金屬硫蛋白調(diào)控及重金屬解毒功能研究進(jìn)展

樊威　焦曉磊　蘇建　羅煜　蘇全森　吳俊　楊?！∴囌Z

摘要：隨著現(xiàn)代工業(yè)的迅速發(fā)展，重金屬污染問題日益嚴(yán)重。重金屬不斷在生物體內(nèi)富集，對(duì)生物體的生長發(fā)育與新陳代謝產(chǎn)生顯著危害。因此尋找安全、高效的重金屬解毒物質(zhì)越來越受到國內(nèi)外學(xué)者的重視。金屬硫蛋白（Metallothioneins，MT）是一種分子量低、廣泛存在于大多數(shù)生物體內(nèi)的蛋白質(zhì)，具有螯合重金屬離子的能力，可保護(hù)機(jī)體免受重金屬危害。本文綜述了MT的結(jié)構(gòu)和功能，從遺傳分子層面進(jìn)一步闡述機(jī)體對(duì)MT基因的表達(dá)調(diào)控，旨為MT在重金屬解毒領(lǐng)域的研究與應(yīng)用提供參考依據(jù)。

關(guān)鍵詞：重金屬;金屬硫蛋白;解毒功能;表達(dá)調(diào)控

中圖分類號(hào)：S-3文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：ADOI：10.19754/j.nyyjs.20200115002

收稿日期：2019-07-29

基金項(xiàng)目：四川省科技計(jì)劃項(xiàng)目（項(xiàng)目編號(hào)：2017NZYZF0089）

作者簡介：樊威（1990-），男，助理研究員。研究方向：水產(chǎn)病害;通訊作者蘇建（1986-），男，助理研究員。研究方向：水產(chǎn)養(yǎng)殖。

自1957年Margashes和Vallee首次從馬腎中分離出金屬硫蛋白（Metallothionein，MT）以來[1]，人們陸續(xù)從其它生物上也分離得到了MT。目前，國內(nèi)外對(duì)MT功能的研究發(fā)現(xiàn)，MT有調(diào)節(jié)生物體內(nèi)金屬離子、激素、細(xì)胞代謝及清除自由基等能力，且能被金屬、細(xì)胞因子、細(xì)胞毒性藥物等誘導(dǎo)產(chǎn)生[2]。本文對(duì)金屬硫蛋白結(jié)構(gòu)、解毒功能、解毒調(diào)控等研究進(jìn)展和應(yīng)用前景進(jìn)行綜述，以期為其開發(fā)應(yīng)用提供參考。

1金屬硫蛋白的結(jié)構(gòu)

MT是硫蛋白結(jié)合金屬離子后的名稱，學(xué)名金屬硫組氨酸三甲基內(nèi)鹽，是一種低分子量（6～7kDa）蛋白質(zhì)。除某些酵母和細(xì)菌外，典型的MT包含20個(gè)半胱氨酸，無芳香族氨基酸及組氨酸，無二硫鍵[3]。哺乳動(dòng)物MT一般具有2個(gè)獨(dú)立結(jié)構(gòu)域，部分水生生物只有單體和二聚體等不同結(jié)構(gòu)形式[4]。MT可通過形成金屬硫酯鍵選擇性的結(jié)合金屬離子，具有極強(qiáng)螯合重金屬離子的能力和較高的金屬含量（每分子含7～12個(gè)金屬分子）。MT分子中不含a-螺旋和β-折疊，構(gòu)象極為穩(wěn)定，因此，具有較強(qiáng)抗蛋白酶消化和抗熱能力。

MT氨基酸數(shù)量因物種不同而有較大差異，范圍在20～100個(gè)不等。哺乳動(dòng)物有60～62個(gè)氨基酸;水生動(dòng)物除由59個(gè)氨基酸組成的大西洋鮭[5]、61個(gè)氨基酸組成的虹鱒和香魚[6]以及63個(gè)氨基酸的白鱘[7]外，大部分已測序魚類MT只含有60個(gè)氨基酸。植物氨基酸數(shù)量45～87個(gè)不等;真菌及原核生物氨基酸在數(shù)量和類型等方面存在較大種間差異。

2金屬硫蛋白的分類

根據(jù)蛋白結(jié)構(gòu)的不同，MT主要分為MT1、MT2、MT3和MT4 4種亞型。其中MT1有多種異構(gòu)體（MT1a、b、e、f、g、h、x）[8]，MT1和MT2可由大多數(shù)哺乳動(dòng)物的內(nèi)臟器官誘導(dǎo)產(chǎn)生[9]。在老鼠體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)中均發(fā)現(xiàn)MT1和MT2的表達(dá)十分活躍，同時(shí)以肝、腎細(xì)胞為主，但MT3和MT4的基因表達(dá)卻十分有限[10]。與其它MT亞型不同，MT3是MT家族中唯一具有獨(dú)特生理功能的亞型，也被稱作腦神經(jīng)生長抑制因子，能夠阻止谷氨酸和一氧化氮對(duì)小腦神經(jīng)元的神經(jīng)毒性作用，主要分布于星形膠質(zhì)細(xì)胞，對(duì)銅離子的結(jié)合能力較強(qiáng)，但不能被鎘或其它金屬離子誘導(dǎo)產(chǎn)生[11]。MT4主要分布于皮膚、消化道等器官角質(zhì)細(xì)胞及復(fù)層鱗狀上皮細(xì)胞[12]。

3MT對(duì)重金屬的解毒功能

MT在生物體中的表達(dá)具有普遍性和保守性，而豐富的巰基含量和重金屬結(jié)合能力決定了其功能方面的多樣性，目前研究一致認(rèn)為，MT在重金屬中毒過程中扮演著重要角色。MT對(duì)不同種類重金屬親和力不同，因此，MT對(duì)重金屬的解毒能力也不盡相同。目前已發(fā)現(xiàn)18種金屬離子能與MT結(jié)合，其中結(jié)合最為緊密的是Cu2+、其次是Cd2+和Zn2 +[13]。不同金屬對(duì)MT結(jié)合位點(diǎn)還存在競爭和置換現(xiàn)象，但MT分子一旦與Cd2+或Ag+結(jié)合就很難被其它金屬置換下來[14， 15]。當(dāng)MT與重金屬離子形成復(fù)合化合物后，可通過溶酶體從細(xì)胞質(zhì)排到細(xì)胞外[16]，使機(jī)體免遭重金屬毒性作用。如Cu-MT在細(xì)胞代謝過程中被氧化為無毒的聚合物形態(tài)后，伴隨膽汁的分泌一起排出體外，或是變成難溶的多聚體復(fù)合物儲(chǔ)存在溶酶體中。

3.1內(nèi)源性MT的解毒功能

MT對(duì)保護(hù)大腦、肝、腎等重要器官具有極其重要的作用。Park等[17]研究發(fā)現(xiàn)正常小鼠與金屬硫蛋白基因敲除小鼠在不同重金屬離子施加條件下的死亡率差異明顯，在鎘、鋅、汞、砷等重金屬的作用下，正常小鼠死亡率顯著低于金屬硫蛋白基因敲除的小鼠，其中，金屬硫蛋白對(duì)重金屬Cd2+的解毒效果最強(qiáng)，因此，證明了內(nèi)源性金屬硫蛋白對(duì)重金屬解毒的作用。

3.2外源性MT的解毒功能

研究還發(fā)現(xiàn)外源性MT對(duì)重金屬依然具有解毒作用。李曉偉等在研究兒童鉛中毒的過程中發(fā)現(xiàn)，外源性添加MT可顯著降低鉛中毒兒童血鉛濃度，同時(shí)不影響其它正常金屬離子濃度[18]。后續(xù)研究報(bào)道，Gzde等研究鉈毒性實(shí)驗(yàn)時(shí)，發(fā)現(xiàn)給小鼠腹腔提前1h注射2.5mg/kg MT1后，注射組相比對(duì)照組鉈含量在一定程度明顯降低[19]。于立博等在小鼠鉛中毒實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，外源性給予小鼠金屬硫蛋白后，高劑量干預(yù)組相對(duì)于對(duì)照組細(xì)胞損傷狀況減輕[20]。

3.3MT解毒功能與重金屬濃度的相關(guān)性

MT在限定范圍內(nèi)對(duì)金屬離子具有解毒效力，但超過臨界值后，機(jī)體無法產(chǎn)生足夠MT保護(hù)自身免遭高濃度金屬離子損害[21]。Ren等[22]在研究中華絨螯蟹中發(fā)現(xiàn)，在銅脅迫條件下，伴隨重金屬積累，MT表達(dá)量在第7天達(dá)到最大值后隨時(shí)間延長而逐漸下降，MT應(yīng)答效應(yīng)趨于減弱。

4金屬硫蛋白的調(diào)控

MT廣泛表達(dá)于所有真核細(xì)胞和部分原核細(xì)胞胞漿中，其表達(dá)受多種方式調(diào)控，如金屬離子、氧化應(yīng)激、甾體激素等[23]。因此，研究MT在轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控機(jī)制，有助于更深入了解MT的解毒功能。

4.1金屬離子對(duì)MT基因的調(diào)控

金屬調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子1（Metal-responsive transcription factor-1，MTF-1）是一種75kDa大小能夠調(diào)控金屬應(yīng)答的鋅指轉(zhuǎn)錄因子，只有Zn2+激活MTF-1與MT基因上的MRE結(jié)合后才能調(diào)控MT的表達(dá)。正常情況下，細(xì)胞內(nèi)的MT和MTF-1處于平衡狀態(tài)。Yuhui等研究發(fā)現(xiàn)，貧鈾刺激前和刺激后給小鼠腹腔注射10mg/kg ZnSO4，均可顯著降低肝臟、腎臟和脾臟的貧鈾含量，降低小鼠死亡率[24]。

4.2氧化應(yīng)激對(duì)MT基因的調(diào)控

氧化應(yīng)激對(duì)MT的調(diào)控主要依賴于MT基因結(jié)構(gòu)上游區(qū)域存在的抗氧化應(yīng)答元件（ARE）及金屬應(yīng)答元件（MRE）。正常狀態(tài)下動(dòng)物機(jī)體內(nèi)自由基數(shù)量處于較低水平，但當(dāng)機(jī)體受到某些損傷后，氧化應(yīng)激產(chǎn)生的活性氧自由基[25]促使細(xì)胞內(nèi)Zn2+釋放，進(jìn)而參與MTF-1介導(dǎo)的調(diào)控反應(yīng)。如氧化性物質(zhì)可迅速誘導(dǎo)小鼠肝臟細(xì)胞內(nèi)MTs基因的轉(zhuǎn)錄[26]。Kyong-Son等研究發(fā)現(xiàn)，給小鼠注射濃度為7.5mg Fe/kg的氮基三醋酸鐵可使小鼠肝腎中MT和MT mRNA均顯著上升[27]。Kelly等發(fā)現(xiàn)給纖維細(xì)胞添加二硝基酚（DNP，一種解偶聯(lián)劑）或抗霉素（AA，一種電子傳遞抑制劑）均可通過產(chǎn)生氧自由基引起小鼠肝臟中MT表達(dá)的升高。然而，自由基激活MT的具體作用機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

4.3甾體激素對(duì)MT基因的調(diào)控

糖皮質(zhì)激素應(yīng)答元件（GRE）通過與糖皮質(zhì)激素受體（glucocorticoid receptor，GR）結(jié)合，介導(dǎo)甾體激素的反應(yīng)和調(diào)控MT基因的表達(dá)。GRE為甾體激素誘導(dǎo)MT所必需，可不依賴MT基因近端啟動(dòng)子區(qū)內(nèi)的MRE起作用。將HepG2細(xì)胞的GR基因敲除，在不同處理?xiàng)l件下，MT的表達(dá)都將被抑制[28]。

4.4其它因子對(duì)MT基因的調(diào)控

MT基因在胞內(nèi)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控還可受其它因素調(diào)控，因?yàn)镸T基因5上游除應(yīng)答元件外，還存在可誘導(dǎo)性增強(qiáng)子[29]。這些序列包括SP-1（Selective transcription factor -1）、AP-1（Activator protein-1）和AP -2等。有研究表明，通過AP-2介導(dǎo)，cAMP可提高肝MT mRNA水平[30]。金屬應(yīng)答元件還可以與蛋白或其它因子相互作用，而這些因子對(duì)MT的表達(dá)也具有一定調(diào)節(jié)作用[31， 32]。如小鼠感染流感病毒后可通過IL-6、IL-10和IL-12等白細(xì)胞介素激活JAK-STAT信號(hào)通路，實(shí)現(xiàn)肝臟MT215-20倍的表達(dá)。

5展望

MT作用廣泛，涉及多種生物學(xué)過程并參與機(jī)體多種重大疾病的發(fā)生，雖然金屬硫蛋白的重金屬解毒等生物活性功能越來越多的被開發(fā)出來，但MT研究與應(yīng)用中存在的諸多限制與不足亟待解決。在今后的研究中應(yīng)整合生物學(xué)相關(guān)技術(shù)和方法，進(jìn)一步研究其蛋白功能、表達(dá)調(diào)控和相互作用機(jī)制，在效應(yīng)機(jī)制和臨床應(yīng)用中給予更多關(guān)注。

參考文獻(xiàn)

[1] Panemangalore M， Banerjee D， Onosaka S， et al. Changes in the intracellular accumulation and distribution of metallothionein in rat liver and kidney during postnatal development[J]. Developmental Biology， 1983，97（1）：95-102.

[2]Haq F， Mahoney M， Koropatnick J. Signaling events for metallothionein induction[J]. Mutation Research/fundamental & Molecular Mechanisms of Mutagenesis， 2004，533（1-2）：211-226.

[3]Blindauer C A. Metallothioneins with unusual residues： histidines as modulators of zinc affinity and reactivity[J]. Journal of Inorganic Biochemistry， 2008，102（3）：507-521.

[4]Munoz A， Petering D H， Iii C F S. The requirements for stable metallothionein clusters examined using synthetic lobster domains[J]. Marine Environmental Research， 2000，50（1）：93-97.

[5]Leong J S， Jantzen S G， Schalburg K R V， et al. Salmo salar and Esox lucius full-length cDNA sequences reveal changes in evolutionary pressures on a post-tetraploidization genome[J]. Bmc Genomics， 2010，11（5）：279.

[6]Lin C H， John J A C， Li W O， et al. Cloning and characterization of metallothionein gene in ayu Plecoglossus altivelis[J]. Aquatic Toxicology， 2004，66（2）：111-124.

[7]Doering J A， Beitel S C， Eisner B K， et al. Identification and response to metals of metallothionein in two ancient fishes： White sturgeon （Acipenser transmontanus） and lake sturgeon （Acipenser fulvescens）[J]. Comparative Biochemistry & Physiology Part C Toxicology & Pharmacology， 2015，171：41-48.

[8]Bo A， Zhang H， Zhang X， et al. Clinical signification on the expressions of metallothionein in three types cancer of woman[J]. The Chinese-German Journal of Clinical Oncology， 2008，1（1）：59-61.

[9]Sato M， Kondoh M. Recent studies on metallothionein： Protection against toxicity of heavy metals and oxygen free radicals[J]. Tohoku Journal of Experimental Medicine， 2002，196（1）：9-22.

[10]Liang L， Fu K， Lee D K， et al. Activation of the complete mouse metallothionein gene locus in the maternal deciduum[J]. Molecular Reproduction & Development， 1996，43（1）：25-37.

[11]Nagamine T， Suzuki K， Kondo T， et al. Interferon-alpha-induced changes in metallothionein expression in liver biopsies from patients with chronic hepatitis C[J]. Canadian journal of gastroenterology， 2005，19（8）：481-486.

[12]Palumaa P， Njunkova O， Pokras L， et al. Evidence for non-isostructural replacement of Zn 2+ with Cd 2+ in the β-domain of brain-specific metallothionein-3[J]. Febs Letters， 2002，527（1）：76-80.

[13]Nath R， Kambadur R， Gulati S， et al. Molecular aspects， physiological function， and clinical significance of metallothioneins[J]. Critical Reviews in Food Science & Nutrition， 1988，27（1）：41-85.

[14]張建鵬， 仲燕， 任緒義， 等. 鎘誘導(dǎo)大鼠睪丸三種類型細(xì)胞和肝臟金屬硫蛋白基因表達(dá)的研究[J]. 第二軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)， 2003（2）：184-187.

[15]柴春彥， 劉國艷， 石發(fā)慶. 銅缺乏對(duì)奶牛肝臟金屬硫蛋白代謝的影響[J]. 畜牧與獸醫(yī)， 2002（03）：14-16.

[16]Andreani G， Kindt M， Carpene E. Metallothioneins （MTs） in marine molluscs[J]. Cellular & Molecular Biology， 2000.

[17]Park J D， Liu Y， Klaassen C D. Protective effect of metallothionein against the toxicity of cadmium and other metals（1）[J]. Toxicology， 2001，163（2-3）：93-100.

[18]李曉偉， 魯曼. 金屬硫蛋白對(duì)鉛中毒兒童臨床干預(yù)觀察研究[J]. 中國兒童保健雜志， 2008，16（4）：391-393.

[19]Kilic G A， Kutlu M. Effects of exogenous metallothionein against thallium-induced oxidative stress in rat liver[J]. Food & Chemical Toxicology An International Journal Published for the British Industrial Biological Research Association， 2010，48（3）：980-987.

[20]于立博， 劉繼文. 鷹嘴豆-金屬硫蛋白拮抗小鼠骨髓干細(xì)胞鉛毒性的機(jī)制[J]. 中國老年學(xué)雜志， 2013，33（23）：5930-5931.

[21]Silvestre F， Duchêne C， Trausch G， et al. Tissue-specific cadmium accumulation and metallothionein-like protein levels during acclimation process in the Chinese crab Eriocheirsinensis[J]. Comparative Biochemistry & Physiology Toxicology & Pharmacology Cbp， 2005，140（1）：39-45.

[22]Ren F， Jiang H， Sun J， et al. Cloning， characterization， expression， and copper sensitivity of the metallothionein-1 gene in the Chinese mitten crab， Eriocheirsinensis[J]. Molecular Biology Reports， 2011，38（4）：2383-2393.

[23]Lynes M A， Zaffuto K， Unfricht D W， et al. The physiological roles of extracellular metallothionein[J]. Experimental Biology & Medicine， 2006，231（9）：1548-1554.

[24]Hao Y， Ren J， Liu J， et al. The Protective Role of Zinc against Acute Toxicity of Depleted Uranium in Rats[J]. Basic & Clinical Pharmacology & Toxicology， 2012，111（6）：402-410.

[25]Ramón R， Rodrigo F G， Rodrigo G， et al. Oxidative Stress and Pathophysiology of Ischemic Stroke： Novel Therapeutic Opportunities[J]. Cns & Neurological Disorders Drug Targets， 2013，12（5）：698-714.

[26]Dalton T P， Li Q， Bittel D， et al. Oxidative Stress Activates Metal-responsive Transcription Factor-1 Binding Activity[J]. Journal of Biological Chemistry， 1996，271（42）：26233-26241.

[27]Min K S， Morishita F， Tetsuchikawahara N， et al. Induction of hepatic and renal metallothionein synthesis by ferric nitrilotriacetate in mice： the role of MT as an antioxidant[J]. Toxicol Appl Pharmacol， 2005，204（1）：9-17.

[28]Sato S， Shirakawa H， Tomita S， et al. The aryl hydrocarbon receptor and glucocorticoid receptor interact to activate human metallothionein2A[J]. Toxicology & Applied Pharmacology， 2013，273（1）：90-99.

[29]金淑梅. 水稻類金屬硫蛋白（rgMT）基因功能解析及對(duì)苜蓿的遺傳轉(zhuǎn)化研究[D]. 哈爾濱：東北林業(yè)大學(xué)， 2006.

[30]Cousins R J. Absorption， transport， and hepatic metabolism of copper and zinc： special reference to metallothionein and ceruloplasmin[J]. Physiological Reviews， 1985，65（2）：238-309.

[31]Tang C M， Westling J， Seto E. trans repression of the human metallothionein IIA gene promoter by PZ120， a novel 120-kilodalton zinc finger protein[J]. Molecular & Cellular Biology， 1999，19（1）：680-689.

[32]Miles A T， Hawksworth G M， Beattie J H， et al. Induction， Regulation， Degradation， and Biological Significance of Mammalian Metallothioneins[J]. Critical Reviews in Biochemistry & Molecular Biology， 2008，35（1）：35-70.

（責(zé)任編輯賈燦）