生物靶向抑制劑在治療眼底新生血管中的研究進(jìn)展

劉梓煜 劉大川

眼底新生血管屬于異常的血管增殖，是致盲的一個(gè)重要原因。新生血管形成過程與多種因素相關(guān)，新生血管發(fā)生機(jī)制目前尚不明確，對于新生血管治療主要集中于新生血管抑制劑的研究。近年來，生物靶向抑制劑作為一種新興的治療方法，在抑制新生血管生長、降低視網(wǎng)膜中央厚度和改善視力等方面有較好的療效[1-2]。

1 血管內(nèi)皮生長因子相關(guān)抑制劑

血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)對血管的發(fā)育至關(guān)重要，并且能刺激血管的生成[3]。VEGF是一個(gè)家族，包括VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D、VEGF-E、VEGF-F、 胎盤生長因子-1(placental growth factor 1，PIGF-1)和PIGF-2。目前已經(jīng)確定的VEGF的2種酪氨酸激酶(protein tyrosine kinasestyrosine,PTK)受體包括VEGF受體1 (vascular endothelial growth factor receptor 1,VEGFR1)和VEGFR2，VEGF的生物學(xué)功能主要是通過VEGFR2來介導(dǎo)[3]，VEGF與VEGFR2結(jié)合導(dǎo)致VEGFR2的酪氨酸自磷酸化，隨后幾種關(guān)鍵的銜接蛋白被激活和募集，包括Shc、Grb2、Gab1、SHP1和SHP2[4-6]。銜接蛋白的激活促進(jìn)下游關(guān)鍵信號的級聯(lián)，誘導(dǎo)多種與血管生成相關(guān)的基因轉(zhuǎn)錄。VEGF的過度表達(dá)與包括腫瘤生成、急/慢性炎癥、增生性視網(wǎng)膜病變在內(nèi)的病理性血管生成密切相關(guān)[3]。VEGF促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的存活、增殖、遷移和侵襲[7-8]。VEGF已被證實(shí)是視網(wǎng)膜血管生成疾病的主要致病因子和治療靶點(diǎn)之一[9]，通過阻斷VEGFR可以抑制血管細(xì)胞間黏附分子-1的表達(dá)、白細(xì)胞瘀滯及內(nèi)屏障破壞，減少血管滲漏及新生血管形成。目前臨床上已經(jīng)上市的藥物包括貝伐單抗、雷珠單抗、阿柏西普和康柏西普等。玻璃體內(nèi)注射VEGF抗體(貝伐單抗或雷珠單抗)對治療眼底新生血管有明顯療效[10-11]。貝伐單抗和雷珠單抗均為完全性抗VEGF-A免疫球蛋白，雷珠單抗為重組人源化單克隆抗體片段，是人類VEGF亞型單克隆抗體片段的重組體，能與人類VEGF-A所有亞型直接特異性結(jié)合，從而使VEGF-A亞型無法與其受體結(jié)合而達(dá)到血管滲透性降低、抑制新生血管的效果[12]。貝伐單抗是一種完整重組人類單克隆抗體，由93%人源IgG1框架區(qū)和7%鼠單克隆抗體的抗原結(jié)合互補(bǔ)區(qū)組成，通過抑制VEGF-A的所有亞型達(dá)到抑制新生血管的生成[13]。阿柏西普全部是人的氨基酸序列的融合蛋白組成的VEGF拮抗劑，包含了人VEGF受體-1和人VEGF受體-2的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)域，與人免疫球蛋白G1的Fc片段形成融合蛋白，主要結(jié)合VEGF-A、VEGF-B和PIGF來發(fā)揮拮抗作用[14]，從而抑制新生血管的生成。與阿柏西普相比，康柏西普多出一個(gè)低電位VEGFR-2結(jié)合域，通過結(jié)合VEGF-A、VEGF-B、PIGF來使血管內(nèi)皮的增殖和血管的新生受到抑制。

已有研究證明GAI蛋白是G蛋白的抑制亞基，GAI蛋白與G蛋白受體結(jié)合能夠抑制腺苷酸環(huán)化酶，從而導(dǎo)致環(huán)磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate,cAMP)生成減少[15]。Sun等[16]發(fā)現(xiàn)，GAI1和GAI3的敲除或其短發(fā)夾RNA(short hairpin RNA,shRNA)的敲低均顯著抑制VEGFR2信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。在機(jī)制上，其發(fā)現(xiàn)GAI1和GAI3是VEGF誘導(dǎo)的VEGFR2內(nèi)吞作用必需的，已知VEGFR2的內(nèi)吞作用是VEGFR2信號轉(zhuǎn)導(dǎo)必不可少的，抑制VEGFR2內(nèi)吞復(fù)合物將抑制VEGF介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和血管生成[17-18]。GAI1/ 3的消耗、敲低或突變會(huì)破壞VEGF誘導(dǎo)的VEGFR2內(nèi)吞作用復(fù)合物形成。此外，GAI1/ 3沉默也會(huì)抑制VEGF誘導(dǎo)的VEGFR2內(nèi)吞作用、VEGF誘導(dǎo)的體外和體內(nèi)血管生成以及HUVEC的增殖、遷移、侵襲和血管樣管形成。因此，GAI1和GAI3可能是通過促進(jìn)VEGFR2內(nèi)吞作用而在VEGF信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中的重要參與者。重要的是，GAI1和GAI3在增殖性糖尿病性視網(wǎng)膜病變(proliferative diabetic retinopathy,PDR)患者的增殖性視網(wǎng)膜組織中上調(diào)，并且它們的上調(diào)與蛋白激酶B(protein kinase B,PKB)-S6K1和細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)蛋白激酶(extracellular signal-regulated kinase,ERK)的過度激活相關(guān)。在高氧誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜病變(oxygen-induced retinopathy,OIR)和堿燒傷誘導(dǎo)的新血管形成的動(dòng)物模型中，GAI1和GAI3SHRNA或敲除顯著抑制體內(nèi)血管生成。因此根據(jù)目前的研究，可以認(rèn)為抑制內(nèi)皮細(xì)胞中的GAI1和GAI3可為治療PDR和其他增殖性視網(wǎng)膜疾病提供一種新方法，并且從VEGFR2信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的潛在機(jī)制方向來思考對于開發(fā)新的和有效的治療策略。

此外，Src也是血管生成信號級聯(lián)中的關(guān)鍵組分，Src是一種非受體酪氨酸激酶，可與多種細(xì)胞表面受體相互作用，并且在細(xì)胞生長、分化和遷移的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中起關(guān)鍵作用。Eliceiri等[19]VEGF介導(dǎo)的血管生成需要Src激酶活性。Src在人類多種腫瘤中的活性和表達(dá)水平快速升高，在促進(jìn)腫瘤生長和轉(zhuǎn)移中起重要作用。此外， Src也在病理性眼部新生血管形成中異常激活[20]。通過Src抑制劑可以明顯抑制血管的高通透性[21]。研究發(fā)現(xiàn)Src在病理性視網(wǎng)膜前血管簇和神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層中高度活化[22]。這些數(shù)據(jù)表明Src是參與異常視網(wǎng)膜新血管形成的重要血管生成信號分子。達(dá)沙替尼最初是作為Src和BCR/ABL的雙重抑制劑開發(fā)的，現(xiàn)已被用作對伊馬替尼耐藥的慢性髓性白血病的有效治療劑。Seo等[23]使用Src抑制劑達(dá)沙替尼來檢測其對病理性視網(wǎng)膜新生血管的抑制作用，結(jié)果顯示達(dá)沙替尼完全阻斷了VEGF誘導(dǎo)的HRMEC中Y416上Src的磷酸化。鑒于VEGF在病理性眼部新血管形成中的重要性以及Src在VEGF血管生成信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中的關(guān)鍵作用，用Src抑制劑減弱VEGF誘導(dǎo)的血管生成可能是調(diào)節(jié)多種眼部疾病中過度新血管形成的良好治療策略。

目前已知在體內(nèi)，人絨毛促性腺激素(human chorionic gonadotropin,HCG)與黃體生成素(luteinizing hormone,LH)相同的受體均具有強(qiáng)烈的促血管生成作用。HCG是一種VEGF調(diào)節(jié)激素，通過它上調(diào)VEGF表達(dá)刺激妊娠子宮的血管形成。目前已有研究表明LH/HCG受體存在于視網(wǎng)膜中，并且在眼內(nèi)均發(fā)現(xiàn)了HCG和LH[24]。Movsas等[25]通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)HCG可能影響視網(wǎng)膜血管形成和VEGF產(chǎn)生，因此，HCG受體可能成為潛在的血管增生性視網(wǎng)膜病癥的治療靶向目標(biāo)。

2 Apelin/APJ通路相關(guān)抑制劑

Apelin是一種從牛胃中提取出來的肽類生長因子，為APJ受體的內(nèi)源性配體[26]，以高親和力與APJ受體結(jié)合。Apelin編碼77個(gè)氨基酸的前原蛋白可產(chǎn)生多種活性多肽，其中Apelin-13是APJ最有效的激活劑。發(fā)育研究表明，Apelin在人體包括內(nèi)皮細(xì)胞和血管平滑肌細(xì)胞在內(nèi)的多種細(xì)胞中高表達(dá)，缺氧可以誘導(dǎo)Apelin-13的表達(dá)，缺血組織內(nèi)皮細(xì)胞Apelin和APJ表達(dá)增加。雖然大多數(shù)研究都集中在Apelin的心血管作用上，但已有研究探討了它在眼生理和病理血管生成中的作用[27-28]。Apelin增強(qiáng)視網(wǎng)膜內(nèi)皮細(xì)胞的遷移、增殖和毛細(xì)血管樣管形成，但不增強(qiáng)臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的增殖。在體內(nèi)，Apelin有助于視網(wǎng)膜血管化和正常的眼部發(fā)育以及病理性血管生成[29]。 盡管Apelin/APJ促進(jìn)視網(wǎng)膜血管生成的詳細(xì)過程尚不清楚，有研究認(rèn)為Apelin-13是通過PI-3K-AKT和絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)/ERK信號通路在糖尿病性黃斑水腫中早期啟動(dòng)細(xì)胞骨架和緊密連接[30]，并且已有研究證明Apelin/APJ系統(tǒng)通過離散機(jī)制與VEGF協(xié)同作用促進(jìn)血管發(fā)育[31]。

有研究通過細(xì)胞的高通量篩選，發(fā)現(xiàn)抗瘧藥物阿莫地喹和以4-氯氨基喹啉為代表的相關(guān)化合物是APJ有效的選擇性拮抗劑[32]。阿莫地喹是一種選擇性、非競爭性APJ拮抗劑，以濃度依賴性方式抑制Apelin信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。此外，阿莫地喹抑制了Apelin和VGEF誘導(dǎo)的內(nèi)皮管形成。玻璃體內(nèi)注射阿莫地喹顯著降低小鼠模型中的脈絡(luò)膜新生血管(choroidal neovascularization,CNV)損傷體積，并且在最高測試劑量下未顯示出眼毒性的跡象。Ishimaru等[33]比較了OIR小鼠模型中APJ抑制劑和VEGF阻斷對病理性視網(wǎng)膜血管生成的影響。他們發(fā)現(xiàn)AP2拮抗劑ML221阻止了新生血管簇的形成并且加速了無血管區(qū)域的血運(yùn)重建。相比之下，VEGFR2抑制劑SU1498抑制新生血管簇的形成但不影響無血管區(qū)域，提示VEGF-VEGFR2軸不僅在病理性血管生成，在OIR中正常脈管系統(tǒng)的再生也起重要作用。而APJ在新生血管叢中的內(nèi)皮細(xì)胞中高度表達(dá)，在形態(tài)正常的血管中略微檢測到，但VEGFR2普遍分布在內(nèi)皮細(xì)胞中。同時(shí)Li等[30]通過Apelin/APJ敲除小鼠研究Apelin在糖尿病性黃斑水腫(diabetic macular edema,DME)中的作用，檢測到Apelin誘導(dǎo)人視網(wǎng)膜微血管內(nèi)皮細(xì)胞(human retinal microvascular endothelial cell,HRMECs)的增殖和遷移，促進(jìn)正常和高糖條件下細(xì)胞骨架蛋白質(zhì)磷酸化和緊密連接。他們還發(fā)現(xiàn)Apelin在體外和體內(nèi)均激活了PI-3K /AKT和MEK/ERK信號通路。 最重要的是Apelin/APJ系統(tǒng)參與DR的病理學(xué)，并且發(fā)現(xiàn)Apelin-13是通過PI-3K/AKT和MAPK/ERK信號通路在DME中作為細(xì)胞骨架和緊密連接的早期啟動(dòng)子。這些結(jié)果表明APJ拮抗劑比VEGFR2抑制劑更有選擇性地抑制缺血性視網(wǎng)膜病變中的病理性視網(wǎng)膜血管生成。這些工作堅(jiān)定地建立了APJ作為治療眼部新生血管形成的新型、可化學(xué)處理的治療靶標(biāo)，同時(shí)為抗VEGF藥物治療無效的患者提供了多元化選擇。

3 配體組學(xué)技術(shù)在抗視網(wǎng)膜新生血管中的應(yīng)用

配體組學(xué)技術(shù)最初設(shè)計(jì)用于全局鑒定細(xì)胞范圍的配體來發(fā)現(xiàn)致病或治療配體[34-36]，并且研究發(fā)現(xiàn)配體組學(xué)技術(shù)可以通過不同的配體富集策略(包括結(jié)合和功能選擇)發(fā)現(xiàn)廣泛適用于體外或體內(nèi)環(huán)境中的任何類型的細(xì)胞或疾病的配體[37-38]。目前，配體組學(xué)技術(shù)在抗視網(wǎng)膜新生血管方面也取得了一定成效，Wang等[39]和Leblanc等[40]將比較配體組學(xué)進(jìn)行了高通量篩選應(yīng)用于糖尿病小鼠和對照小鼠，用于疾病相關(guān)內(nèi)皮配體的差異作圖。DR-high Scg3充分證明了比較配體組學(xué)的主要優(yōu)點(diǎn)：常規(guī)配體篩選方法可能忽略了對健康細(xì)胞具有相對低結(jié)合活性的疾病高配體。分泌顆粒素(Secretogranin Ⅲ，Scg3)屬于granin家族，其由嗜鉻粒蛋白A(chromogranin A,CgA)、CgB和Scg2-7組成。Scg3是CgA的結(jié)合配偶體，在合成分泌顆粒和分泌肽激素中起著重要的作用。據(jù)報(bào)道，Scg3由功能失調(diào)的β細(xì)胞分泌，因此在1型糖尿病中可能會(huì)發(fā)現(xiàn)Scg3的上調(diào)。

Scg3被發(fā)現(xiàn)是一種新的疾病相關(guān)配體，在患糖尿病時(shí)僅在不健康的血管中具有選擇性結(jié)合和血管生成活性。相反，VEGF在糖尿病和正常脈管系統(tǒng)中結(jié)合并誘導(dǎo)血管生成。Scg3和VEGF通過不同的受體途徑發(fā)出信號。重要的是，Scg3中和抗體可以高效地減輕糖尿病小鼠的視網(wǎng)膜血管滲漏。此外，抗Scg3阻止氧誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜病變小鼠中的視網(wǎng)膜新血管形成，這是早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病變(retinopathy of prematurity,ROP)的替代模型。Leblanc等[40]發(fā)現(xiàn)抗Scg3治療對OIR有很高的療效。Scg3的高疾病選擇性暗示抗Scg3療法可能對正常血管具有最小的不良反應(yīng)。并且發(fā)現(xiàn)Scg3通過激活ERK[41]和Src途徑，但不激活蛋白激酶B(protein kinase B,PKB)和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)與活化轉(zhuǎn)錄因子(signal transducers and activators of transcription,Stat3)以調(diào)節(jié)血管生成和血管滲漏。ROP是兒童視力損害的最常見原因[42]，目前臨床上還沒有批準(zhǔn)的藥物用于治療。這些結(jié)果表明Scg3是DR和ROP的新型抗血管生成治療的有希望的靶標(biāo)。

4 小結(jié)

生物靶向抑制劑在眼底新生血管治療中發(fā)揮越來越重要的作用，為了預(yù)防和抑制眼底新生血管，一些與新生血管相關(guān)的因子如抗新生血管抗體、受體調(diào)節(jié)劑及新生血管通路抑制劑均被用于臨床。這些新型治療方法在臨床實(shí)踐中的療效及安全性還需進(jìn)一步研究證實(shí)。總之，生物靶向抑制劑為眼底新生血管的治療帶來了新曙光，值得進(jìn)一步研究。