缺血再灌注急性腎損傷機制研究進展

李爽，包宇實

(哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院腎內(nèi)科，哈爾濱 150001)

急性腎損傷(acute kidney injury，AKI)是由各種原因引起的短時間內(nèi)腎功能快速降低而出現(xiàn)的臨床綜合征，表現(xiàn)為腎小球濾過率降低，肌酐、尿素氮潴留，水電解質(zhì)和酸堿平衡紊亂。嚴(yán)重的AKI可導(dǎo)致多器官功能障礙綜合征。近年來，突發(fā)性腎臟損傷伴膿毒癥和多器官功能障礙綜合征的病例逐漸增加，全球每年約有200萬人死于AKI，存活患者中部分可能發(fā)展為不同程度的慢性腎臟病[1]。鑒于AKI的高發(fā)病率和高病死率，國際急救醫(yī)學(xué)界及腎臟病學(xué)界提出了AKI的概念，期望盡量在病程早期，甚至在腎臟出現(xiàn)損傷而腎小球濾過率尚處于正常階段就能將其識別，并早期實施干預(yù)，提高患者的生存率。改善全球腎臟病預(yù)后組織指南將AKI定義為：48 h內(nèi)血清肌酐增高≥26.5 μmol/L；明確或經(jīng)推斷在7 d內(nèi)血清肌酐增至≥1.5倍基礎(chǔ)值；或持續(xù)6 h尿量<0.5 mL/(kg·h)[2]。目前，對于AKI尚無有效地減輕腎組織損傷和促進腎組織修復(fù)的治療措施。缺血再灌注損傷(ischemia-reperfusion injury，IRI)是臨床AKI的重要發(fā)病原因，現(xiàn)就缺血再灌注AKI發(fā)病機制的研究進展予以綜述。

1 缺血再灌注AKI

IRI是一種病理狀態(tài)，其特征是最初限制器官的血液供應(yīng)，隨后恢復(fù)灌注并伴隨再氧化，加重組織損傷。IRI是臨床導(dǎo)致AKI的最主要原因，腎臟缺血階段為腎臟損害的始動環(huán)節(jié)，腎臟微血管改變，伴隨缺血導(dǎo)致線粒體代謝障礙，細胞壞死；腎臟再灌注階段活性氧類的產(chǎn)生、細胞內(nèi)鈣超載等變化更進一步加重了腎損傷[3]。

1.1腎臟微循環(huán)損傷 腎臟微血管系統(tǒng)參與腎小球濾過、腎小管重吸收，微血管系統(tǒng)的功能障礙和結(jié)構(gòu)變化誘導(dǎo)腎損傷[4]。AKI血流動力學(xué)方面的腎臟微血管改變被公認為在AKI的病理生理學(xué)中起關(guān)鍵作用，微循環(huán)受損導(dǎo)致局部一氧化氮、活性氧類和氧氣供需失衡，受損傷的內(nèi)皮細胞激活并表達新的細胞表面標(biāo)志物，促進白細胞和血小板的募集和黏附，內(nèi)皮細胞損傷和炎癥反應(yīng)加重，繼而血管通透性增加，間質(zhì)水腫加重，血管內(nèi)血流進一步減少；與此同時，氧化應(yīng)激和血管收縮以及前列腺素等物質(zhì)的釋放，會加重血流緩慢甚至導(dǎo)致局部血液不流動的現(xiàn)象，閉塞的微血管系統(tǒng)加劇了腎臟損傷?；铙w顯微鏡下觀察顯示，IRI大鼠皮質(zhì)管周毛細血管中的血流變得遲緩，恢復(fù)灌注后，管周毛細血管密度降低，可見，IRI所致微血管損傷的主要后果是管周毛細血管減少，加劇了腎臟持續(xù)性進行性的缺氧和腎纖維化的發(fā)展[5]。腎臟微血管靶向治療研究證實，敲除基質(zhì)金屬蛋白酶2特異性基因或用基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑改善缺血性AKI動物模型的微血管通透性[6]，或通過血管內(nèi)皮生長因子給藥促進微血管內(nèi)皮細胞的修復(fù)和增殖，均可改善腎臟損傷[7]。

1.2氧自由基、鈣超載和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的作用 氧自由基是具有高生物活性的氧分子，缺血再灌注AKI伴隨大量氧自由基的產(chǎn)生，加重腎損傷。缺氧時，ATP被快速降解為ADP和AMP，AMP進一步代謝為腺嘌呤核苷酸和次黃嘌呤，再灌注后缺氧細胞重新獲氧，缺氧過程大量積累的次黃嘌呤以分子氧作為電子受體反應(yīng)后產(chǎn)生大量氧自由基；另外，缺氧條件下，Na+-Ca2+交換機制被激活，Ca2+大量內(nèi)流，同時伴隨ATP供給不足，Ca2+回收障礙，致細胞內(nèi)鈣超載，造成膜磷脂水解，引起細胞的急慢性損傷和死亡；Ca2+濃度升高，進入線粒體的超氧化物歧化酶減少，從而使氧自由基的清除減少，鈣超載與氧自由基相互影響導(dǎo)致腎臟缺血再灌注損傷加重[3]。

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)負責(zé)正確的合成、組裝、修飾機體內(nèi)的蛋白質(zhì)。IRI后，細胞內(nèi)Ca2+水平和氧化還原平衡改變觸發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)，從而促進蛋白質(zhì)正確折疊，促進細胞功能的恢復(fù)[8]。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激包括3條未折疊蛋白反應(yīng)，在IRI模型小鼠腎臟中，葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78和C/EBP同源蛋白(C/EBP homologous protein，CHOP)的表達均增加，說明IRI通過介導(dǎo)CHOP基因的表達，激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)[9]。CHOP基因缺失可以抑制IRI炎癥反應(yīng)，有效減輕腎損傷，而敲除CHOP基因可減少IRI小鼠腎小管上皮細胞凋亡[10]。因此，針對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激未折疊蛋白反應(yīng)可能是預(yù)防或治療AKI的新方向。

2 炎癥反應(yīng)與缺血再灌注AKI

炎癥反應(yīng)是IRI后導(dǎo)致腎臟損傷的重要原因，炎癥反應(yīng)損傷血管內(nèi)皮細胞和腎小管上皮細胞從而導(dǎo)致腎臟組織損傷，腎功能降低。IRI時炎癥細胞浸潤腎臟實質(zhì)，并分泌相應(yīng)的炎癥因子，導(dǎo)致腎血管內(nèi)皮細胞表達黏附分子和血管通透性增加，腎小管上皮細胞上調(diào)Toll樣受體(Toll-like receptor，TLR)增加補體結(jié)合，導(dǎo)致腎實質(zhì)細胞損傷，腎功能急劇降低[11-12]。

2.1腎血管內(nèi)皮細胞損傷 腎血管內(nèi)皮細胞損傷是IRI的早期事件之一。先天免疫反應(yīng)和后天性炎癥級聯(lián)反應(yīng)作為缺血性AKI的發(fā)病機制是由內(nèi)皮細胞損傷、激活以及與白細胞黏附分子的相互作用引發(fā)。研究證實，IRI后細胞內(nèi)黏附分子1表達增加，中性粒細胞通過內(nèi)皮趨化因子和黏附分子被吸引到腎臟炎癥部位，同時黏附到內(nèi)皮細胞，導(dǎo)致活性氧類、蛋白酶、彈性蛋白酶、髓過氧化物酶釋放，加重IRI后的腎臟損傷[13]。此外，急性IRI小鼠腎臟內(nèi)皮細胞趨化因子表達上調(diào)，促進巨噬細胞在腎臟組織中聚集，其中M1巨噬細胞參與損傷相關(guān)分子模式和病原體相關(guān)分子模式的激活，同時釋放趨化因子、促炎癥細胞因子和誘導(dǎo)型一氧化氮合酶，形成細胞毒性過氧亞硝酸鹽，在AKI期間加重腎臟炎癥損傷[14]。內(nèi)皮細胞在AKI炎癥反應(yīng)早期通過促進白細胞的黏附趨化來增加腎臟損害。

2.2腎小管上皮細胞損傷 IRI后，近端腎小管上皮細胞基底外側(cè)膜上的補體調(diào)節(jié)蛋白表達增加，調(diào)節(jié) C3在管狀上皮細胞的沉積；另外，IRI后腎小管上皮細胞產(chǎn)生促炎趨化因子、巨噬細胞炎癥因子-2和角質(zhì)形成細胞衍生的趨化因子等，激活調(diào)節(jié)性T細胞的表達和分泌，趨化中性粒細胞和巨噬細胞，激活補體替代途徑[15]。此外，上皮細胞和管周毛細血管之間有大量的樹突狀細胞，樹突狀細胞可釋放促炎細胞因子/趨化因子，介導(dǎo)CD1d分子激活恒定的自然殺傷T細胞與脂多糖類的抗原起反應(yīng)，并與自然殺傷T細胞相互作用，激活天然免疫系統(tǒng)[16]。此外，樹突狀細胞和自然殺傷T細胞可結(jié)合CD40/CD40L誘導(dǎo)產(chǎn)生白細胞介素-12的強烈前向信號，促進恒定的自然殺傷T細胞觸發(fā)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子4磷酸化以及連續(xù)的γ干擾素分泌，加重炎癥損傷[16]。TLRs可識別病原體相關(guān)分子模式參與炎癥反應(yīng)。IRI后，TLR2和TLR4通過腎小管上皮細胞內(nèi)源性配體表達的上調(diào)，加重腎臟炎癥損傷；而敲除小鼠TLR2/TLR4基因或TLR中心信號髓樣分化因子88基因?qū)θ毖俟嘧KI起到保護作用[17]。另外，TLR9被認為與缺血性AKI的腎小管上皮細胞損傷有關(guān)，IRI可誘導(dǎo)TLR9內(nèi)源性配體血漿線粒體DNA釋放[18]，而近端腎小管細胞TLR9的缺失，可抑制核因子κB介導(dǎo)的促炎途徑和胱天蛋白酶(caspase)-3/8介導(dǎo)的凋亡途徑，緩解壞死、凋亡和炎癥，對腎小管上皮細胞起保護作用[19]。同樣，在缺血再灌注AKI模型中使用TLR9抑制劑羥氯喹，可抑制核因子κB信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑和組織蛋白酶的活性，激活核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體蛋白3，減輕缺血再灌注AKI[20]。這些研究突出了缺血再灌注AKI炎癥反應(yīng)在腎血管內(nèi)皮細胞和腎小管上皮細胞損傷中的重要作用。

3 凋亡、細胞周期停滯和細胞壞死與缺血再灌注AKI

腎小管上皮細胞損傷和死亡是AKI的關(guān)鍵病理特征[21]。IRI通過氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)等復(fù)雜的病理生理改變，引起腎小管上皮細胞損傷，導(dǎo)致嚴(yán)重的細胞凋亡或壞死，加重腎臟損傷。

3.1凋亡、細胞周期停滯與缺血再灌注AKI 細胞凋亡是外來因素觸發(fā)細胞內(nèi)預(yù)存的死亡程序而引發(fā)的細胞程序性死亡。缺血再灌注AKI動物模型和人類AKI腎臟活檢均顯示腎小管上皮細胞發(fā)生了凋亡變化[22]。IRI后，凋亡信號分子(腫瘤壞死因子-α、Bax、caspase等)在腎小管上皮細胞高表達，體內(nèi)促凋亡蛋白Bax表達上調(diào)，而抗凋亡基因Bcl-2表達下調(diào)[23]。IRI期間凋亡途徑激活的機制包括外在機制和內(nèi)在機制，外在機制是由腫瘤壞死因子-α和凋亡相關(guān)因子配體與相關(guān)凋亡誘導(dǎo)受體的結(jié)合觸發(fā)，繼而通過激活啟動子caspase-8和caspase-10啟動蛋白水解級聯(lián)反應(yīng)[24]；內(nèi)在機制是由于線粒體外膜損傷使細胞色素C釋放到細胞質(zhì)中，形成多蛋白復(fù)合物(即凋亡小體)，啟動caspase-9介導(dǎo)的蛋白水解級聯(lián)反應(yīng)[25]。有學(xué)者利用間充質(zhì)干細胞的抗凋亡特性對缺血再灌注AKI模型小鼠進行治療，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，抗凋亡基因Bcl-2的表達升高，促凋亡基因Bax的表達下降，缺血再灌注AKI顯著改善[26]。

在真核生物中，細胞周期由4個不同的階段(G1、S、G2和M)組成。在正常腎臟中，僅有1%的腎小管上皮細胞處于增生期，而其余細胞均處于休眠期(G0期)[27]。AKI時，G0期的腎小管上皮細胞結(jié)束休眠，開始進入細胞周期的循環(huán)中，正常腎小管上皮細胞的周期啟動有利于腎臟損傷的修復(fù)，損傷細胞的細胞周期停滯于G1期可以防止損傷細胞的DNA復(fù)制。細胞內(nèi)的細胞周期蛋白依賴性激酶(cyclin-dependent kinases，CDK)可促進細胞周期的進行，而對這一過程調(diào)節(jié)的蛋白質(zhì)主要有兩類：一類包括p21、p27和p57蛋白家族，主要與CDK2結(jié)合并抑制其功能，阻止細胞進入G1晚期或S期；另一類蛋白家族是CDK抑制因子4家族，主要與CDK4/6結(jié)合使細胞停滯于G1期[27]。研究發(fā)現(xiàn)，AKI時細胞內(nèi)的p21水平顯著升高，同時伴有細胞周期停滯，與p21敲除的大鼠相比，IRI后的野生型大鼠腎臟p21上調(diào)，腎臟損傷更輕[28]。另外，組織金屬蛋白酶抑制物2(tissue inhibitor of metalloproteinase-2，TIMP-2)和胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白7(insulin-like growth factors binding protein 7，IGFBP7)水平在AKI腎小管上皮細胞中也升高，兩者可分別誘導(dǎo)p27和p21的表達增加，從而阻止細胞進入下一個周期，且TIMP-2和IGFBP7是腎小管上皮細胞參與調(diào)節(jié)細胞周期的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[29]。心臟手術(shù)前的缺血預(yù)處理使腎小管上皮細胞TIMP-2和IGFBP7的表達均上調(diào)，因此術(shù)后AKI出現(xiàn)的風(fēng)險顯著降低[30]。近年來，TIMP-2和IGFBP7已成為臨床早期診斷AKI和預(yù)測AKI預(yù)后非常重要的生物標(biāo)志物。

3.2細胞壞死與缺血再灌注AKI 長期以來，細胞壞死被認為是被動的非能量依賴性的細胞死亡，通過細胞腫脹和細胞膜破壞釋放損傷相關(guān)模式分子，如高遷移率族蛋白、ATP等，隨后激活炎癥和免疫系統(tǒng)，加重組織損傷。腎小管上皮細胞壞死是缺血再灌注AKI的主要病理特征。近年研究表明，細胞壞死取決于細胞內(nèi)Ca2+積累和蛋白酶活化的綜合結(jié)果[31]。組織缺血缺氧時ATP不足，損傷Ca2+-ATP酶和Na+，K+-ATP酶，激活Na+-Ca2+交換機制，Ca2+大量內(nèi)流，激活蛋白酶(如鈣蛋白酶和磷脂酶)，這些酶會誘導(dǎo)細胞膜通透性發(fā)生改變和細胞骨架蛋白膜磷脂的水解，最終導(dǎo)致細胞壞死[32]。此外，針對IRI腎臟細胞壞死途徑的研究發(fā)現(xiàn)，細胞壞死主要由細胞質(zhì)受體蛋白激酶3、細胞質(zhì)受體蛋白激酶1和混合譜系激酶結(jié)構(gòu)域樣蛋白的相互作用介導(dǎo)，通過敲除小鼠細胞質(zhì)受體蛋白激酶3或混合譜系激酶結(jié)構(gòu)域樣蛋白基因，可抑制細胞壞死，減輕缺血再灌注AKI，而利用細胞質(zhì)受體蛋白激酶1活性抑制劑Nec-1(necrostatin-1)預(yù)處理的小鼠，可以提高小鼠缺血后的存活率，減輕缺血再灌注AKI[33]。

4 自噬與缺血再灌注AKI

自噬是一個依賴于溶酶體的分解代謝過程，消除老化細胞器和大分子蛋白質(zhì)，為細胞器的更新和細胞修復(fù)提供營養(yǎng)代謝支持[34]。自噬作為細胞應(yīng)對生存壓力的一種自適應(yīng)防御，在維持細胞穩(wěn)態(tài)過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用[35]。在IRI過程中，近端腎小管上皮細胞中自噬體和自溶體高表達，自噬對IRI中細胞存活和細胞死亡起重要作用。

自噬的激活可以對缺血再灌注AKI的腎小管上皮細胞提供保護。研究表明，自噬的發(fā)生具有時間依賴性，而且其誘導(dǎo)時間早于細胞凋亡的發(fā)生，激活自噬有助于缺血再灌注AKI的保護；雷帕霉素預(yù)處理激活自噬可減輕缺血再灌注AKI，抑制細胞凋亡，改善腎功能；相反，抑制自噬可使腎小管細胞凋亡增加，腎功能惡化[34]。與野生型小鼠相比，端粒酶基因敲除損傷哺乳動物雷帕霉素靶蛋白介導(dǎo)的自噬信號后，IRI小鼠腎功能的恢復(fù)顯著延遲[36]。缺血預(yù)適應(yīng)促進自噬作用，可減輕缺血再灌注AKI，而使用氯喹和3-甲基腺嘌呤抑制自噬卻加重了IRI后腎小管細胞凋亡[37]。通過削弱近端腎小管中的腺苷酸活化蛋白激酶-絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路可抑制自噬的激活，加劇缺血再灌注AKI，而激活近端腎小管細胞發(fā)生線粒體自噬，則減弱了IRI過程中的腎臟損傷[38]。另外，高壓氧治療可以通過激活細胞自噬對IRI大鼠腎臟模型起到保護作用[39]。因此，細胞自噬可以對IRI導(dǎo)致AKI的腎臟組織發(fā)揮有效的保護作用。

另一方面，自噬的過度激活可導(dǎo)致AKI加重，抑制過度自噬可以改善缺血再灌注AKI。中性粒細胞明膠酶相關(guān)脂蛋白可誘導(dǎo)腎小管上皮細胞過度自噬，加重缺血再灌注AKI[40]。成纖維細胞生長因子-10可抑制哺乳動物雷帕霉素靶蛋白介導(dǎo)的過度自噬，緩解缺血再灌注AKI大鼠模型的腎功能[41]。氯化鋅可減輕內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，減少自噬相關(guān)蛋白Beclin-1和溶酶體關(guān)聯(lián)膜蛋白2的表達，改善缺血再灌注AKI的炎癥反應(yīng)[42]。此外，微RNA也可抑制自噬，減輕缺血再灌注AKI[43]。對缺血性腎纖維化小鼠模型的研究顯示，自噬最初與近端腎小管的反應(yīng)是適應(yīng)性的，過度自噬最終會導(dǎo)致適應(yīng)不良[44]。

因此，自噬作為一種新發(fā)現(xiàn)的程序性細胞死亡形式，對IRI后腎小管上皮細胞的存活和死亡具有重要意義。自噬是一把“雙刃劍”，自噬的激活在缺血再灌注AKI過程的早期具有保護作用，而過度自噬激活在缺血再灌注AKI過程的晚期則可促進細胞凋亡和細胞死亡。細胞自噬的調(diào)節(jié)有望成為AKI治療的重要干預(yù)靶點。

5 小 結(jié)

缺血再灌注AKI的機制包括經(jīng)典的腎臟微血管改變以及由腎血管內(nèi)皮細胞、腎小管上皮細胞和白細胞(如中性粒細胞、巨噬細胞和樹突狀細胞)介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)。細胞凋亡、壞死等方面機制的研究也為缺血再灌注AKI提供了更新的潛在治療靶點。此外，自噬是AKI新興的研究方向，自噬對IRI后細胞存活和死亡具有重要意義。自噬的保護或損害功能取決于細胞自噬激活的時間和數(shù)量。充分理解缺血再灌注AKI的發(fā)生機制，并針對其病理生理過程進行干預(yù)，可以為AKI的臨床預(yù)防和治療提供幫助，進而降低AKI患者的腎臟損傷，提高生存率。