發(fā)酵法在中藥研究中的應用

李艷鳳，翟夢穎，李雨昕，王蔚佳，劉征

(1.黑龍江中醫(yī)藥大學藥學院，哈爾濱 150040；2.黑龍江中醫(yī)藥大學附屬第一醫(yī)院神經內科，哈爾濱 150040)

發(fā)酵法是中藥炮制的傳統(tǒng)方法，其具有節(jié)約藥料、減毒增效的作用。雖然中藥經發(fā)酵炮制，改變了以往的煎煮、蒸浸、煉制等常用工序，但藥物療效明顯增強。如中藥淡豆豉，是由桑葉或麻黃等發(fā)酵后制得，而采取不同的培養(yǎng)基，經過相同的微生物處理之后，藥物的藥性會發(fā)生明顯變化，所以利用這一特性，可制得不同適應證的中藥[1]。發(fā)酵炮制中藥的方法早在我國漢代最早的中藥學著作——《神農本草經》中就有記載，之后的史料，如《本草綱目》《本草蒙筌》《藥性論》及《韓氏醫(yī)通》中也能找到相關依據。現(xiàn)代中藥發(fā)酵技術是在傳統(tǒng)發(fā)酵技術上進一步創(chuàng)新發(fā)展，將中藥發(fā)酵與生物工程學、微生態(tài)學等現(xiàn)代生物技術結合，對藥材進行處理，前景廣泛。為進一步發(fā)掘發(fā)酵法在中醫(yī)藥事業(yè)中的新用途、新發(fā)展，現(xiàn)就發(fā)酵的歷史沿革、發(fā)酵方式、目前通過發(fā)酵炮制的主要中藥品種、發(fā)酵炮制對藥材的作用及應用前景等予以綜述，旨在闡述發(fā)酵應與現(xiàn)代技術相結合，從而建立以藥效學為最終評價標準的質量評價體系，為中藥發(fā)酵炮制的研究提供參考和新思路，同時傳承、發(fā)展、創(chuàng)新中醫(yī)藥事業(yè)，豐富世界醫(yī)學事業(yè)。

1 發(fā)酵的歷史沿革及現(xiàn)狀

在微生物學中，發(fā)酵是指微生物細胞將有機物氧化釋放的電子直接交給底物本身未完全氧化的某種中間產物，同時釋放能量并產生各種不同的代謝產物[2]。但在工業(yè)、食品及其他產業(yè)生產中，“發(fā)酵”是一切以微生物為依托進行各類生產的統(tǒng)稱。根據史料記載及推測，早在8 000年以前，我國就已經出現(xiàn)了曲蘗釀酒；4 000多年前，釀酒已變得十分普遍；2 500年前，勤勞的古代人民發(fā)明了釀醬、醋，并用曲這一特殊的中藥劑型治療消化道疾病。先秦時期，《莊子·知北游》中記載發(fā)酵為“其所美者為神奇，其所惡者為臭腐。臭腐復化為神奇，神奇復化為臭腐”[3]。可見，那時人們已認識到在發(fā)酵的過程中發(fā)生了物質轉化。東漢時期，“醫(yī)圣”張仲景所著《傷寒論》中載有“梔子豉湯方”“梔子甘草豉湯”“梔子生姜豉湯”等含有豆豉的方劑，可知豆豉在方劑配伍中具有一定的效用；北魏時期，農學家賈思勰所著《齊民要術》里詳細記載了制曲、釀酒、制醬和釀醋等工藝；到了宋代，發(fā)酵廣泛用于中藥炮制，出現(xiàn)了“半夏合生姜制曲法”，《太平惠民和劑局方》針對其中記載的相關方劑，描述了具體的操作方法。此外，醫(yī)之始祖——《黃帝內經》對發(fā)酵也有些許記載，其中就有將藥酒稱為“醪醴”的說法。

在中藥炮制中，中藥發(fā)酵法是指經凈制或處理后的藥物，在一定的溫度和濕度條件下，由于真菌和酶的催化分解作用，使藥物發(fā)泡、生衣的方法[4]。炮制前后藥材性能、治療作用均大為改變。但是因發(fā)酵過程中會產生微生物，且其種類眾多、數(shù)量巨大，目前的檢測方法難以辨清，故2015版《中國藥典》收載的經發(fā)酵方法炮制的中藥材僅有淡豆豉一種。

2 發(fā)酵方式

隨著各類技術的蓬勃發(fā)展，中藥發(fā)酵法與微生態(tài)學及現(xiàn)代生物工程的結合，形成了中藥發(fā)酵制藥技術。與傳統(tǒng)中藥發(fā)酵相比，在微生物生長代謝過程中發(fā)生了益生菌的轉化，出現(xiàn)一些突破性的變化，如在加工過程中，大分子材料經逆轉錄形成小分子，從而使有效成分進入人體后吸收完全，藥效充分發(fā)揮；在新技術中，多層次、多菌種共同發(fā)酵，藥材療效提高；微生物發(fā)酵狀態(tài)下，中藥中某些有毒物質被分解，毒副作用明顯降低；在性味方面，由于發(fā)酵過程能夠改變或遮蔽藥材原有苦味，從而更易為人們所接受，所以利用發(fā)酵法處理中藥日益受到學者重視[5]。將現(xiàn)代生物技術應用于中藥發(fā)酵，成為中藥研究的重要方法，Lv等[6]通過巢式聚合酶鏈反應-變性梯度凝膠電泳研究與紅曲糯米酒發(fā)酵起始物(紅曲和姚曲)相關真菌和細菌的微生物組成發(fā)現(xiàn)，真菌與細菌對紅曲糯米酒的發(fā)酵過程具有重大作用，并在一定程度上指導了大規(guī)模生產。

2.1固體發(fā)酵 固體發(fā)酵是指在沒有自由水或自由水含量極低的條件下，以一定濕度農副產品為營養(yǎng)基質，以一種或多種真菌為菌種發(fā)酵，該發(fā)酵方法是從制曲工藝發(fā)展而來，后經改進優(yōu)化形成。如半夏曲、六神曲、沉香曲等，其發(fā)酵過程操作簡單，溫度、濕度、酸堿度、氧含量等環(huán)境條件易于控制，不易感染雜菌，因此藥效能得到充分的發(fā)揮。遲曉麗等[7]研究發(fā)現(xiàn)，中藥固體發(fā)酵的關鍵在于優(yōu)勢菌種的選育，產率高、轉化率高、毒性低的菌種是理想選擇標準。劉學湘等[8]利用白僵菌固體發(fā)酵處理馬錢子，采用急性毒性實驗法和醋酸引起小鼠扭體法、熱板法等實驗方法，探究馬錢子的急性毒性及陣痛活性，結果證實發(fā)酵后藥材的毒性作用減弱而鎮(zhèn)痛活性明顯增強。

2.2液體發(fā)酵 液體發(fā)酵是一種現(xiàn)代發(fā)酵技術，依托抗生素生產工藝，將生長情況良好的菌絲接種到含有一定比例中藥材培養(yǎng)基中，然后將培養(yǎng)基置于適宜環(huán)境條件下進行發(fā)酵。該種發(fā)酵方法相較固體發(fā)酵法有所突破，因而應用更為廣泛。但由于大多數(shù)中藥容易在發(fā)酵過程中被污染，所以其對工藝設備的要求較為嚴格。楊瑾等[9]以高胰島素抵抗人肝癌HepG2細胞作為受試對象，探究不同濃度茯苓胞外多糖對葡萄糖的抑制程度發(fā)現(xiàn)，經液體發(fā)酵后的茯苓胞外多糖降低血糖作用明顯優(yōu)于其他濃度或未經發(fā)酵處理的胞外多糖。此外，液態(tài)深層發(fā)酵還廣泛用于紅曲的生產菌種研究與大規(guī)模生產[10]。

2.3雙向性固體發(fā)酵 雙向性固體發(fā)酵于20世紀80年代由南京中醫(yī)藥大學莊毅教授首次使用，此技術依托固體發(fā)酵，與其不同的是將菌種生長的營養(yǎng)基質變?yōu)橹兴幉幕蛩幵?，使得中藥材在為真菌提供營養(yǎng)物質的同時，自身的結構成分也被真菌的代謝產物或細胞因子影響，從而使藥材出現(xiàn)與原來不一樣的功能性味，由此具有雙向性[11]。朱舟等[12]采用固體發(fā)酵方式，以中藥天南星為底物，在適宜的白僵菌接種量、溫度和時間下，以含水量適宜的天南星粗粉-鮮豆渣-米粉作為培養(yǎng)基，發(fā)現(xiàn)在一定參數(shù)下得到的天南星炮制品與其他方法相比，毒性降低但抗驚厥作用升高。因此，白僵菌在固體發(fā)酵技術下對天南星具有減毒增效的作用。

3 發(fā)酵炮制的主要中藥品種

據《本草綱目》《本草蒙筌》《藥性論》及《韓氏醫(yī)通》等史料記載，采取發(fā)酵炮制制成的中藥主要分為兩大類：①中藥自身經過一定條件發(fā)酵，如淡豆豉、百藥煎等。②藥物通過與一定介質混合產生微生物進行發(fā)酵，如六神曲、半夏曲、沉香曲等?，F(xiàn)分別介紹如下。

淡豆豉，收載于《本草匯言》，由青蒿、大豆、桑葉三者自然發(fā)酵得到。味苦、辛，性涼；歸肺、胃經；具有解表、除煩、宣發(fā)郁熱的功效，主要用于感冒、寒熱頭痛、煩躁胸悶、虛煩不眠[13]。郭文勇[14]研究發(fā)現(xiàn)，淡豆豉中的主要生物活性成分為大豆異黃酮，該成分在預防及抵抗癌細胞方面具有一定作用。在中藥發(fā)酵炮制的基礎上，有學者采用單菌種和雙菌種發(fā)酵淡豆豉，以不同發(fā)酵階段產物的纖溶酶活性為測定指標探究最佳條件，結果發(fā)現(xiàn)以單一的枯草芽孢桿菌進行發(fā)酵的產物優(yōu)于其他菌種，這為淡豆豉的大規(guī)模制備提供一定的理論支持[15-16]。

百藥煎，出自《本草蒙筌》，是由五倍子與茶葉發(fā)酵而成的灰褐色塊狀物。《本草綱目》載：“其體輕虛，其性浮收，且味帶余甘，治上焦心肺，咳嗽痰飲，熱渴諸病，含噙尤為相宜”[17]。有學者發(fā)現(xiàn)，五倍子的有效成分鞣質在體內易與蛋白質發(fā)生沉淀反應，患者使用后會產生不良反應，而經發(fā)酵制成百藥煎后，其有效成分刺激性減小、收斂性增強，且能在一定程度上減少甚至使不良反應消失。

六神曲，又稱神曲，載自《齊民要術》?，F(xiàn)在常用的工藝是將切碎的鮮辣蓼、鮮蒼耳子、鮮青蒿與研末后的赤小豆、杏仁與麥麩和白面和勻，經自然發(fā)酵制成的曲劑，具有健脾和胃、消食和中的功效。傳統(tǒng)神曲發(fā)酵為自然發(fā)酵，即雜菌發(fā)酵的方式，可控性較差，發(fā)酵產物質量優(yōu)劣不一。程亦雄[18]通過水解圈法篩選優(yōu)勢菌種，得到產蛋白酶及淀粉酶活性較高的賽氏曲霉，以正交試驗的方法優(yōu)化六神曲深層發(fā)酵工藝。

半夏曲，出自《太平惠民和劑局方》，是將半夏洗后、姜汁碾搗作曲自然發(fā)酵而成。其主治風寒咳嗽、喘息氣急，消食積，治泄瀉。因半夏中含有的草酸鈣針晶具有刺激性，故臨床常應用其炮制品，但對半夏發(fā)酵制曲后的毒性變化研究較少。孫佳彬等[19]通過一系列實驗得出經發(fā)酵制成曲后的半夏毒性減弱的結論，為半夏經發(fā)酵制成半夏曲可在一定程度上降低藥材毒性提供了理論基礎。

沉香曲，收于《飲片新參》。沉香曲是由沉香、木香、檀香、砂仁、蔻仁、神曲等20多種藥材研成粉再加面粉，攪和壓制而成。其功能為理脾胃氣，止痛瀉，消脹滿。主治肝胃不和，胸悶脘脹，嘔吐吞酸[20]。在臨床應用方面，沉香曲重氣滯諸癥，與多用于濕痰的半夏曲，主健脾胃、助消化的神曲有所不同[21]。

4 發(fā)酵在中藥炮制中的作用

4.1增強藥物療效 中藥發(fā)酵炮制通過微生物與中藥共同發(fā)酵，在此過程中微生物經發(fā)酵產生的次級代謝產物和藥物成分相互協(xié)同、增強藥效，其原因為次級代謝產物與藥物發(fā)生作用的同時拓寬了代謝途徑，甚至會產生明顯不同的有效成分[22-23]。王貞佐等[24]將焦三仙、黃芪、當歸、海馬、柴胡制成的提取液作為培養(yǎng)基，探究該中藥提取液對冬蟲夏草的生長及其菌絲體中有效成分含量影響的研究顯示，中藥提取液對冬蟲夏草菌絲體的生長刺激作用明顯，且冬蟲夏草中甘露醇成分的含量顯著提高，此外提取液中含有的多糖也發(fā)生量的變化。胡昌江等[25]分別以小鼠、大鼠作為實驗對象，通過對小鼠的氨水引咳、酚紅祛痰、二甲苯耳郭腫脹實驗和大鼠的皮下塑料環(huán)肉芽腫增生等實驗，并結合體外抗菌實驗比較改良百藥煎在發(fā)酵前后的鎮(zhèn)咳、祛痰及抗炎作用證明，與發(fā)酵前相比，發(fā)酵后的改良百藥煎鎮(zhèn)咳、祛痰、抗炎及抗菌作用明顯增強。李世杰等[26]利用黑曲發(fā)酵茯苓多糖進行研究顯示，經發(fā)酵的茯苓多糖各劑量組的小鼠臟器指數(shù)、溶血素水平、抗體IgG與IgM含量、單核-巨噬細胞吞噬率均顯著提高且能明顯增強環(huán)磷酰胺致免疫低下小鼠的免疫調節(jié)作用。

4.2提高有效成分提取率 中草藥的有效成分大多包裹在其細胞壁內，致密堅硬的細胞壁是阻礙藥物有效成分從細胞內溶出、妨礙體內吸收的屏障。因此，微生物對有效成分的提取發(fā)揮了一定作用。它能針對不同成分構成的壁結構，分泌各種胞外酶，使構成緊密的結構分解，使細胞與細胞間的空隙變大，不僅為細胞內外的物質擴散提供通道，還能提高有效成分的提取率、吸收利用率。賈艷姝[27]以保加利亞乳桿菌為生產菌種發(fā)酵黃芪發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵前后黃芪總皂苷和總黃酮均有不同程度的增加。馮志華等[28]使用地衣芽孢桿菌C2-13(可產生水解酶)發(fā)酵處理紅花發(fā)現(xiàn)，其可在一定程度上增強產物羥基自由基清除能力、對肝氧化物的抑制能力，提高紅細胞溶血抑制率等。徐萌萌等[29]研究發(fā)現(xiàn)，微生物與苷分子間存在一種獨特的作用，糖類可在微生物的參與下代謝，牛蒡子、甘草、梔子、黃芩的苷轉化為苷元，即通過分解不易被人體吸收利用的成分，使有效成分充分釋放并發(fā)揮作用，縮短作用時間的同時提高藥材效用。在治療急性耳郭炎方面，牛蒡子、甘草等發(fā)酵處理品的藥效較生品顯著增強[29]。

4.3降低藥物毒性 中藥不是完全無害的，有些藥物因其自身所含化學成分的種類多樣，具有一定程度的毒性和刺激性，所以人們在使用時會出現(xiàn)一些副作用。有些藥材經發(fā)酵處理后，其毒性或刺激性明顯減弱，這是由于在微生物的作用下，毒性成分的結構發(fā)生改變，變成低毒甚至無毒的物質。吳曉峰[30]通過小鼠口服急性毒性實驗、小鼠耳殼腫脹實驗、兔紅細胞溶血實驗發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵后的巴豆不僅毒性降低且效用增強，其中靈芝和白僵菌發(fā)酵得到的靈巴菌質和白巴菌質部分減毒作用明顯優(yōu)于傳統(tǒng)的發(fā)酵產物巴豆霜。朱舟等[12]將白僵菌與天南星采用雙向發(fā)酵技術進行處理得到毒性較小、抗驚厥力較高的產物，達到減毒增效的目的。另有研究發(fā)現(xiàn)，經發(fā)酵處理后的大黃，其瀉下作用的有效成分結合型蒽醌的含量明顯下降[31]。

4.4改變活性成分 發(fā)酵對藥材活性成分的影響體現(xiàn)在新成分的產生及原有成分的轉化。發(fā)酵過程表現(xiàn)為在酶的作用下，微生物代謝過程中的大分子成分被分解、轉化，進而在一定條件下合成新化合物，產生效用更強的有效成分。董玫等[32]通過實驗發(fā)現(xiàn)，將滋陰補腎經典方劑六味地黃丸進行發(fā)酵，所得到的發(fā)酵液能抑制小鼠肝癌H22生長，而將其進行煎煮后得到的液體不具有該作用。李國紅等[33]將三七的須根粉碎，接種枯草芽孢桿菌進行固體發(fā)酵，并使用相應的儀器技術對發(fā)酵所得物中的皂苷成分進行分離，結果發(fā)現(xiàn)在三七及其原料藥中均沒有發(fā)現(xiàn)新成分——人參皂苷Rh4，證明在發(fā)酵的過程中活性成分發(fā)生變化。

此外，在人體內不可直接被利用的有效成分，可在體外通過發(fā)酵進行轉化，轉化后的有效成分可直接被機體利用。

5 小 結

中藥是我國的寶貴財富，但隨著工業(yè)化的日益發(fā)展及不合理的開發(fā)利用，藥用植物資源逐漸匱乏，野生中藥材瀕危，因此提高藥用資源利用率是開發(fā)利用中藥的有效途徑之一。而作為中藥炮制領域研究熱點之一的發(fā)酵法，具有改變藥物性質、提高療效、減少毒副作用等優(yōu)點，為我國豐富藥用資源的進一步研究、開發(fā)，乃至中醫(yī)藥事業(yè)的發(fā)展拓寬了研究范圍。但由于中藥成分復雜，作用機制闡釋受限，且不同藥物配伍后對有效成分產生微妙影響。同時傳統(tǒng)方法發(fā)酵過程中易引入有害菌群，結果可控性不強，易出現(xiàn)安全事故。未來，應將現(xiàn)代發(fā)酵技術應用于中藥制劑的研究開發(fā)，以推進中藥現(xiàn)代化。