程序性壞死的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制及其在創(chuàng)傷性顱腦損傷中的研究進(jìn)展

馬強(qiáng)，韓瑞璋，靳華，張廣輝

(陸軍第七十二集團(tuán)軍醫(yī)院神經(jīng)外科，浙江 湖州 313000)

1859年Virchow[1]第一次提出壞死的概念,并將其定義為快速、偶發(fā)且無(wú)控制的細(xì)胞死亡，其特征為細(xì)胞腫脹和細(xì)胞膜破裂導(dǎo)致的炎癥反應(yīng)。1972年，細(xì)胞凋亡成為第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)和研究的程序性死亡方式，此后凋亡和不受調(diào)控的壞死被認(rèn)為是細(xì)胞死亡的兩種主要形式[2]。然而，壞死的不可調(diào)控性受到眾多科學(xué)家的質(zhì)疑。Fukuda等[3]通過(guò)研究缺血缺氧受損的海馬神經(jīng)元細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)了一種既非凋亡也非壞死并受某些信號(hào)調(diào)節(jié)的新型死亡方式。Degterev等[4]將這種受信號(hào)調(diào)節(jié)的新型死亡方式稱(chēng)為程序性壞死。同時(shí)，Teng等[5]發(fā)現(xiàn)了一種能夠特異性阻斷由死亡受體信號(hào)通路引起的胱天蛋白酶(caspase)非依賴(lài)性細(xì)胞死亡，并將能被Nec-1(Necrostatin-1)特異性抑制的細(xì)胞死亡方式稱(chēng)為程序性壞死。細(xì)胞死亡命名委員會(huì)根據(jù)細(xì)胞死亡的形態(tài)學(xué)特征將細(xì)胞死亡分為凋亡、自噬和程序性壞死[6]。近年來(lái)，有效抑制程序性壞死在創(chuàng)傷性顱腦損傷患者救治中的作用成為研究熱點(diǎn)，且Nec-1在顱腦損傷治療中的有效性已得到大量動(dòng)物研究證實(shí)?，F(xiàn)就程序性壞死的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制及其在創(chuàng)傷性顱腦損傷中的研究進(jìn)展予以綜述。

1 程序性死亡方式的區(qū)別與聯(lián)系

凋亡是受基因嚴(yán)格控制的生理性細(xì)胞死亡過(guò)程，包括外源性和內(nèi)源性兩種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，均需要caspase的參與。凋亡細(xì)胞具有特定的形態(tài)學(xué)變化，如細(xì)胞皺縮變小，與周?chē)?xì)胞分離，染色質(zhì)聚集、核固縮、碎裂、凋亡小體的形成，但無(wú)細(xì)胞膜的破裂和細(xì)胞內(nèi)容物的外溢，所以不會(huì)引起炎癥反應(yīng)，其在維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定中起重要作用[7]。凋亡早期發(fā)生細(xì)胞膜骨架的降解，而細(xì)胞器的降解發(fā)生在凋亡后期。凋亡的激活需要caspase，也可被caspase抑制劑(凋亡抑制蛋白、細(xì)胞因子效應(yīng)調(diào)節(jié)劑等)抑制[8]。自噬的特點(diǎn)為自噬體的形成，其是無(wú)核糖體區(qū)域的粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)脫落，形成雙膜結(jié)構(gòu)包裹的細(xì)胞器和細(xì)胞質(zhì)大分子，隨后與溶酶體融合形成自噬溶酶體，是實(shí)現(xiàn)細(xì)胞代謝及更新胞內(nèi)細(xì)胞器的過(guò)程[9]。自噬缺乏染色質(zhì)凝集，細(xì)胞質(zhì)中有大量的自噬空泡形成。細(xì)胞器的破壞發(fā)生在自噬的早期階段，細(xì)胞膜骨架的破壞發(fā)生在自噬晚期。自噬的作用主要為降解細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)和異常的細(xì)胞成分，最終也可導(dǎo)致細(xì)胞死亡。程序性壞死是由受體相互作用蛋白(receptor interacting protein，RIP)調(diào)節(jié)的一種非caspase依賴(lài)性死亡方式，RIP1和RIP3的磷酸化及壞死復(fù)合體的形成是程序性壞死的重要標(biāo)志[10-11]。程序性壞死的機(jī)制及細(xì)胞形態(tài)的改變不同于凋亡，但具有壞死經(jīng)典的形態(tài)學(xué)特征：細(xì)胞腫脹變圓，細(xì)胞器腫大，隨后線粒體裂解、溶酶體及細(xì)胞膜破裂導(dǎo)致細(xì)胞死亡，胞內(nèi)物質(zhì)釋放形成顯著的炎癥反應(yīng)[12]。

有研究表明，細(xì)胞凋亡和壞死是細(xì)胞死亡的兩種主要方式，而自噬既可支持細(xì)胞生存也可促進(jìn)細(xì)胞死亡[13]。雖然細(xì)胞凋亡、自噬及程序性壞死均有各自獨(dú)特的信號(hào)通路和形態(tài)學(xué)差異，但在某些情況下，3種程序性死亡方式之間存在相互轉(zhuǎn)化。如某些情況下抑制凋亡可引起自噬，當(dāng)caspase缺乏時(shí)又可引起細(xì)胞發(fā)生程序性壞死，而Nec-1可以使細(xì)胞發(fā)生凋亡。其中，自噬可通過(guò)減少內(nèi)源性凋亡抑制物或通過(guò)選擇性減少促凋亡蛋白來(lái)促進(jìn)或抑制細(xì)胞發(fā)生凋亡。自噬與凋亡既可相互促進(jìn)，又可相互拮抗，主要取決于細(xì)胞所處的具體環(huán)境，如在腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor，TNF)-α及氧化等的刺激下，細(xì)胞可通過(guò)線粒體釋放凋亡誘導(dǎo)因子(細(xì)胞色素C及氧自由基等)誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡[14]。然而，凋亡細(xì)胞中受損傷的線粒體也可通過(guò)細(xì)胞的自噬途徑被清除，阻止細(xì)胞發(fā)生凋亡，從而對(duì)細(xì)胞起保護(hù)作用[15]。

2 程序性壞死的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制

2.1程序性壞死的啟動(dòng) 有很多因素可引起細(xì)胞發(fā)生程序性壞死，如TNF-α、干擾素、TNF相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體、DNA損傷、脂多糖、外傷、強(qiáng)酸、強(qiáng)堿及過(guò)氧化氫等，還包括某些細(xì)菌、病毒感染和射線等[16]。程序性壞死的啟動(dòng)主要由一系列受體及其配體相連接而誘導(dǎo)激活，不同的細(xì)胞會(huì)根據(jù)自身所處的微環(huán)境及損傷的方式或損傷的程度選擇凋亡途徑或程序性壞死途徑。誘發(fā)細(xì)胞發(fā)生程序性壞死的受體主要有兩類(lèi)：死亡受體和病原識(shí)別受體。其中，病原識(shí)別受體主要由一些固有免疫細(xì)胞表達(dá)，包括固有免疫病原模式識(shí)別受體及核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體等，主要參與某些細(xì)菌或病毒入侵而發(fā)生的免疫應(yīng)答反應(yīng)。而常見(jiàn)的死亡受體包括補(bǔ)體59、腫瘤壞死因子受體(tumor necrosis factor receptor，TNFR)1和TNFR2及TNF相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體受體等。死亡受體與病原識(shí)別受體均包含死亡結(jié)構(gòu)域蛋白，其可與相應(yīng)配體結(jié)合誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生程序性壞死[17]。關(guān)于程序性壞死的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制，目前研究最深入的為T(mén)NF-α-TNFR1途徑。

2.2壞死復(fù)合體的形成 在外界信號(hào)刺激下，TNFR1 被激活，TNF-α與細(xì)胞膜上TNFR1的死亡受體結(jié)合，促使TNFR1在胞質(zhì)內(nèi)形成同源多聚體，并發(fā)生構(gòu)象改變，TNFR1可通過(guò)胞內(nèi)段的死亡結(jié)構(gòu)域與TNF死亡受體相關(guān)結(jié)構(gòu)域蛋白結(jié)合，RIP1通過(guò) C端的死亡決定簇與活化的TNFR1死亡受體結(jié)構(gòu)域結(jié)合形成蛋白復(fù)合體，稱(chēng)復(fù)合體Ⅰ，為募集下游一系列的效應(yīng)蛋白和相關(guān)酶的激活提供了良好條件[18]。隨后細(xì)胞將復(fù)合體Ⅰ內(nèi)吞，TNF-α從復(fù)合體Ⅰ中解離，同時(shí)復(fù)合體Ⅰ離開(kāi)細(xì)胞膜進(jìn)入胞質(zhì)，死亡受體相關(guān)死亡結(jié)構(gòu)域蛋白通過(guò)招募caspase-8并與之結(jié)合形成復(fù)合體Ⅱa[19]。復(fù)合體Ⅱa形成后，細(xì)胞會(huì)根據(jù)自身所處的微環(huán)境及損傷程度等選擇凋亡途徑或程序性壞死途徑。若caspase-8被激活，其可與死亡受體相關(guān)死亡結(jié)構(gòu)域蛋白形成同源二聚體，并通過(guò)相互切割而活化，進(jìn)一步激活下游的caspase-3、caspase-6及caspase-7等，此時(shí)復(fù)合體Ⅰ被裂解，促進(jìn)細(xì)胞發(fā)生凋亡；若caspase-8的活性因一系列理化因素被抑制，細(xì)胞會(huì)發(fā)生程序性壞死，此時(shí)RIP1發(fā)生去泛素化，RIP3被募集并與RIP1通過(guò)各自的同型相互作用模體結(jié)合形成復(fù)合體Ⅱb，成為壞死復(fù)合體中的核心部分，并啟動(dòng)程序性壞死下游的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。

其中，RIPs是一種具有絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶活性的蛋白質(zhì)，RIP1和RIP3可通過(guò)N端保守的激酶結(jié)構(gòu)域相互磷酸化，使復(fù)合體Ⅱb形成壞死復(fù)合體，同時(shí)進(jìn)一步激活RIP3并在其199號(hào)絲氨酸處發(fā)生自身磷酸化，大量活化的RIP3通過(guò)一系列信號(hào)通路的傳遞，加速細(xì)胞程序性壞死的發(fā)生[20]。有研究顯示，在RIP3基因敲除小鼠的胚胎成纖維細(xì)胞中，RIP1可以正常表達(dá)，細(xì)胞會(huì)發(fā)生凋亡，但不會(huì)發(fā)生程序性壞死[21]；而在有RIP3存在的情況下，細(xì)胞發(fā)生TNF-α所誘導(dǎo)的程序性壞死，說(shuō)明RIP1是啟動(dòng)細(xì)胞發(fā)生程序性壞死上游的關(guān)鍵激酶[22]?？梢?jiàn)，RIP3是TNF-α誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生程序性壞死所必需，同時(shí)也是調(diào)控程序性壞死的特異性蛋白分子。

2.3程序性壞死的執(zhí)行 壞死復(fù)合體形成后，主要通過(guò)3種途徑誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生程序性壞死，這3種途徑既相互獨(dú)立，又相互交錯(cuò)，是一個(gè)復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)[23]。

2.3.1活性氧類(lèi)(reactive oxygen species,ROS)代謝相關(guān)途徑 壞死復(fù)合體通過(guò)中斷親環(huán)素和嘌呤核苷酸移位酶之間的相互作用，上調(diào)糖原磷酸化酶、谷氨酸脫氫酶及谷氨酰胺合成酶等活性，其中糖原磷酸化酶可促進(jìn)糖原分解為葡萄糖-1-磷酸，過(guò)量產(chǎn)生磷酸化葡萄糖，谷氨酸脫氫酶及谷氨酰胺合成酶使α-酮戊二酸大量合成，加速線粒體內(nèi)的三羧酸循環(huán)過(guò)程，使呼吸鏈被過(guò)度激活，產(chǎn)生過(guò)量的ROS(超氧陰離子、羥自由基及過(guò)氧化氫等)并聚集，使細(xì)胞發(fā)生強(qiáng)烈的氧化應(yīng)激反應(yīng)。一方面，ROS可阻斷呼吸鏈，細(xì)胞因能量代謝障礙而死亡；另一方面，ROS可引起細(xì)胞膜脂質(zhì)過(guò)氧化或改變細(xì)胞器膜某些通道蛋白功能，如溶酶體受到ROS的損傷后，溶酶體膜通透性的增加可導(dǎo)致溶酶體酶的大量釋放，誘發(fā)細(xì)胞自我消化而死亡。崔紅旺等[24]利用TNF-α誘導(dǎo)小鼠骨樣細(xì)胞發(fā)生程序性壞死，并通過(guò)熒光酶標(biāo)儀檢測(cè)發(fā)現(xiàn)有大量ROS產(chǎn)生，使用Nec-1后ROS水平明顯降低，發(fā)生程序性壞死的細(xì)胞數(shù)量也相應(yīng)減少，說(shuō)明誘導(dǎo)小鼠骨樣細(xì)胞發(fā)生程序性壞死的可能為ROS。Vanden等[25]研究發(fā)現(xiàn)，在TNF-α存在的條件下，還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶1能明顯促進(jìn)ROS的生成和活化，促使細(xì)胞壞死，但在使用抗氧化劑或敲除細(xì)胞中的還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶1后，TNF-α介導(dǎo)的細(xì)胞壞死顯著減少。但有學(xué)者認(rèn)為，程序性壞死的發(fā)生與ROS并沒(méi)有直接聯(lián)系[26]。有學(xué)者在淋巴瘤細(xì)胞的研究中發(fā)現(xiàn)，即使將細(xì)胞內(nèi)ROS清除也不能阻止程序性壞死的發(fā)生[26]。所以對(duì)于當(dāng)前的研究結(jié)果，ROS在程序性壞死過(guò)程中的作用機(jī)制取決于不同細(xì)胞類(lèi)型和實(shí)驗(yàn)方案。

2.3.2核因子κB(nuclear factor-κB，NF-κB)相關(guān)途徑 NF-κB是一種廣泛存在的轉(zhuǎn)錄因子，其參與多種免疫應(yīng)答。在正常情況下，細(xì)胞質(zhì)中的NF-κB與其抑制劑緊密結(jié)合。RIP3的過(guò)表達(dá)會(huì)誘導(dǎo)NF-κB激活，NF-κB與其抑制劑分離成為游離的NF-κB，游離的NF-κB轉(zhuǎn)入細(xì)胞核內(nèi)誘導(dǎo)促炎細(xì)胞因子表達(dá)，導(dǎo)致大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，促進(jìn)細(xì)胞壞死。另外，大量RIP3的表達(dá)對(duì)NF-κB激活有正反饋?zhàn)饔?，可加速?xì)胞發(fā)生程序性壞死的過(guò)程。Kasof等[27]通過(guò)TNF-α誘導(dǎo)宮頸癌細(xì)胞發(fā)生程序性壞死，發(fā)現(xiàn)RIP3的過(guò)表達(dá)可增強(qiáng)核因子NF-κB基因的表達(dá)，發(fā)生程序性壞死的宮頸癌細(xì)胞明顯增加。

2.3.3MLKL相關(guān)途徑 RIP1與RIP3具有相似的N端激酶結(jié)構(gòu)域及C端同型作用結(jié)構(gòu)域，RIP1/RIP3壞死復(fù)合體形成可導(dǎo)致RIP3的進(jìn)一步聚集與活化，并在其他蛋白的協(xié)助下招募RIP3的底物分子混合系激酶區(qū)域樣蛋白(mixed lineage kinase domain-like protein,MLKL)。MLKL的N端具有激酶結(jié)構(gòu)域，但無(wú)激酶活性，需通過(guò)C端激酶結(jié)構(gòu)域與RIP3相互結(jié)合才可被磷酸化與多聚化，并使其從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到細(xì)胞膜及細(xì)胞器膜，同時(shí)MLKL的N端能插入細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)內(nèi)并與膜上的脂類(lèi)物質(zhì)磷脂酰肌醇磷酸鹽2和5結(jié)合，使細(xì)胞膜產(chǎn)生通透性孔道，破壞細(xì)胞膜的完整性，Na+或Ca2+大量?jī)?nèi)流入細(xì)胞質(zhì)，細(xì)胞內(nèi)的滲透壓過(guò)度升高導(dǎo)致細(xì)胞腫脹，最后死亡[28]。研究表明，抑制細(xì)胞膜脂類(lèi)物質(zhì)磷脂酰肌醇磷酸鹽2和5的形成會(huì)明顯抑制程序性壞死，但對(duì)細(xì)胞凋亡無(wú)影響[29]。MLKL基因敲除小鼠及RIP3基因敲除小鼠均具有相似的抗程序性壞死能力，且磷酸化的MLKL信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)可以被Nec-1阻斷，但不能被MLKL的功能抑制劑(2E)-N-{4-〔[(3-甲氧基-2-吡嗪基)氨基]磺?；潮交鶀-3-(5-硝基-2-噻吩基)-2-丙烯酰胺阻斷，同時(shí)RIP1的信號(hào)表達(dá)不受MLKL抑制劑的影響，故推測(cè)MLKL的作用機(jī)制位于RIP1/RIP3下游，且細(xì)胞是通過(guò)MLKL相關(guān)途徑發(fā)生程序性壞死。

3 程序性壞死的抑制

程序性壞死可被許多抑制物抑制,如RIP1抑制劑、RIP3抑制劑、MLKL抑制劑等[30]。目前認(rèn)為，RIP1抑制劑Nec-1是程序性壞死的特異性抑制劑，其可抑制RIP1激酶活性，將RIP1的活性片段處于失活狀態(tài)，并阻止RIP3被募集及RIP1與RIP3相互磷酸化，從而減少程序性壞死的發(fā)生，這一觀點(diǎn)已在動(dòng)物模型中得到證實(shí)[31]。楊吉平等[32]認(rèn)為，Nec-1可抑制RIP1的磷酸化，明顯減輕小鼠神經(jīng)細(xì)胞的炎癥反應(yīng)。崔紅旺和蔣電明[33]研究發(fā)現(xiàn)，Nec-1可明顯減少小鼠骨細(xì)胞RIP1/RIP3蛋白的表達(dá)，并有效抑制小鼠骨細(xì)胞的程序性壞死。Degterev等[4]研究發(fā)現(xiàn)，Nec-1可顯著降低因缺血缺氧受損的腦神經(jīng)細(xì)胞死亡率，明顯減少神經(jīng)細(xì)胞程序性壞死的發(fā)生。

4 程序性壞死與創(chuàng)傷性腦損傷

目前發(fā)現(xiàn)，創(chuàng)傷性顱腦損傷可導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞死亡，包括凋亡、自噬及程序性壞死[30]。其中，程序性壞死廣泛存在于受傷的神經(jīng)細(xì)胞中。在控制性小鼠皮質(zhì)沖擊損傷實(shí)驗(yàn)中，同時(shí)抑制TNF-α及死亡受體能明顯減少小鼠腦組織的損傷面積，且小鼠在空間記憶實(shí)驗(yàn)中的表現(xiàn)也顯著改善[34]。使用程序性壞死特異性抑制劑Nec-1能明顯減輕創(chuàng)傷后腦組織的損傷，腦組織神經(jīng)細(xì)胞的死亡率明顯降低，說(shuō)明程序性壞死的有效性抑制有助于神經(jīng)細(xì)胞的功能修復(fù)[34]。Su等[15]將Nec-1用于小鼠創(chuàng)傷性顱腦損傷模型發(fā)現(xiàn)，小鼠神經(jīng)細(xì)胞的程序性壞死明顯被抑制，且可顯著減輕腦損傷、減少腦出血量，改善腦細(xì)胞功能，促進(jìn)神經(jīng)功能恢復(fù)。Bermpohl等[35]研究發(fā)現(xiàn)，程序性壞死的有效抑制可明顯減少小鼠創(chuàng)傷后腦損傷的面積，且小鼠的運(yùn)動(dòng)功能及在Morris水迷宮中的生存能力等也有明顯改善。You等[36]研究發(fā)現(xiàn)，使用Nec-1可使小鼠大腦皮質(zhì)損傷區(qū)域的中性粒細(xì)胞明顯減少，同時(shí)對(duì)活化的小膠質(zhì)細(xì)胞程序性壞死具有抑制作用，故認(rèn)為Nec-1具有長(zhǎng)效的抗損傷作用。

此外，Nec-1可有效減少小鼠腦損傷后神經(jīng)細(xì)胞程序性壞死的發(fā)生，但神經(jīng)細(xì)胞也可能發(fā)生凋亡或自噬等其他死亡，說(shuō)明不同死亡方式之間存在著復(fù)雜聯(lián)系，但創(chuàng)傷性顱腦損傷后神經(jīng)細(xì)胞的程序性壞死被有效抑制并不意味著細(xì)胞可以避免死亡[37]。因此，Nec-1聯(lián)合凋亡及自噬等抑制劑在創(chuàng)傷性顱腦損傷后保護(hù)并促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞恢復(fù)中具有重要的臨床價(jià)值。

5 小 結(jié)

程序性壞死的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制復(fù)雜，參與表達(dá)及活化的分子較多，并與凋亡及自噬等其他死亡方式有復(fù)雜聯(lián)系。程序性壞死的信號(hào)通路及各種新型抑制劑的不斷深入研究，在眾多動(dòng)物模型及臨床研究中取得了較大進(jìn)展，但程序性壞死是一種新的細(xì)胞死亡通路，還是其他細(xì)胞死亡方式的分支及是否存在程序性壞死的核心通道等，目前其分子機(jī)制尚不明確。神經(jīng)細(xì)胞屬于不可再生細(xì)胞，雖然在顱腦創(chuàng)傷后的大量神經(jīng)細(xì)胞已無(wú)法避免死亡，但抑制程序性壞死對(duì)于減少顱腦創(chuàng)傷后因腦組織水腫、缺血缺氧及炎癥反應(yīng)等所造成的二次損傷具有重要意義，為創(chuàng)傷性腦損傷的臨床治療提供了新方向。