中鏈脂肪酸及其α-單脂肪酸甘油酯的抗菌研究

---單一作用和協(xié)同作用

人們普遍認(rèn)為，人初乳和牛乳的抗菌活性是由甘油三酯通過(guò)脂肪酶水解，釋放脂肪酸（FAs）和α-單脂肪酸甘油酯（MGs），它們共同構(gòu)成母乳喂養(yǎng)嬰兒抵御入侵病原體的第一道防線（Isaacs,2005）。在這些牛乳成分中，中鏈FAs（C-8到C-14）及其MGs對(duì)通過(guò)口腔和鼻傳播的病毒和B組鏈球菌最為有效。因此，這些化合物被用作配方乳的添加劑，以防止或減少嬰兒口腔和上呼吸道黏膜的感染（Isaacs等，1995）。此外，研究表明，一些中鏈FAs和MGs抑制了細(xì)菌的抗生素抗性基因，并引起了頻率相對(duì)較低的自然耐藥 （Petshow等，1996；Ruzin和 Novick，1998）。這一事實(shí)以及發(fā)現(xiàn)這些化合物在小濃度下是無(wú)毒的，使得它們有望作為抗生素或替代抗生素來(lái)治療不同的疾病 （Bergsson 等，2001；Nair等，2005；Rouse 等，2005）。

在所有中鏈脂肪酸中，月桂酸（C-12）具有最大的抗菌活性。當(dāng)酸酯化為甘油酯時(shí)，這種作用會(huì)被放大，從而產(chǎn)生α-單月桂酸甘油酯，中鏈MGs中抗菌效果最佳。α-單月桂酸甘油酯對(duì)革蘭氏陽(yáng)性致病菌和腐敗菌具有活性。然而，當(dāng)與其他物質(zhì)結(jié)合時(shí)，其活性可以被加大。例如，當(dāng)與EDTA或檸檬酸鹽等陽(yáng)離子螯合劑結(jié)合時(shí)，α-單月桂酸甘油酯對(duì)革蘭氏陰性菌具有活性。此外，還可以觀察到α-單月桂酸酯與多種其他食品成分（如磷酸酯、抗氧劑和酸化劑）有協(xié)同抗菌的作用（馬歇爾，1998）。由于其長(zhǎng)期安全使用的記錄，α-單月桂酸甘油酯單獨(dú)或與抗生素相結(jié)合，可被證明在預(yù)防和治療嚴(yán)重的細(xì)菌感染，特別是那些難以治療或耐抗生素的細(xì)菌感染方面是有用的（Preuss等，2005 年）。

本研究初步檢測(cè)了所有中鏈 FAs，即辛酸（C-8）、癸酸（C-10）、月桂酸（C-12）和肉豆蔻酸（C-14）及其對(duì)應(yīng)的MGs（α-單辛酸甘油酯、α-單葵酸甘油酯、α-單月桂酸甘油酯和α-單豆蔻酸甘油酯）對(duì)葡萄球菌、棒狀桿菌、芽孢桿菌、李斯特菌和鏈球菌等革蘭氏陽(yáng)性菌有抗菌活性。進(jìn)一步研究了活性最強(qiáng)的化合物α-單月桂酸甘油酯與抗菌活性較好的化合物之間簡(jiǎn)單的協(xié)同關(guān)系。

1 材料和方法

1.1 材料 中鏈脂肪酸辛酸、癸酸、月桂酸和肉豆蔻酸及其合成α-單脂肪酸甘油酯所需的所有化學(xué)物質(zhì)均以高純度從Aldrich購(gòu)買(mǎi)。試驗(yàn)培養(yǎng)物：金黃色葡萄球菌Rosenbach 209、金黃色葡萄球菌ATCC 33862 USA、金黃色葡萄球菌146 MR、表皮葡萄球菌1093、白喉?xiàng)U菌 39179、蠟樣芽胞桿菌157、李斯特菌C12和化膿鏈球菌15346取自Stefan Angeloff微生物研究所，保加利亞科學(xué)院和國(guó)家藥物管制研究所。

1.2 MGs的合成 MGs的合成分為兩個(gè)步驟，見(jiàn)圖1（Batovska等，2004）。 簡(jiǎn)單地說(shuō)，首先通過(guò)外消旋2，2-二甲基-1，3-二氧環(huán)戊烷-4-甲醇與酸性氯化物反應(yīng)，得到它們的丙酮化合物。用強(qiáng)酸性離子交換樹(shù)脂對(duì)生成的丙酮化合物進(jìn)行保護(hù)。

1.3 瓊脂擴(kuò)散法 用瓊脂擴(kuò)散法檢測(cè)肉質(zhì)蛋白胨瓊脂上生長(zhǎng)的細(xì)菌的抗菌活性 （Spooner和Sykes，1979）。 將 200 μL 細(xì)菌懸液（105個(gè)細(xì)胞/mL）置于培養(yǎng)皿的瓊脂層上（直徑10 cm）。每個(gè)盤(pán)子準(zhǔn)備5個(gè)孔，每個(gè)孔直徑10 mm。將每個(gè)100 μL的樣品，溶解在96%乙醇溶液（5 000 μg/mL）中再添加到適當(dāng)?shù)目字?。?duì)于預(yù)擴(kuò)散，將培養(yǎng)皿放置在4℃下2 h；在37℃下培養(yǎng)48 h后，根據(jù)瓊脂層中抑制區(qū)的直徑估計(jì)抗菌活性，試驗(yàn)重復(fù)進(jìn)行3次，具有至少16 mm直徑的抑制區(qū)的化合物具有活性。對(duì)照組試驗(yàn)用純?nèi)軇┻M(jìn)行。

1.4 連續(xù)稀釋法 采用在線實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)（2000）中所述，用肉湯管稀釋法測(cè)量單個(gè)化合物及其混合物的最小抑制濃度 （MIC）。用Mueller-Hinton肉湯將每個(gè)樣品在試管中連續(xù)稀釋至0.0~2 000 μg/mL，測(cè)定MIC。每根試管接種含有105個(gè)細(xì)胞/mL的細(xì)菌懸浮液，并在35℃下培養(yǎng)過(guò)夜。與接種有微生物懸浮液的無(wú)藥肉湯相比，明顯沒(méi)有生長(zhǎng)的最高稀釋度被認(rèn)為是MIC。為了更精確的檢測(cè)，在新鮮肉類(lèi)蛋白胨瓊脂平板上劃出沒(méi)有可見(jiàn)生長(zhǎng)的試管，在35℃下培養(yǎng)24 h，并檢查生長(zhǎng)情況。

2 結(jié)果和討論

本研究評(píng)價(jià)了中鏈脂肪辛酸（C-8）、癸酸（C-10）、月桂酸（C-12）和肉豆蔻酸（C-14）及其對(duì)應(yīng)的MGs（α-單辛酸甘油酯、α-單葵酸甘油酯、α-單月桂酸甘油酯和α-單肉豆蔻酸甘油酯）對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌的抗菌活性，表1和表2分別列出了FAs和MGs的抑制區(qū)（dinh）和最小抑制濃度（MIC）的直徑。

表1 中鏈FAs的抗菌研究結(jié)果

表2 中鏈GMs的抗菌研究結(jié)果

脂肪鏈具有12個(gè)碳的α-單月桂酸甘油酯是所有被測(cè)化合物中最活躍的（見(jiàn)表2），它能強(qiáng)烈抑制葡萄球菌和鏈球菌的生長(zhǎng)，這是唯一對(duì)耐甲氧西林的金黃色葡萄球菌有效的化合物；其他的MGs，如α-單葵酸甘油酯和α-單肉豆蔻酸甘油酯，它們與α-單月桂酸甘油酯相差2個(gè)碳原子，其活性明顯降低；而8個(gè)碳原子脂肪鏈的α-單辛酸甘油酯沒(méi)有表現(xiàn)出任何活性。

眾所周知，月桂酸具有抗菌活性，當(dāng)脂肪酸與甘油酯化生成α-單月桂酸甘油酯時(shí)，其抗菌活性增強(qiáng)。有一種說(shuō)法認(rèn)為，α-單月桂酸甘油酯的甘油部分是親水載體，可以通過(guò)細(xì)菌細(xì)胞膜傳遞月桂酸，在細(xì)菌細(xì)胞膜上表現(xiàn)出抗菌活性 （Ruzin和Novick，2000）。如果是這樣的話，可以推測(cè)α-單月桂酸甘油酯將顯示出比月桂酸更強(qiáng)的抗菌活性。此外，通過(guò)保護(hù)其羥基消除甘油部分的親水性將導(dǎo)致更多的非活性化合物。在這一關(guān)系中，研究比較了月桂酸、α-單月桂酸甘油酯和具有兩個(gè)封閉羥基的α-單月桂酸甘油酯的丙酮化合物的抗菌效果（見(jiàn)表3）。未結(jié)合的月桂酸抑制化膿性鏈球菌，MIC為125 μg/mL；當(dāng)酸與甘油結(jié)合時(shí)，這種活性增加了4倍。出乎意料的是，阻斷α-單月桂甘油酯中甘油部分的兩個(gè)羥基有利于其抗菌活性，而α-單月桂酸甘油酯的丙酮化合物的抗菌活性是游離月桂酸的32倍，是α-單月桂酸甘油酯的8倍。該化合物對(duì)化膿性鏈球菌細(xì)胞有一定的特異性作用。此外，α-單脂肪酸甘油酯的丙酮化合物對(duì)其他細(xì)菌，如李斯特菌和白喉?xiàng)U菌完全不起作用 （見(jiàn)表3）。這可能是因?yàn)楦视筒糠质鼙Ｗo(hù)的羥基通過(guò)這些細(xì)菌細(xì)胞膜的滲透干擾了整個(gè)分子。

表3 月桂酸、α-單月桂酸甘油酯和單月桂酸甘油酯的丙酮化合物對(duì)所選細(xì)菌的MIC值（μg/mL）

考慮到α-單月桂酸甘油酯的抗菌活性會(huì)受到其他活性化合物的影響，我們檢測(cè)了該MGs的一些兩種混合物和最接近的抗菌活性的化合物。因此，選擇α-單葵酸甘油酯和α-單肉豆蔻酸甘油酯作為繼α-單月桂酸甘油酯對(duì)抗金黃色葡萄球菌209后的第二大活性成分，并以不同比例分別與α-單月桂酸甘油酯混合這些混合物，對(duì)金黃色葡萄球菌209的抗菌研究結(jié)果表明，只有當(dāng)α-肉豆蔻酸甘油酯的含量與α-單月桂酸甘油酯相同（比例1:1）或較少（比例1:2）時(shí)，才具有協(xié)同作用（見(jiàn)圖2）；α-單葵酸甘油酯不與α-單月桂酸甘油酯發(fā)生協(xié)同作用（見(jiàn)圖2）。當(dāng)使用單核細(xì)胞增生李斯特菌和白喉?xiàng)U菌作為試驗(yàn)菌時(shí)，月桂酸也發(fā)現(xiàn)了同樣的情況（見(jiàn)圖3-圖4）。當(dāng)對(duì)化膿性鏈球菌進(jìn)行研究時(shí)，發(fā)現(xiàn)α-單月桂酸甘油酯與α-單葵酸甘油酯以及α-單月桂酸甘油酯與活性差的月桂酸之間存在協(xié)同關(guān)系（見(jiàn)圖5）。在這些情況下，其中一種成分優(yōu)于另一種成分2倍的混合物比單獨(dú)的某種成分更為活躍。此外，組成成分比例為1:1也是不利的?；钚缘摩?單月桂酸甘油酯與月桂酸之間的協(xié)同關(guān)系表明，α-單脂肪酸甘油酯與抗菌活性較弱的化合物的組合也值得關(guān)注。在這方面，不僅應(yīng)檢查兩種成分的混合物，而且還應(yīng)檢查含有3種以上組分的復(fù)雜混合物。

總之，中鏈MGs比中鏈FAs更具活性，其中α-單月桂酸甘油酯對(duì)各種革蘭氏陽(yáng)性菌的抗菌活性最強(qiáng)，以化膿鏈球菌為試驗(yàn)微生物，觀察到以下作用：（1）阻斷α-單月酸甘油酯的甘油部分的羥基，得到具有顯著抗菌活性的化合物；（2）對(duì)其兩種組分混合物進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)α-單月桂酸甘油酯與α-單葵酸甘油酯、α-單月桂酸甘油酯與活性差的月桂酸之間存在協(xié)同關(guān)系。

混合后α-肉豆蔻酸甘油酯的含量與α-單月桂酸甘油酯相同或較少時(shí)，α-肉豆蔻酸甘油酯與α-單月桂酸甘油酯對(duì)金黃色葡萄球菌209也存在協(xié)同作用。

根據(jù)所觀察到的效果，可以開(kāi)發(fā)出有效的抗菌化合物和脂質(zhì)混合物。致 謝該項(xiàng)工作得到保加利亞國(guó)家科學(xué)研究基金會(huì)（合同X-1514）的支持。

（本文由福州華康牧業(yè)有限公司技術(shù)部翻譯整理自Batovska D I,Todorova I T,Tsvetkova I,et al.Antibacterial study of the medium chain fatty acids and their 1-monoglycerides:individual effects and synergistic relationships[J].Polish Journal of Microbiolog,2009,58(1):43-47.）