p62蛋白在原發(fā)性骨腫瘤中作用機制的研究進展

劉姝，李東奇，葉帆，張晶

(昆明醫(yī)科大學第三附屬醫(yī)院骨科，昆明 650118)

骨腫瘤是一種發(fā)生于骨骼或附屬組織的腫瘤，分為良性和惡性兩種類型，惡性骨腫瘤發(fā)展迅速、預后較差、病死率高。惡性骨腫瘤分為原發(fā)性骨腫瘤和繼發(fā)性骨腫瘤，原發(fā)性骨腫瘤是指局部組織長出的惡性骨腫瘤，常見于多發(fā)性骨髓瘤(mutiple myeloma，MM)、骨肉瘤、骨巨細胞瘤。近年來，越來越多的學者將研究重心轉向靶向治療，隨著靶向治療的興起，原發(fā)性骨腫瘤的治療有了突破性進展，但也隨之出現(xiàn)了新的問題，如靶向藥物治療后發(fā)生耐藥[1]。靶向治療的重點在于找到發(fā)揮關鍵作用的細胞及分子靶點。腫瘤的發(fā)生、發(fā)展往往是多種細胞、多個信號分子相互作用的結果。目前急需找到一種治療靶點來預測靶向藥物的治療效果，所以針對p62靶點進行設計的治療策略逐漸增多。p62是細胞內(nèi)的一種多功能接頭蛋白，包含多個功能結構域，與不同蛋白結合后可發(fā)揮不同作用，在細胞各種正常生理活動中有重要功能，研究顯示下調(diào)p62蛋白表達能夠抑制腫瘤增殖或轉移[2-3]。目前已研發(fā)出p62的DNA疫苗(近年正在俄國進行Ⅰ、Ⅱ期臨床試驗)，在動物模型中能明顯抑制多種腫瘤增殖及侵襲，且p62疫苗也可用于治療炎癥造成的骨質疏松[4-6]。p62蛋白與原發(fā)性骨腫瘤的關系密切，但具體作用機制不明確?，F(xiàn)對p62蛋白及其在原發(fā)性骨腫瘤中作用機制的研究進展進行綜述，旨在為原發(fā)性骨腫瘤的治療提供新思路。

1 p62 蛋白

1.1p62基因結構及其蛋白功能 人類p62基因，也被稱為SQSTM1，位于第5號染色體上的基因，包含8個外顯子，可編碼包含440個氨基酸殘基的p62蛋白[7]。這些氨基酸序列包括Phox 和Bem1p結構域、鋅指結構域、p38結合結構域、腫瘤壞死因子相關受體6結合結構域、核定位信號和核輸出信號、微管相關蛋白1輕鏈3相互作用結構域、Kelch樣環(huán)氧氯丙烷相互作用區(qū)域、泛素相關結構域等帶有結構性模體的結構域。最初p62蛋白被發(fā)現(xiàn)是一種淋巴細胞特異性蛋白酪氨酸激酶[8]，現(xiàn)可作為非經(jīng)典蛋白激酶C的結合伴侶[9]。p62蛋白分子結構中有多個功能結構域，可通過與其他蛋白質的相互作用來調(diào)控不同的信號通路，包括核因子E2相關因子(nuclear factor erythroid 2 related factor,Nrf)2、核因子κB(nuclear factor-κB,NF-κB)和自噬等，參與細胞癌變過程[10-12]。

1.2p62蛋白與腫瘤的發(fā)生發(fā)展 近年來，許多研究顯示p62蛋白與多種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展關系密切，惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展主要表現(xiàn)在增殖、遷移及侵襲，p62蛋白可以影響多種腫瘤的增殖、遷移和侵襲來調(diào)控腫瘤的發(fā)生發(fā)展[13-16]。腫瘤p62蛋白功能結構域泛素相關結構域與微管相關蛋白1輕鏈3相互作用結構域突變體調(diào)節(jié)自噬通量并減弱胱天蛋白酶8的激活，在卵巢癌細胞中,自噬降解參與p62蛋白介導的胱天蛋白酶8激活[13]。p62蛋白在食管癌組織中高表達，p62蛋白在miR-487a敲除后顯著上調(diào)，p62蛋白過表達顯著改變了小鼠的增殖能力[14]。Iwadate等[15]通過對194例原位子宮內(nèi)膜癌患者進行免疫組織化學及統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn)，高表達的p62蛋白參與了子宮內(nèi)膜癌細胞的侵襲，細胞質p62蛋白的高表達有助于提高子宮內(nèi)膜癌細胞對氧化應激的侵襲性和耐受性。小核仁RNA宿主基因16作為一種致癌長鏈非編碼RNA，通過調(diào)節(jié)p62蛋白表達，進而激活下游磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白和NF-κB信號通路，促進肝癌細胞增殖、遷移和侵襲[16]。p62蛋白主要位于細胞質，在腫瘤組織中表達水平較高，部分惡性腫瘤細胞質中p62蛋白的積累預示著預后較差[17]。目前，對于p62蛋白調(diào)節(jié)腫瘤發(fā)生發(fā)展的機制尚無統(tǒng)一說法，普遍認為p62是一種多功能蛋白，可通過自噬、Nrf2、NF-κB等多種信號通路調(diào)節(jié)腫瘤的發(fā)生發(fā)展[18]。首先，受體蛋白p62與選擇性自噬密切相關，p62蛋白的積累對腫瘤的發(fā)生至關重要，在肝癌中p62是一種異常積累的致癌蛋白，過表達可誘導肝癌并增加小鼠的腫瘤體積[2,19]。此外，自噬基因的敲除已被作為自噬的生理模型，缺乏必需自噬相關基因5和7的小鼠也會發(fā)生肝損傷、炎癥和不能進展為癌的良性肝腫瘤[20]。其次，Saito等[21]研究表明，p62蛋白的Kelch樣環(huán)氧氯丙烷相關蛋白1結構域結合Kelch樣環(huán)氧氯丙烷相關蛋白1后阻礙Nrf2的激活，并增加肝癌對抗癌藥物的敏感性，而且NF-κB負調(diào)節(jié)激活與癌癥相關[22-23]。已有研究證實，NF-κB可通過影響腫瘤的增殖、浸潤和轉移調(diào)節(jié)腫瘤的惡性行為，介導促腫瘤生成相關基因的表達參與抗凋亡及細胞周期的調(diào)節(jié)[24-25]。綜上，p62蛋白與腫瘤的發(fā)生發(fā)展關系密切，但具體機制仍不明確，可能是因為p62蛋白具有多個功能結構域，與不同信號分子相互作用所致。

1.3p62蛋白與骨代謝 骨新陳代謝的維持依賴于骨的吸收與骨形成之間的動態(tài)平衡，而這種平衡由成骨細胞和破骨細胞共同維持，其中破骨細胞在生理性和病理性骨吸收中發(fā)揮重要作用，有研究表明p62蛋白可通過平衡破骨與成骨細胞生成和限制炎癥減輕骨代謝紊亂[6,26]。大多數(shù)原發(fā)性骨腫瘤都表現(xiàn)出溶骨性，長期以來，p62蛋白被認為是破骨細胞形成和活化的重要調(diào)節(jié)劑，適配器蛋白質p62蛋白參與NF-κB受體活化因子配體促進破骨細胞的形成、自噬或NF-κB通路激活[27]。p62基因突變被認為是Paget骨病(Paget disease of bone，PDB)的主要原因，PDB是由溶骨性病變和過度活性破骨細胞表征的骨骼疾病[28-29]。PDB突變主要發(fā)生于泛素相關結構域，常見突變位點為p62p394L，唑來膦酸在p62p394L的PDB小鼠模型中可預防PDB并加速骨丟失[30]。p62基因缺陷在體外加速破骨細胞形成，并導致小鼠PDB骨表型[31]。

2 p62蛋白與原發(fā)性骨腫瘤的關系

2.1p62蛋白與MM MM是一種以單克隆蛋白產(chǎn)生和溶解性骨病為特征的漿細胞惡性腫瘤。研究證實p62蛋白在MM進展中起重要作用[32]。骨髓微環(huán)境中的MM細胞可以增加破骨細胞的分化，造成骨損傷[33]。有文獻報道通過XRK3F2(一種p62鋅指結構域抑制劑)阻斷p62鋅指結構域依賴信號可以逆轉MM誘導的Runt相關轉錄因子2抑制的表觀遺傳學機制，促進成骨分化[34]。鋅指結構域與受體相互作用蛋白結合后，能夠傳感下游通過經(jīng)典蛋白激酶C激活NF-κB[35]。目前普遍認為p62蛋白可通過調(diào)節(jié)NF-κB通路導致MM，研究表明蛋白酶體抑制劑硼替佐米可通過NF-κB治療靶點發(fā)揮作用[36]。有學者認為，阻止硼替佐米誘發(fā)的NF-κB激活可阻斷氯喹誘發(fā)自噬，減少核轉錄因子抑制蛋白退化和增強硼替佐米誘發(fā)淋巴瘤細胞的死亡[37]。NF-κB主要用于維持MM細胞生存，核轉錄因子抑制蛋白激酶復合物2抑制劑苯胺嘧啶衍生物AS602868能抑制NF-κB激活，誘導人MM細胞系的凋亡和阻斷細胞周期進展以及抑制原發(fā)性MM細胞的存活，核轉錄因子抑制蛋白激酶復合物2抑制劑苯胺嘧啶衍生物AS602868單獨使用或與傳統(tǒng)藥物聯(lián)合使用，對MM患者有一定治療價值[38]。也有報道顯示，在MM新型LP-1細胞株的耐卡非佐米衍生物中p62泛素結合物受體水平升高與卡非佐米耐藥有關，包括生存前自噬和Nrf2通路激活，闡明了MM細胞中蛋白穩(wěn)定網(wǎng)絡的復雜性，并為開發(fā)p62-Nrf2抑制劑作為克服晚期MM亞組患者蛋白酶體抑制劑耐藥性的手段提供了臨床前理論依據(jù)[39]。也有研究表明，Beclin-1和p62之間表達平衡對于MM細胞的存活非常關鍵，可以初步評估細胞對凋亡的敏感性，并且在體外自噬可以作為一種促進MM細胞存活的機制，平衡藥物誘導的細胞死亡[40]。蛋白酶體抑制劑卡非佐米的耐藥性與生存前自噬水平升高有關，而人鋅指轉錄因子Krüppel樣因子4(Krüppel-like factor 4，KLF4)被認為是促進因素，在獲得性卡非佐米耐藥的MM細胞中，KLF4蛋白的表達水平和核定位均升高，染色質免疫沉淀表明內(nèi)源性KLF4與p62基因的啟動子區(qū)域結合，該啟動子區(qū)域編碼連接蛋白酶體和自噬蛋白降解途徑的泛素結合適配器蛋白隔離體p62[41]。然而，干擾p62信使RNA的表達導致自噬體無法捕獲MM細胞中的泛素化載體，將生存前自噬轉化細胞凋亡[42]。p62蛋白或自噬基因γ氨基丁酸A受體結合蛋白1的下調(diào)降低了蛋白酶體抑制后的細胞存活率，p62蛋白的誘導需要Nrf1，同時誘導蛋白酶體基因，暴露于蛋白酶體抑制劑20 h后，細胞通過Nrf1獨立機制激活自噬和大多數(shù)自噬基因[32]。研究表明，p62蛋白豐度的降低可導致細胞內(nèi)ATP顯著減少、毒性顯著、凋亡和集落形成，沉默p62蛋白的MM細胞系在2周內(nèi)徹底死亡，相反，作為對照的2B淋巴瘤中p62蛋白的表達相對減少，導致相應細胞系很少或幾乎沒有死亡，細胞死亡前p62沉默的MM細胞系顯著增加了對硼替佐米誘導的泛素化蛋白和毒性的敏感性，而且p62的減少沒有影響獨特的抗骨髓瘤藥物阿霉素，說明p62蛋白在MM細胞系存活中發(fā)揮關鍵作用，并對蛋白酶體抑制劑產(chǎn)生特異性保護[43]。p62蛋白對于MM細胞系至關重要，是一種新的特異的骨髓瘤靶點，可能通過NF-κB信號通路或Nrf2或自噬通路發(fā)揮作用。

2.2p62蛋白與骨肉瘤 骨肉瘤是最常見的惡性骨腫瘤，好發(fā)于兒童和青少年，肺轉移最常見。目前關于p62蛋白在骨肉瘤中表達程度以及通路仍存在爭議。有學者采用免疫組織化學方法檢測70例骨肉瘤石蠟樣本，結果顯示p62蛋白在77.1%(54/70)的樣本中存在過表達，并且表達水平與腫瘤大小、轉移、臨床分期、預后不良顯著相關[44]。另一項研究顯示，p62蛋白的表達水平可能與骨肉瘤的復發(fā)、轉移、預后密切相關，與原發(fā)性腫瘤組織相比，復發(fā)或轉移性組織中p62蛋白表達降低[45]。兩項研究中p62蛋白表達程度不同的原因可能是：前一項研究發(fā)現(xiàn)，在人類骨肉瘤細胞中，p62信使RNA和蛋白水平均上調(diào)，表明該蛋白調(diào)控發(fā)生在轉錄和翻譯水平。后一項研究發(fā)現(xiàn)，在化療過程中自噬活動會增強，p62可能作為一種自噬相關蛋白，而自噬系統(tǒng)不斷降解p62?；|金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMP)-2和MMP-9已被多項研究證實，可在骨肉瘤中通過降解細胞外基質和基膜的成分促進骨肉瘤細胞遷移和侵襲[46-48]。Yu等[49]研究發(fā)現(xiàn)，雷公藤紅素通過抑制骨肉瘤細胞中磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B/NF-κB信號通路下調(diào)MMP-2和MMP-9表達，負向調(diào)節(jié)骨肉瘤的侵襲及增殖，由此推測p62蛋白可能通過NF-κB信號通路在骨肉瘤中發(fā)揮作用。而雷公藤紅素也可以通過自噬調(diào)節(jié)骨肉瘤細胞凋亡[50]。近年來，越來越多的骨肉瘤新治療策略聚焦于調(diào)節(jié)失調(diào)的自噬[51-52]。巴西蘇木素通過誘導自噬促進骨肉瘤細胞死亡，華蟾素通過活性氧類/c-Jun氨基端激酶/p38促分裂原活化的蛋白激酶信號通路誘導人骨肉瘤U2OS細胞自噬介導細胞死亡，三氧化二砷也可通過活性氧類轉錄因子EB信號通路誘導骨肉瘤細胞自噬性死亡[53-55]。氯喹可通過調(diào)節(jié)p62蛋白的表達阻斷順鉑耐藥骨肉瘤細胞的自噬過程[56]。自噬可以抑制阿霉素誘導的骨肉瘤細胞凋亡，在骨肉瘤U2OS和Saos-2細胞系中，自噬抑制可能是增加抗癌藥物有效性的一種新策略[57]。綜上，p62蛋白可能通過NF-κB信號通路或自噬來調(diào)節(jié)骨肉瘤發(fā)病。

2.3p62蛋白與骨巨細胞瘤 骨巨細胞瘤是一種交界性且具有局部侵襲性的骨腫瘤，特征為溶骨性病變，常見于股骨遠端和脛骨近端，骨巨細胞瘤單獨手術后復發(fā)率高達16.7%～39%，其中1%～3.2%可發(fā)生肉瘤樣變或肺轉移[58-61]。骨巨細胞瘤是溶骨性腫瘤，關鍵發(fā)病機制是破骨細胞活化[62]。長期以來，人們一直認為p62蛋白是破骨細胞形成和激活的重要調(diào)節(jié)劑。銜接蛋白p62通過自噬或NF-κB途徑參與NF-κB受體活化因子配體誘導的破骨細胞的生成和的激活[27]。因此，p62蛋白可能通過激活自噬或NF-κB通路調(diào)控骨巨細胞瘤發(fā)病。

3 小 結

目前原發(fā)性骨腫瘤的治療仍然依賴于手術、化療和靶向治療，隨著化療及靶向治療藥物的耐藥性及不良反應的出現(xiàn)，對于晚期腫瘤及復發(fā)患者的治療仍然存在瓶頸。p62是一種多功能接頭蛋白，與不同的重要信號分子結合發(fā)揮不同的作用，在腫瘤的增殖、侵襲、轉移過程中發(fā)揮重要作用，還可通過p62-Kelch樣環(huán)氧氯丙烷相關蛋白1-Nrf2通路、NF-κB通路、自噬通路中一種或多種通路發(fā)揮作用，但具體機制仍不明確，生物學作用及意義仍需進一步研究。目前p62的靶向治療已成為腫瘤治療的研究熱點，在多中心Ⅰ/Ⅱa臨床試驗中，已報道p62疫苗單次或聯(lián)合化療可使晚期實體腫瘤患者在8～32周內(nèi)獲得44%(12/27)的疾病穩(wěn)定狀態(tài)[63]。因此，p62蛋白有望成為原發(fā)性骨腫瘤發(fā)病的預測指標，為原發(fā)性骨腫瘤治療提供新的思路，但仍需更多臨床試驗證實。