牛種布魯氏菌病疫苗的研究進(jìn)展

李亞杰

河南省周口市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，河南周口466000

1 布魯氏菌病概述

布魯氏菌是一種革蘭氏陰性兼性細(xì)胞內(nèi)寄生菌。布魯氏菌?。ú疾。┦怯刹剪斒暇鹋?、羊、豬、鹿、犬等哺乳動(dòng)物和人類共患的一種動(dòng)物源性傳染病，我國(guó)將其列為二類動(dòng)物疫病。布病的傳播主要通過(guò)與血液、被感染宿主動(dòng)物的糞便、尿液和胎盤的密切接觸，或通過(guò)吸入被污染的灰塵或氣溶膠。布病的典型癥狀是懷孕母畜流產(chǎn)，乳腺炎也是常見(jiàn)癥狀之一；公畜往往發(fā)生睪丸炎、附睪炎或關(guān)節(jié)炎；而人類感染布病多表現(xiàn)為持續(xù)性感染、波浪熱、多汗和關(guān)節(jié)痛等，而且可能復(fù)發(fā)或留下后遺癥。在地方病流行地區(qū)，接種疫苗是控制和消滅布魯氏菌病最經(jīng)濟(jì)和最關(guān)鍵的方法，也能最大程度地降低人感染的風(fēng)險(xiǎn)。

2 牛種布魯氏菌疫苗概述

2.1 經(jīng)典的弱毒活疫苗

S19 疫苗是在家畜中使用最廣泛的流產(chǎn)布魯氏菌疫苗，又稱作A19 疫苗。S19 菌株是強(qiáng)毒株在室溫培養(yǎng)1年意外分離得到的光滑型突變菌株，其中有一段720 bp 序列缺失，導(dǎo)致赤蘚糖醇分解代謝基因被破壞，與原代菌株相比，其毒力較低[1]。S19 疫苗接種可誘導(dǎo)相對(duì)較高的免疫原性，保護(hù)期較長(zhǎng)，幾乎可達(dá)到對(duì)整個(gè)生產(chǎn)期的保護(hù)。小鼠動(dòng)物模型研究顯示，可產(chǎn)生較高水平的IFN-γ、CD4+和CD8+[2]。然而，S19 疫苗也有一定的副作用：干擾布魯氏菌血清學(xué)診斷試驗(yàn)；導(dǎo)致懷孕母畜流產(chǎn)，降低產(chǎn)奶量；而且對(duì)人類具有一定的致病性。RB51 疫苗菌株是一種耐利福平突變體，最初通過(guò)牛種布魯氏菌2308 在含青霉素和利福平的培養(yǎng)基多次傳代培養(yǎng)分離篩選得到的粗糙型菌株。研究表明，編碼O 側(cè)鏈合成必需的糖基轉(zhuǎn)移酶wboA基因在2308 菌株通過(guò)連續(xù)傳代培養(yǎng)后缺失[3]。RB51 疫苗菌株較為穩(wěn)定，無(wú)殘余毒力和毒力返祖的可能性，不干擾血清診斷試驗(yàn)，可預(yù)防流產(chǎn)；若使用全劑量仍會(huì)導(dǎo)致懷孕母牛的流產(chǎn)，而且保護(hù)率低。此外，盡管RB51 疫苗的減毒程度更高，但它對(duì)人類依然具有傳染性，而且，它具有利福平抗性，不利于人類布魯氏菌病的治療。

2.2 亞單位疫苗

目前用于布魯氏菌亞單位疫苗進(jìn)行研究，包括重組肽、蛋白質(zhì)、DNA、脂多糖（lps）和外膜囊泡（omvs）。與傳統(tǒng)的弱毒活疫苗相比，亞單位疫苗安全性高、無(wú)殘留毒力，可用于人類和懷孕動(dòng)物。但保護(hù)率較低，需要高效免疫佐劑加強(qiáng)免疫效果。T 細(xì)胞抗原誘導(dǎo)分化的Th1 反應(yīng)是主要的免疫應(yīng)答，可增強(qiáng)亞單位疫苗的保護(hù)作用。其中，作為蛋白質(zhì)亞單位疫苗的OMp16、OMp19，脂質(zhì)體蛋白L7/L12、OMp25、p39 和AsnC，促進(jìn)Th1 型免疫應(yīng)答，和S19疫苗保護(hù)水平相當(dāng)。相反，二氫硫辛酰胺琥珀酰轉(zhuǎn)移酶（rE2o）和半胱氨酸合酶A（rCysK）亞單位疫苗引發(fā)Th2 型免疫應(yīng)答，保護(hù)力相對(duì)較低。SurA 和DnaK（熱休克蛋白70 家族）作為蛋白質(zhì)亞單位疫苗，與經(jīng)典活疫苗S19 相比，保護(hù)力較低。將重組蛋白混合物（rOMP19+rp39）接種小鼠可誘導(dǎo)Th1 介導(dǎo)的同型抗體和細(xì)胞免疫應(yīng)答，對(duì)牛種布魯氏菌544菌株產(chǎn)生保護(hù)力。OMp19 和p39 結(jié)構(gòu)域組成的嵌合亞單位蛋白疫苗接種小鼠模型后，產(chǎn)生與Th1 型免疫反應(yīng)相關(guān)的IgG 2a 和細(xì)胞因子，并誘導(dǎo)二次免疫應(yīng)答。OMP25-BLS 融合蛋白和熱休克蛋白60 ku，以殼聚糖納米粒為載體制備的亞單位疫苗，對(duì)其免疫效果進(jìn)行了評(píng)價(jià)，發(fā)現(xiàn)二者結(jié)合使用誘導(dǎo)的細(xì)胞免疫應(yīng)答高于單獨(dú)使用時(shí)。布魯氏菌保守重組蛋白OMP25c 與弗氏佐劑混合可誘導(dǎo)Th1 和Th2 型免疫應(yīng)答，與S19 保護(hù)水平相當(dāng)。其他的重組蛋白如：AspC、Dps、lnpB 和Ndk 作為亞單位疫苗，可誘導(dǎo)產(chǎn)生高水平的IgG2a，與RB51 的保護(hù)效果相當(dāng)。以DNA 為基礎(chǔ)的另一種亞單位疫苗能在多次免疫后誘導(dǎo)體液和細(xì)胞免疫反應(yīng)。牛種布魯氏菌基因組島3（GI-3）區(qū)域編碼的幾個(gè)開(kāi)放閱讀框（ORF），其表達(dá)的抗原對(duì)細(xì)胞內(nèi)生存和機(jī)體的發(fā)病機(jī)制起重要作用。因此，基于GI-3 區(qū)域設(shè)計(jì)的布魯氏菌DNA 疫苗可能是一種有效的候選疫苗。編碼GI-3 區(qū)域的BAB1-0263 或BAB1-0278 基因的DNA 疫苗，可刺激體液和細(xì)胞免疫，并產(chǎn)生高水平的IFN-γ。此外，表達(dá)BAB1-0278 基因的DNA 疫苗可以對(duì)感染2308 菌株產(chǎn)生保護(hù)力。評(píng)價(jià)GI-3 區(qū)域含ABC 型轉(zhuǎn)運(yùn)體（pV278a）的DNA 疫苗發(fā)現(xiàn)，可顯著增強(qiáng)Th1免疫應(yīng)答，并產(chǎn)生高水平的IgG2a。Gomez 等人構(gòu)建的含BAB1-0273 和/或BAB1-0278 和SOD C基因的多價(jià)融合DNA 疫苗，可產(chǎn)生細(xì)胞免疫和體液免疫，IFN-γ、抗體和Th1 型反應(yīng)，然而保護(hù)力低。編碼SOD-Cu/Zn 和IL-2 融合蛋白的DNA 疫苗，可誘導(dǎo)產(chǎn)生IgG2a 和TNF-α，與RB51 疫苗相比，可對(duì)2308 菌株產(chǎn)生有效保護(hù)[4]。

2.3 基因工程弱毒活疫苗

利用分子生物學(xué)技術(shù)敲除牛種布魯氏菌毒力基因，可導(dǎo)致明顯的衰減，正在開(kāi)發(fā)的研究包括：嘌呤生物合成途徑基因，鐵螯合酶hem H 突變體，脂質(zhì)A 脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)基因，磷酸甘油酸激酶編碼基因，IV 型分泌virB基因和LPS 生物合成途徑基因。這些突變體的保護(hù)水平與經(jīng)典減毒活疫苗相似。Ugalde 等人通過(guò)缺失2308 菌株的磷酸葡萄糖變位酶（pgm）基因，研制了一種無(wú)血清診斷干擾的重組菌株，將光滑型改變成粗糙型，且Th1 免疫應(yīng)答和S19 相當(dāng)。將RB51 菌株cyd C cyd D 和cyd C pur D 基因進(jìn)行單、雙基因缺失的疫苗，與RB51菌株相比，單劑量接種對(duì)小鼠的保護(hù)力較低，加大劑量即可誘導(dǎo)體液和細(xì)胞免疫反應(yīng)，還可產(chǎn)生更高水平的保護(hù)力，對(duì)牛的免疫評(píng)價(jià)還需進(jìn)一步驗(yàn)證。牛種布魯氏菌野外分離株（BA15）中也進(jìn)行相同的雙重缺失，可提供相同的保護(hù)效果，但不需要加大劑量進(jìn)行疫苗接種。缺失外膜融合蛋白OMP19基因的靶向突變體在小鼠模型中保護(hù)期較短，但疫苗評(píng)價(jià)顯示和S19 和RB51 的保護(hù)水平相當(dāng)。甲酰基轉(zhuǎn)移酶（wbk C）基因（參與脂多糖生物合成的關(guān)鍵基因），缺失后形成了粗糙型突變體，與光滑的S19菌株相比，衰減更大，對(duì)小鼠的保護(hù)性免疫力更低。糖基轉(zhuǎn)移酶wad C基因的缺失產(chǎn)生的突變體，不能有效逃避宿主免疫的檢測(cè)，免疫小鼠后可產(chǎn)生類似于S19 菌株的保護(hù)水平。和S19 相比，布魯氏菌wzm和wzt基因的破壞導(dǎo)致免疫功能下降[4]。

2.4 活載體疫苗

布病活載體疫苗主要是將布魯氏菌保護(hù)性免疫抗原整合到另一種載體病毒或細(xì)菌基因組中，如小腸結(jié)腸炎耶爾森菌編碼細(xì)菌鐵蛋白（BFR）或P39誘導(dǎo)Th1 型免疫應(yīng)答。人蒼白桿菌和乳酸乳球菌表達(dá)SOD 在小鼠模型免疫中產(chǎn)生保護(hù)力。沙門氏菌表達(dá)31kDa、BCSP31、SOD、OMP3b、OMP 19、L7/L12、BLS 和prp A 對(duì)小鼠、豚鼠、山羊可產(chǎn)生堅(jiān)強(qiáng)的保護(hù)力且安全性高。重組牛痘病毒表達(dá)L7/L12、OMP18在小鼠模型中保護(hù)力不顯著。Semliki 森林病毒（SFV）編碼IF3 和Sod C 接種小鼠后保護(hù)力不如RB51。流感病毒表達(dá)L7/L12 和OMP16 作為載體開(kāi)發(fā)的疫苗，與S19 相比，安全性較高，可長(zhǎng)期刺激體液和細(xì)胞免疫，尤其是在懷孕的小母牛身上防止感染；另外，通過(guò)添加OMP19 和SOD 蛋白來(lái)改進(jìn)這種疫苗配方，以蒙脫石凝膠為佐劑，對(duì)綿羊和山羊有良好的保護(hù)作用。表達(dá)p39 和BLS 的腺病毒作為載體在小鼠模型中可引起體液和細(xì)胞免疫。RB51 過(guò)表達(dá)SOD、wboA、L7/L12 作為疫苗研發(fā)，和親本菌株RB51 相比、保護(hù)力顯著提高；RB51 表達(dá)異源抗原大腸桿菌β-半乳糖苷酶和牛分枝桿菌65 ku 熱休克蛋白，小鼠免疫后可誘導(dǎo)產(chǎn)生IgG2a 和IFN-γ[4]。