時(shí)間為橫坐標(biāo)繪制生長(zhǎng)曲線。為使實(shí)驗(yàn)達(dá)到較好的平行性，該實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次，取其中1次的數(shù)據(jù)做圖。

2.敲除菌株生存能力鑒定及抗生素脅迫：應(yīng)用CRISPR-Cas12a基因編輯技術(shù)構(gòu)建敲除菌株[15]。根據(jù)靶標(biāo)基因(MSMEG_3435-3436、MSMEG_6762-6760)設(shè)計(jì)靶標(biāo)序列crRNA并連接到pCR-Hyg質(zhì)粒載體上。以恥垢分枝桿菌野生型MC2155基因組DNA為模板，PCR擴(kuò)增上下游同源臂，應(yīng)用吉爾伯森克隆技術(shù)(Gibson Assembly法)連接到pUC19-Amp質(zhì)粒載體上，并以此為模板將PCR擴(kuò)增出來的上下游同源臂(≈1 kb)作為雙鏈DNA模板。將crRNA(100 ng)和同源臂片段(700 ng)同時(shí)電轉(zhuǎn)至SY3807感受態(tài)細(xì)胞中，30 ℃倒置培養(yǎng)3～4 d 后挑取單克隆測(cè)序驗(yàn)證。驗(yàn)證成功的突變菌株接種至7H9液體培養(yǎng)基中，1∶100轉(zhuǎn)接2次后采用紫外分光光度計(jì)測(cè)A600，繪制野生株、各個(gè)突變菌株(ΔMSMEG_3435-3436、ΔMSMEG_6762-6760)的生長(zhǎng)曲線。將異煙肼和利福平分別加到20 ml野生株和ΔMSMEG_3435-3436突變株的指數(shù)中期(A600≈0.3)培養(yǎng)液中，使終濃度分別為96 μg/ml和40 μg/ml。分別在加藥后即刻及加藥后24 h取樣，將每個(gè)樣品用不含抗生素的7H9洗兩遍后，再用7H9液體培養(yǎng)基進(jìn)行10倍梯度稀釋至106倍，37 ℃倒置培養(yǎng)60 h后觀察菌株的生長(zhǎng)狀況(菌落形成單位，CFU)并計(jì)算存活率[存活率(%)=處理24 h的CFU/處理前的CFU×100%]。再以存活率為縱坐標(biāo)，抗生素名稱為橫坐標(biāo)，繪制柱狀圖。為使實(shí)驗(yàn)達(dá)到較好的平行性，該實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次，取其中1次的數(shù)據(jù)做圖。

3.LacZ報(bào)告基因的整合及啟動(dòng)子活性檢測(cè)：根據(jù)文獻(xiàn)[8-10]及本課題前期實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)的恥垢分枝桿菌中1對(duì)新的有功能的毒素-抗毒素系統(tǒng)，共計(jì)選擇5對(duì)有功能的毒素-抗毒素系統(tǒng)(MSMEG_1277-1278、MSMEG_1283-1284、MSMEG_3435-3436、MSMEG_4447-4448、MSMEG_5635-5634)來驗(yàn)證毒素-抗毒素系統(tǒng)的自調(diào)控功能。PCR擴(kuò)增含上游同源臂+LacZ+hyg+下游同源臂的片段(≈6 kb)，電擊轉(zhuǎn)化該載體片段(700 ng)到SY3126(含pJV53-gfp)感受態(tài)細(xì)胞中，復(fù)蘇后涂到含40 μl X-gal(20 mg/ml)的hyg+kana抗性的7H10固體培養(yǎng)基上，3～4 d后挑選藍(lán)色菌落并測(cè)序驗(yàn)證。同時(shí)，采用同源重組的方法構(gòu)建5個(gè)突變菌株(即SY3328、SY3309、SY6407、SY3310、SY3311)[14]，并將PCR擴(kuò)增的5對(duì)毒素-抗毒素系統(tǒng)的抗毒素基因(即MSMEG_1277、MSMEG_1283、MSMEG_3435、MSMEG_4447、MSMEG_5635)的開放閱讀框(ORF)和基因上游約500 bp(包含啟動(dòng)子)的堿基序列克隆入pMV261，以構(gòu)建高表達(dá)抗毒素基因的穿梭質(zhì)粒載體，將pMV261-con和pMV261-MSMEG_1277分別電轉(zhuǎn)至SY3328突變菌株中(另外4個(gè)突變菌株用同樣的方式驗(yàn)證)。當(dāng)A600≈1.0時(shí)，采用紫外分光光度計(jì)測(cè)定A550和A420，計(jì)算β-半乳糖苷酶活性[酶活性單位為“Miller單位(MU)”][β-半乳糖苷酶活性=1000×(A420-1.75×A550)/反應(yīng)時(shí)間(min)×A600×菌量(ml)][16]。以β-半乳糖苷酶活性為縱坐標(biāo)，突變菌株名稱為橫坐標(biāo)，繪制柱狀圖。為使實(shí)驗(yàn)達(dá)到較好的平行性，該實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次，取其中1次的數(shù)據(jù)做圖。

四、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

一、恥垢分枝桿菌中毒素-抗毒素系統(tǒng)的鑒定及功能檢測(cè)

恥垢分枝桿菌中MSMEG_3435-3436、MSMEG_6762-6760基因排列見圖1。與電轉(zhuǎn)空載體pYC601對(duì)照組菌株相比，無ATc誘導(dǎo)時(shí)，表達(dá)MSMEG_3436和MSMEG_3435-3436、MSMEG_6760和MSMEG_6762-6760的菌株均可正常生長(zhǎng)(圖2，4)；而有ATc誘導(dǎo)時(shí)，表達(dá)MSMEG_3436的菌株幾乎沒有生長(zhǎng)，表現(xiàn)出明顯的抑菌作用，但表達(dá)MSMEG_3435-3436的菌株可正常生長(zhǎng)(圖3)，而誘導(dǎo)表達(dá)MSMEG_6760和MSMEG_6762-6760的菌株均未可正常生長(zhǎng)(圖5)。

二、敲除菌株生存能力鑒定及抗生素脅迫

crRNA序列見表2。經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳和測(cè)序結(jié)果顯示，成功獲得ΔMSMEG_3435-3436、ΔMSMEG_6762-6760基因敲除突變菌株，瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證見圖6，驗(yàn)證引物及刪除片段大小見圖注。與野生株相比，ΔMSMEG_3435-3436、ΔMSMEG_6762-6760突變菌株的生長(zhǎng)表型均無明顯差異(圖7)。經(jīng)驗(yàn)證ΔMSMEG_6762-6760是一對(duì)無功能的毒素-抗毒素系統(tǒng)，故未檢測(cè)其與藥物間耐藥的相關(guān)性，僅對(duì)ΔMSMEG_3435-3436突變菌株與異煙肼和利福平耐藥的相關(guān)性進(jìn)行驗(yàn)證。野生株和ΔMSMEG_3435-3436突變菌株在加藥處理前及經(jīng)異煙肼和利福平處理24 h后的菌落形成單位即存活率見表3，加藥處理后的野生株和ΔMSMEG_3435-3436突變菌株的菌落形成單位和存活率間的差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表3，圖8)。

MSMEG_3434和MSMEG_6761為上游基因，MSMEG_3435和MSMEG_6762為抗毒素基因，MSMEG_3436和MSMEG_6760為毒素基因，MSMEG_3437和MSMEG_6763為下游基因圖1 基因排列示意圖

CONTROL為pYC601載體空白對(duì)照，(-)為未加ATc誘導(dǎo)，(+)為加ATc誘導(dǎo)，ATc 濃度為100 ng/ml；“A600值”指在波長(zhǎng)600 nm處所測(cè)的吸光度值。圖2為與電轉(zhuǎn)空載體pYC601對(duì)照組菌株相比，無ATc誘導(dǎo)時(shí)，表達(dá)MSMEG_3436和MSMEG_3435-3436的菌株均正常生長(zhǎng)。圖3 為有ATc誘導(dǎo)時(shí)，誘導(dǎo)表達(dá)MSMEG_3436的菌株幾乎沒有生長(zhǎng)，誘導(dǎo)表達(dá)MSMEG_3435-3436的菌株可正常生長(zhǎng)圖2，3 恥垢分枝桿菌毒素-抗毒素系統(tǒng)MSMEG_3435-3436對(duì)細(xì)菌生長(zhǎng)的功能鑒定

CONTROL為pYC601載體空白對(duì)照，(-)為未加ATc誘導(dǎo)，(+)為加ATc誘導(dǎo)，ATc 濃度為100 ng/ml；“A600值”指在波長(zhǎng)600 nm處所測(cè)的吸光度值。圖4為與電轉(zhuǎn)空載體pYC601對(duì)照組菌株相比，無ATc誘導(dǎo)時(shí)，表達(dá)MSMEG_6760和MSMEG_6762-6760的菌株均可正常生長(zhǎng)。圖5為有ATc誘導(dǎo)時(shí)，誘導(dǎo)表達(dá)MSMEG_6760和MSMEG_6762-6760的菌株均可正常生長(zhǎng)圖4，5 恥垢分枝桿菌毒素-抗毒素系統(tǒng)MSMEG_6762-6760對(duì)細(xì)菌生長(zhǎng)的功能鑒定

菌株類型菌落形成單位(CFU,x±s)處理后存活率(%,x±s)處理前(×105)異煙肼處理后(×105)利福平處理后(×104)異煙肼處理后利福平處理后野生株126.70±13.335.33±1.761.80±0.464.38±1.480.15±0.04突變株266.70±6.67 9.33±1.760.33±0.133.49±0.660.03±0.02t值9.3911.6043.0510.5482.663P值0.0010.1840.0380.6130.056

泳道M為Trans 2 k Plus DNA ladder marker，即750 bp、1 kb、2 kb、3 kb；泳道1為在野生型分枝桿菌上用引物MSMEG_3435 up F(MSMEG_ 3435上游同源臂正向引物)和R in Ds for MSMEG(MSMEG_ 3435下游同源臂逆向引物)3435-3436所得擴(kuò)增產(chǎn)物條帶，即1999 bp；泳道2為在ΔMSMEG_3435-3436菌株上用引物MSMEG_3435 up F和R in Ds for MSMEG_3435-3436所得擴(kuò)增產(chǎn)物，刪掉了959 bp；泳道3為在野生型分枝桿菌上用引物MSMEG_6760 up F和R in Ds for MSMEG_6762-6760所得擴(kuò)增產(chǎn)物條帶，即1824 bp；泳道4為在ΔMSMEG_6762-6760菌株上用引物MSMEG_6760 up F和R in Ds for MSMEG_6762-6760所得擴(kuò)增產(chǎn)物，刪掉了792 bp圖6 應(yīng)用CRISPR-Cas12a輔助的重組系統(tǒng)構(gòu)建ΔMSMEG_3435-3436、ΔMSMEG_6762-6760突變菌株

三、LacZ融合轉(zhuǎn)錄調(diào)控及啟動(dòng)子活性檢測(cè)

將pMV261空載體和pMV261-antitoxin系列質(zhì)粒(即pMV261-MSMEG_1277、pMV261-MSMEG_1283、pMV261-MSMEG_3435、pMV261-MSMEG_4447、pMV261-MSMEG_5635)分別電轉(zhuǎn)至經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證成功整合LacZ報(bào)告基因的5個(gè)突變菌株(即SY3328、SY3309、SY6407、SY3310、SY3311)中。生長(zhǎng)至A600≈1.0時(shí)，用紫外分光光度計(jì)測(cè)定A600、A550和A420，計(jì)算β-半乳糖苷酶活性。與電轉(zhuǎn)pMV261空載體相比，電轉(zhuǎn)pMV261-antitoxin系列質(zhì)粒的5個(gè)突變菌株中，抗毒素蛋白對(duì)啟動(dòng)子活性的抑制程度差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表4)。

WT為野生型恥垢分枝桿菌，ΔMSMEG_3435-3436和ΔMSMEG_6762-6760分別為MSMEG_3435-3436和MSMEG_6762-6760的突變株。圖7為與野生株相比，兩個(gè)突變株的生長(zhǎng)表型均與野生型菌株無差異。 圖8為野生株和ΔMSMEG_3435-3436突變菌株在異煙肼和利福平處理24 h后(抗生素脅迫)的生存率比較，為直觀顯示縱坐標(biāo)采用log10轉(zhuǎn)換后表示圖7，8 野生株和ΔMSMEG_3435-3436突變菌株在生長(zhǎng)表型和抗生素脅迫方面的差異

菌株吸光度值A(chǔ)600值(x±s)A420值(x±s)A550值時(shí)間(min)β-半乳糖苷酶活性(MU,x±s)t值P值SY3328:: con1.025±0.0060.662±0.0290.0485.0376.50±17.132.2720.086SY3328:: MSMEG_12770.991±0.0270.550±0.0250.047 5.0315.50±20.71SY3309:: con1.018±0.0160.318±0.0150.0504.0189.00±12.241.7950.147SY3309:: MSMEG_12831.067±0.0140.297±0.0070.0524.0160.70±9.89SY6407:: con0.819±0.0060.480±0.0210.04718.0225.20±9.951.3190.258SY6407:: MSMEG_34350.815±0.0030.476±0.0060.04719.0211.70±2.57SY3310: con0.932±0.0310.417±0.0220.047 5.5221.40±12.071.9490.123SY3310: MSMEG_44470.839±0.0290.317±0.0180.0475.0186.60±13.17SY3311:: con0.988±0.0010.402±0.0130.048 6.0179.10±5.872.5620.063SY3311:: MSMEG_56350.944±0.0370.290±0.0300.052 5.5127.70±19.21

討 論

毒素-抗毒素系統(tǒng)在細(xì)菌中的生物學(xué)功能是當(dāng)前研究的熱點(diǎn)。結(jié)核分枝桿菌至少含有93個(gè)預(yù)測(cè)的毒素-抗毒素系統(tǒng)[3]，包括RelBE、MazEF、ParDE、VapBC、HigBA、YefM/YoeB等家族，這些毒素-抗毒素系統(tǒng)可能與細(xì)菌生長(zhǎng)速率、長(zhǎng)期休眠和耐藥性相關(guān)[3]，但由于涉及大量的基因，目前尚沒有研究直接通過基因缺失來評(píng)估整體毒素-抗毒素系統(tǒng)的功能。根據(jù)生物信息學(xué)預(yù)測(cè)和實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果顯示，恥垢分枝桿菌至少含有7個(gè)毒素-抗毒素系統(tǒng)，數(shù)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)少于結(jié)核分枝桿菌的毒素-抗毒素系統(tǒng)，可能與結(jié)核分枝桿菌的耐受和持留密切相關(guān)[10, 17]，故認(rèn)為對(duì)恥垢分枝桿菌的毒素-抗毒素系統(tǒng)的研究，對(duì)于認(rèn)識(shí)分枝桿菌的毒素-抗毒素系統(tǒng)有重要作用。

據(jù)Tandon等[17]報(bào)道，Rv0366c-Rv0367c是結(jié)核分枝桿菌中非典型的PezAT樣毒素-抗毒素系統(tǒng)，在恥垢分枝桿菌中Rv0366c的過表達(dá)可誘導(dǎo)其抑菌作用，并且該生長(zhǎng)缺陷可以通過同源抗毒素Rv0367c的共表達(dá)后得以恢復(fù)，誘導(dǎo)表達(dá)Rv0366c使細(xì)菌長(zhǎng)度縮短，并對(duì)乙胺丁醇的耐受性增強(qiáng)，經(jīng)同源性分析表明，恥垢分枝桿菌的MSMEG_3435-3436是一個(gè)預(yù)測(cè)的毒素-抗毒素系統(tǒng)，但其功能目前沒有文獻(xiàn)報(bào)道。Bajaj等[18]報(bào)道了MSMEG_6760的晶體結(jié)構(gòu)，并預(yù)測(cè)MSMEG_6760與處于同一操縱子調(diào)控的MSMEG_6762是一個(gè)毒素-抗毒素系統(tǒng)?；诮Y(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)顯示，MSMEG_6762-6760與Rv2034-2035具有同源性[3]。本研究通過在液體培養(yǎng)基中加入一定濃度的四環(huán)素來誘導(dǎo)表達(dá)MSMEG_3436，顯示出明顯的毒性作用，導(dǎo)致細(xì)菌生長(zhǎng)受到抑制，但當(dāng)與其同源抗毒素MSMEG_3435共表達(dá)時(shí)，MSMEG_3436的毒素作用被中和，首次證明了MSMEG_3435-3436是一個(gè)有功能的毒素-抗毒素系統(tǒng)；而誘導(dǎo)表達(dá)MSMEG_6762-6760后，沒有顯示出毒性作用，證明了MSMEG_6762-6760是一個(gè)無功能的毒素-抗毒素系統(tǒng)，成為第一次在恥垢分枝桿菌中發(fā)現(xiàn)無功能的毒素-抗毒素系統(tǒng)的研究。由于本研究過表達(dá)所用的啟動(dòng)子是誘導(dǎo)型的，蛋白表達(dá)較高，盡管不能完全排除重組構(gòu)建后目的基因并未表達(dá)的情況，但是大量研究都是通過在恥垢分枝桿菌及大腸桿菌中應(yīng)用誘導(dǎo)型啟動(dòng)子來驗(yàn)證毒素-抗毒素系統(tǒng)的基因功能，已經(jīng)報(bào)道的Rv0229c、Rv0569、Rv2165c等都是結(jié)核分枝桿菌中無功能的毒素-抗毒素系統(tǒng)[3, 6, 8]，提示恥垢分枝桿菌中也可能存在無功能的毒素-抗毒素系統(tǒng)。

為了更好地研究毒素-抗毒素系統(tǒng)在恥垢分枝桿菌中的功能，本研究應(yīng)用了CRISPR-Cas12a基因編輯技術(shù)構(gòu)建了ΔMSMEG_3435-3436和ΔMSMEG_6762-6760基因敲除突變菌株。與野生株相比，在液體培養(yǎng)基中檢測(cè)其生長(zhǎng)曲線，發(fā)現(xiàn)單個(gè)毒素-抗毒素系統(tǒng)的缺失不會(huì)影響其生長(zhǎng)表型，同F(xiàn)rampton等[10]的研究報(bào)道一致，他們分別構(gòu)建了ΔvapBC，ΔmazEF，Δphd/doc敲除菌株也均未檢測(cè)到表型差異，說明單個(gè)毒素抗毒素系統(tǒng)的缺失可能不會(huì)影響細(xì)菌的生長(zhǎng)表型。在進(jìn)一步的研究中，筆者挑選了ΔMSMEG_3435-3436敲除菌株，通過添加高濃度的異煙肼和利福平來驗(yàn)證毒素-抗毒素系統(tǒng)與藥物耐受間的關(guān)系。雖然恥垢分枝桿菌對(duì)這兩種一線抗結(jié)核藥物天然耐藥，但其天然耐藥的機(jī)制仍未明確。筆者認(rèn)為，研究異煙肼和利福平在恥垢分枝桿菌中天然耐藥的分子機(jī)制，可以為闡明異煙肼和利福平在結(jié)核分枝桿菌中的耐藥分子機(jī)制提供新的線索，而且有可能發(fā)現(xiàn)恥垢分枝桿菌天然耐藥的機(jī)制與其毒素-抗毒素系統(tǒng)是否相關(guān)的問題。研究結(jié)果顯示，高濃度異煙肼和利福平對(duì)野生株和ΔMSMEG_3435-3436敲除菌株均有95%以上的殺菌作用。通過比較加藥處理前后的存活率表明，野生株和ΔMSMEG_3435-3436敲除菌株與異煙肼(藥物靶點(diǎn)：分枝菌酸生物合成)和利福平(藥物靶點(diǎn)：RNA合成)耐受均無明顯關(guān)系。Frampton等[10]還研究了高濃度鏈霉素(藥物靶點(diǎn)：多肽的生物合成)和利福平對(duì)刪除了3個(gè)毒素-抗毒素系統(tǒng)的突變菌株(ΔMSMEG_1277-1278+ ΔMSMEG_1283-1284+ ΔMSMEG_4447-4448)的藥物耐受情況，結(jié)果顯示毒素-抗毒素系統(tǒng)與這兩種抗生素耐受無關(guān)。也有研究表明，當(dāng)毒素基因過表達(dá)時(shí)，細(xì)菌持留性增強(qiáng)進(jìn)而促進(jìn)細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性，而在缺失毒素-抗毒素系統(tǒng)的突變菌株中持留性是減弱的[19]。這提示我們，通過構(gòu)建過表達(dá)菌株、增加藥物種類等方式可以進(jìn)一步優(yōu)化實(shí)驗(yàn)，可以通過更多的研究來確定毒素-抗毒素系統(tǒng)與藥物耐受的關(guān)系。

截至目前，在恥垢分枝桿菌中共計(jì)鑒定出7個(gè)毒素-抗毒素系統(tǒng)。除了MSMEG_2143-2144不含毒素基因和MSMEG_6762-6760是一個(gè)無功能的毒素-抗毒素系統(tǒng)，共計(jì)驗(yàn)證出5個(gè)有功能的毒素-抗毒素系統(tǒng)。本研究利用LacZ報(bào)告基因檢測(cè)啟動(dòng)子活性(β-半乳糖苷酶活性)來研究毒素-抗毒素系統(tǒng)轉(zhuǎn)錄的負(fù)自動(dòng)調(diào)節(jié)。諸多文獻(xiàn)報(bào)道，典型的毒素-抗毒素系統(tǒng)的表達(dá)受毒素-抗毒素復(fù)合物的調(diào)節(jié)，該復(fù)合物中的抗毒素與相關(guān)啟動(dòng)子DNA相互作用，抑制轉(zhuǎn)錄，導(dǎo)致毒素-抗毒素系統(tǒng)轉(zhuǎn)錄的負(fù)自動(dòng)調(diào)節(jié)[8, 20-21]。Robson等[9]和Frampton等[10]的研究認(rèn)為，在恥垢分枝桿菌中抗毒素基因的表達(dá)可以抑制啟動(dòng)子的活性，但局限性在于該研究不是對(duì)基因組原位的驗(yàn)證，而是在質(zhì)粒上構(gòu)建并通過外源轉(zhuǎn)入。為評(píng)估恥垢分枝桿菌中抗毒素蛋白與其自身啟動(dòng)子結(jié)合的特性，本研究以LacZ為報(bào)告基因，在染色體上檢測(cè)了這5個(gè)毒素-抗毒素系統(tǒng)的自調(diào)控功能。與對(duì)照組相比，抗毒素表達(dá)載體僅輕微抑制了毒素-抗毒素系統(tǒng)的啟動(dòng)子活性，說明在恥垢分枝桿菌中毒素-抗毒素系統(tǒng)的自調(diào)控功能不明顯，與Robson等[9]和Frampton等[10]的實(shí)驗(yàn)報(bào)道結(jié)果一致。雖然也有許多對(duì)其他菌屬自調(diào)控功能的研究，如腸炎鏈球菌的TacT介導(dǎo)的TacA乙酰化會(huì)改變TacAT的啟動(dòng)子結(jié)合模式，但似乎并不影響對(duì)基礎(chǔ)TacAT的轉(zhuǎn)錄水平[22]；還有對(duì)AtaRT-操縱基因DNA復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu)表明，提示異六聚體排列對(duì)于轉(zhuǎn)錄自調(diào)控也是至關(guān)重要的[23]。但對(duì)分枝桿菌中毒素-抗毒素系統(tǒng)的自調(diào)控功能的分子機(jī)制尚不清楚，還需要進(jìn)行更深入的研究。

綜上所述，本研究成功構(gòu)建了MSMEG_3435-3436和MSMEG_6762-6760的表達(dá)體系及敲除菌株，發(fā)現(xiàn)MSMEG_3435-3436是恥垢分枝桿菌中一對(duì)新的有功能的毒素-抗毒素系統(tǒng)。初步探討了這兩對(duì)毒素-抗毒素系統(tǒng)對(duì)菌株生長(zhǎng)表型及與對(duì)異煙肼和利福平耐受的相關(guān)性，驗(yàn)證了恥垢分枝桿菌中5對(duì)毒素-抗毒素系統(tǒng)的自調(diào)控功能，為下一步研究結(jié)核分枝桿菌毒素-抗毒素系統(tǒng)的功能奠定了基礎(chǔ)。