E3泛素連接酶在缺血再灌注損傷性疾病中研究進(jìn)展

盧庚,劉恒均,江信睿,何飛,王軍

(南京醫(yī)科大學(xué)鼓樓臨床醫(yī)學(xué)院急診科，南京 210008)

翻譯后的蛋白質(zhì)經(jīng)過泛素化修飾后結(jié)構(gòu)變得更加復(fù)雜，調(diào)節(jié)更加精細(xì)，功能更加完善。根據(jù)底物蛋白與泛素分子結(jié)合的數(shù)量可以分為單泛素化和多泛素化，前者是指底物蛋白結(jié)合一個(gè)泛素分子，后者是指多個(gè)泛素分子同底物蛋白上的多個(gè)賴氨酸殘基結(jié)合。經(jīng)泛素化修飾的蛋白質(zhì)能夠被蛋白酶體特異性識(shí)別并降解，與細(xì)胞自噬共同維持機(jī)體內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)[1]。泛素化在蛋白質(zhì)的定位、代謝、功能、調(diào)節(jié)以及降解中均發(fā)揮著重要作用，幾乎參與一切生命活動(dòng)的調(diào)控[2]。目前臨床上治療缺血性疾病的主要手段仍然是盡可能地在最短的時(shí)間內(nèi)開通血管，包括溶栓、抗凝等，但在實(shí)際操作過程中，患者從發(fā)病地點(diǎn)到醫(yī)院以及在急診完善必要的相關(guān)檢查等需要較長(zhǎng)時(shí)間，導(dǎo)致血管再通后反而會(huì)加重缺血組織的損傷。缺血再灌注損傷的發(fā)生主要與自由基增多、細(xì)胞內(nèi)鈣超載、炎癥反應(yīng)、產(chǎn)生興奮性氨基酸以及一氧化氮等相關(guān)，并且它們之間相互聯(lián)系，有的甚至形成瀑布式級(jí)聯(lián)反應(yīng)，使很多缺血組織或器官即使恢復(fù)血流后功能仍難以恢復(fù)。促進(jìn)缺血組織再灌注后功能的恢復(fù)一直是臨床工作的重點(diǎn)和難點(diǎn)，但至今尚無(wú)有效的治療手段減輕缺血再灌注損傷。既往研究顯示，泛素蛋白酶體系統(tǒng)(ubiquitin-proteasome system，UPS)參與了多種缺血再灌注損傷性疾病的發(fā)展，通過調(diào)控缺血再灌注損傷細(xì)胞信號(hào)途徑中的重要蛋白發(fā)揮作用[3-4]?，F(xiàn)就蛋白泛素化修飾在缺血再灌注損傷發(fā)病機(jī)制及相關(guān)治療中的作用進(jìn)行綜述，探究泛素化對(duì)缺血再灌注損傷相關(guān)疾病的影響。

1 UPS

UPS主要由泛素、E1泛素激活酶、E2泛素結(jié)合酶、E3泛素連接酶、26S蛋白酶體和去泛素化酶(deubiquitinases，DUBs)組成[2]。泛素是真核細(xì)胞中普遍存在且高度保守的小分子蛋白，其分子量約為85 000，由76個(gè)氨基酸組成[5]。泛素在E1泛素激活酶、E2泛素結(jié)合酶、E3泛素連接酶的作用下與靶蛋白連接，經(jīng)過泛素化修飾后的蛋白質(zhì)可以被蛋白酶體降解。在ATP的作用下，E1泛素激活酶的半胱氨酸琉基與泛素C端的賴氨酸羧基形成高能硫酯鍵，從而激活泛素分子。被激活的泛素分子在E1泛素激活酶的協(xié)助下與E2泛素結(jié)合酶結(jié)合形成中間體，該中間體與E3泛素連接酶共同完成對(duì)靶蛋白的識(shí)別，E3泛素連接酶的一側(cè)與靶蛋白結(jié)合，另一側(cè)可以定位E2泛素結(jié)合酶以及識(shí)別被活化的泛素分子，從而完成對(duì)靶蛋白的泛素化修飾。經(jīng)過泛素化修飾后的蛋白質(zhì)被蛋白酶體分解為更小的肽段和氨基酸，結(jié)合的泛素也被分解下來并重復(fù)使用[6]。此外，真核細(xì)胞內(nèi)也存在大量的去泛素化酶，能夠水解泛素鏈，逆轉(zhuǎn)泛素化過程，在信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中發(fā)揮著“調(diào)節(jié)器”的作用。

2 E3泛素連接酶

目前人類基因組編碼序列中包含兩種E1泛素激活酶，50多種E2泛素結(jié)合酶以及種類繁多的E3泛素連接酶，E3泛素連接酶具備特異性識(shí)別靶蛋白的能力，不同的E3泛素連接酶識(shí)別不同的靶蛋白，從而導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)多種靶蛋白可以被泛素化修飾[6]。E3泛素連接酶在UPS中發(fā)揮著關(guān)鍵性作用，負(fù)責(zé)催化蛋白底物的泛素化修飾，從而靶向底物蛋白酶體的降解，是重要的小分子調(diào)控靶點(diǎn)。根據(jù)E3泛素連接酶特異性識(shí)別靶蛋白序列結(jié)構(gòu)域的不同可分為HECT(homologous to E6AP C terminus)型E3泛素連接酶、RING-finger E3泛素連接酶以及U-box蛋白家族。HECT結(jié)構(gòu)域是一種保守性的C端催化結(jié)構(gòu)域，其N端區(qū)域具有多種構(gòu)型，對(duì)于確定底物特異性發(fā)揮關(guān)鍵作用，并與泛素形成必需的硫酯鍵，從而發(fā)揮催化作用[7]。Xu等[8]發(fā)現(xiàn)了一種泛素，其C端攜帶有脫氫丙氨酸親電基團(tuán)，其是一種可用于標(biāo)記多種HECT型E3泛素連接酶的探針，為E3泛素連接酶的活性監(jiān)測(cè)和特定抑制劑的篩選提供了有效工具。該探針一方面可實(shí)現(xiàn)體外對(duì)HECT型E3泛素連接酶的高效捕獲，另一方面即使在細(xì)胞裂解液環(huán)境中，也可以排除復(fù)雜環(huán)境的干擾，實(shí)現(xiàn)對(duì)HECT型E3泛素連接酶的有效標(biāo)記，技術(shù)上解決了特異性針對(duì)E3泛素連接酶的抑制劑，從而為缺血再灌注損傷的分子治療提供新思路。含有RING-finger的E3泛素連接酶廣泛存在于真核生物中，環(huán)指結(jié)構(gòu)域是其最典型特點(diǎn)，是8個(gè)氨基酸(半胱氨酸和組氨酸)與鋅離子螯合形成的構(gòu)型[9]。U-box蛋白家族有著與RING結(jié)構(gòu)域類似的三維結(jié)構(gòu)，可以催化泛素與靶蛋白中的酪氨酸殘基共價(jià)連接[10]。種類繁多的E3泛素連接酶特異性識(shí)別靶蛋白常導(dǎo)致關(guān)鍵蛋白的降解異?；蚬δ芨淖?，在疾病發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮作用。目前，具有特異性識(shí)別靶蛋白的E3泛素連接酶在缺血再灌注損傷疾病中已得到廣泛研究。

3 E3泛素連接酶在缺血再灌注損傷性疾病中的作用

3.1在神經(jīng)系統(tǒng)缺血再灌注損傷性疾病中的作用 近年來缺血再灌注導(dǎo)致的神經(jīng)元損傷一直是研究的熱點(diǎn)，細(xì)胞凋亡、氧化損傷、炎癥損傷、線粒體功能障礙、蛋白質(zhì)降解失調(diào)等是缺血再灌注引起神經(jīng)元損傷的主要機(jī)制。多種E3泛素連接酶通過不同的機(jī)制在神經(jīng)元缺血再灌注損傷中發(fā)揮作用。HUWE1(HECT，UBA and WWE domain containing 1)是一個(gè)含有HECT結(jié)構(gòu)域的E3泛素連接酶,也稱為ARF-BP1、Mule、Lasu1、Ureb1、E3組蛋白以及HectH9[11]。在氧糖剝奪再灌注的原代神經(jīng)元中，HUWE1與生長(zhǎng)阻滯和DNA損傷誘導(dǎo)蛋白45β的表達(dá)在氧糖剝奪再灌注后明顯上調(diào)，兩者通過腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(brain-derived neurotrophic factor，BNDF)外顯子Ⅸα甲基化的方式促進(jìn)BNDF表達(dá)，而BNDF已經(jīng)證實(shí)對(duì)神經(jīng)元生存、生長(zhǎng)有重要作用，并在神經(jīng)元受到傷害性刺激后，減少傷害性損傷，促進(jìn)神經(jīng)元損傷后功能的恢復(fù)[12-13]。同時(shí)，生長(zhǎng)阻滯和DNA損傷誘導(dǎo)蛋白45β的表達(dá)也受HUWE1調(diào)控[14]。因此，HUWE1-BNDF途徑可能是未來神經(jīng)系統(tǒng)缺血再灌注損傷的潛在治療靶點(diǎn)。有學(xué)者建立猴腦右側(cè)大腦中動(dòng)脈缺血再灌注的缺血性卒中模型，并在此基礎(chǔ)上抑制HUWE1的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，缺血區(qū)域腦組織細(xì)胞凋亡明顯增加，神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子前體和p75神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子受體的表達(dá)明顯上調(diào)，提示HUWE1通過調(diào)控神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子前體/p75神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子受體信號(hào)通路介導(dǎo)缺血性卒中的腦缺血再灌注損傷[15]。也有研究發(fā)現(xiàn)，HUWE1可通過抑制N-Myc-Notch1信號(hào)通路的激活，介導(dǎo)神經(jīng)祖細(xì)胞L2.3的存活，減少神經(jīng)系統(tǒng)在缺血再灌注狀態(tài)下的損傷，干預(yù)HUWE1-N-Myc-Notch1介導(dǎo)的信號(hào)通路可作為治療缺血性卒中的一種新方式[16]。He等[4]發(fā)現(xiàn)，靶向HUWE1和促分裂原活化的蛋白激酶通路對(duì)腦缺血再灌注損傷有治療作用。

某些E3泛素連接酶也可加重缺血再灌注損傷。Li等[17]發(fā)現(xiàn)，E3泛素連接酶腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子(TNF-receptor associated factor，TRAF)6可通過活化Ras相關(guān)C3肉毒素底物1(Ras-related C3 botulinum toxin substrate 1，Rac1)蛋白加劇缺血性腦卒中。因此，針對(duì)TRAF6/Rac1途徑可能是未來減輕腦缺血再灌注損傷的治療靶標(biāo)。研究發(fā)現(xiàn)，在氧糖剝奪的情況下，神經(jīng)素調(diào)節(jié)受體降解蛋白1(neuregulin receptor degradation protein-1，Nrdp1)的表達(dá)顯著上調(diào)，Nrdp1可通過降解泛素特異蛋白8降低神經(jīng)元細(xì)胞對(duì)缺血狀態(tài)的適應(yīng)，進(jìn)而加重神經(jīng)元細(xì)胞的損傷[18]。這種作用在心臟中也有發(fā)現(xiàn)，Nrdp1通過降解其靶蛋白——表皮生長(zhǎng)因子受體3抑制表皮生長(zhǎng)因子受體3的功能及下游信號(hào)通路，從而加重心肌缺血再灌注損傷，未來針對(duì)Nrdp1的靶向治療策略可能減少缺血對(duì)器官的損傷[19]。

3.2在心血管系統(tǒng)缺血再灌注損傷性疾病中的作用 心臟缺血再灌注損傷時(shí)可導(dǎo)致活性氧類生成、細(xì)胞內(nèi)鈣超載、微循環(huán)障礙，同時(shí)引起心肌代謝改變以及中性粒細(xì)胞、血小板和補(bǔ)體活化，導(dǎo)致大量炎癥因子釋放和聚集，并招募大量免疫細(xì)胞引發(fā)心臟劇烈的炎癥反應(yīng)[20]。在心臟缺血再灌注小鼠中泛素蛋白酶體的活性發(fā)生改變，特異性識(shí)別靶蛋白的E3泛素連接酶在其中發(fā)揮重要作用。目前已發(fā)現(xiàn)多種E3泛素連接酶能夠加重或減輕心肌細(xì)胞缺血再灌注損傷,如TRAF、熱激蛋白70 C端相互作用蛋白、Casitas B系淋巴瘤、鼠雙微體(murine double minute，MDM)2、失神七同系物、三重基序蛋白[21]。TRAF作為E3泛素連接酶的一種，是一類胞內(nèi)接頭蛋白，具有重要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)作用，影響細(xì)胞的增殖、凋亡，具有調(diào)控炎癥反應(yīng)、調(diào)節(jié)細(xì)胞免疫應(yīng)答等功能。在心臟缺血再灌注狀態(tài)下，TRAF2被招募到受損的線粒體中，導(dǎo)致受損線粒體被蛋白酶體降解，從而減輕心肌細(xì)胞的缺血再灌注損傷[22]。Tzeng等[23]發(fā)現(xiàn)，TRAF2通過Dysferlin蛋白在心臟缺血再灌注損傷中發(fā)揮保護(hù)作用。Dysferlin是一種Ca2+誘導(dǎo)的膜修復(fù)蛋白，具有保護(hù)和維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，發(fā)揮物理屏障的作用，從而防止Ca2+誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡機(jī)制的激活和細(xì)胞功能所必需的細(xì)胞質(zhì)成分的喪失，同時(shí)維持細(xì)胞膜興奮性和肌細(xì)胞收縮所需的跨膜電化學(xué)梯度[23]。但Su等[24]發(fā)現(xiàn)，在神經(jīng)細(xì)胞缺血再灌注損傷狀態(tài)下，TRAF2加重了神經(jīng)細(xì)胞的損傷，這與TRAF2在心臟中的保護(hù)作用相反，與TRAF6在神經(jīng)系統(tǒng)缺血再灌注中的負(fù)性作用一致[17]，提示TRAF在缺血再灌注損傷中具有復(fù)雜的作用，需要進(jìn)一步研究。

還有一部分E3泛素連接酶在心臟缺血再灌注損傷中也發(fā)揮了保護(hù)作用，Casitas B系淋巴瘤1可通過增強(qiáng)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子及其受體在心臟梗死區(qū)域的作用，減少心臟缺血再灌注損傷后心肌細(xì)胞的損傷和壞死，從而改善心功能[25]。熱激蛋白70 C端相互作用蛋白既是一種E3泛素連接酶，也是熱激蛋白的輔助分子伴侶，對(duì)心肌梗死小鼠的心臟有保護(hù)作用[26]。熱激蛋白70 C端相互作用蛋白通過穩(wěn)定線粒體膜、改善缺血心肌Ca2+通道內(nèi)環(huán)境，減輕心肌Ca2+超載，從而提高心肌收縮力，發(fā)揮心肌保護(hù)作用，還可通過抑制免疫活性因子(如白細(xì)胞介素-1、核因子κB)的表達(dá)，減少心臟缺血再灌注的損傷[27]。MDM2與腫瘤的發(fā)展密切相關(guān)，被認(rèn)為是腫瘤抑制因子p53的負(fù)調(diào)節(jié)劑。MDM2可通過UPS直接降解含胱天蛋白酶富集功能域的凋亡抑制因子(apoptosis repressor with caspase recruitment domain，ARC)，也可以通過降解p53間接增加ARC的表達(dá)，但MDM2通過p53途徑間接增加ARC表達(dá)的作用遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過UPS的直接降解作用，ARC可以減輕心臟缺血再灌注狀態(tài)下的損傷，同時(shí)過表達(dá)MDM2可以提高心肌細(xì)胞在缺氧狀態(tài)下的耐受性[28-29]。

結(jié)直腸癌缺失基因(deleted in colorectal cancer，DCC)是Netrin-1的一種跨膜受體，Netrin-1與DCC結(jié)合后可導(dǎo)致內(nèi)皮型一氧化氮合酶活化，促進(jìn)一氧化氮釋放，誘導(dǎo)心臟血管生成，減弱氧化應(yīng)激引起的損傷，因而在心臟缺血再灌注損傷中發(fā)揮保護(hù)作用[30]。Zeng等[31]的研究也發(fā)現(xiàn)，E3泛素連接酶TRIM6的表達(dá)和活性增加后，激活信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子1信號(hào)通路，加重心臟的再灌注損傷。

3.3在腎臟缺血再灌注損傷性疾病中的作用 缺血再灌注損傷的核心發(fā)病機(jī)制是線粒體損傷和功能障礙，受損線粒體不僅會(huì)損害能量代謝，還會(huì)產(chǎn)生過多的活性氧類并釋放促凋亡因子，最終導(dǎo)致受損細(xì)胞死亡。線粒體功能異常是腎小管上皮細(xì)胞受損的關(guān)鍵因素，線粒體受損后激活Parkin。Parkin是一種由465個(gè)氨基酸組成的E3泛素連接酶，激活Parkin可以介導(dǎo)線粒體自噬，從而清除機(jī)體內(nèi)受損的線粒體，減輕腎臟在缺血再灌注狀態(tài)下的損傷[32-33]。研究發(fā)現(xiàn)，MDM2通過泛素化降解p53，阻礙細(xì)胞凋亡，減輕腎小管上皮細(xì)胞再灌注損傷，恢復(fù)其功能，從而在腎臟缺血再灌注損傷中發(fā)揮保護(hù)作用[34]。但有研究發(fā)現(xiàn)，VHL(von Hippel-Lindau)通過UPS降解缺氧誘導(dǎo)因子(hypoxia inducible factor，HIF)，加重缺血再灌注損傷[35]。HIF通過改變自身表達(dá)的轉(zhuǎn)錄激活因子，使細(xì)胞在不同的氧濃度下維持活性，保護(hù)器官和細(xì)胞免受缺血損傷。HIF是促進(jìn)細(xì)胞適應(yīng)缺氧環(huán)境的最重要的調(diào)節(jié)因子。Iguchi等[35]通過敲除小鼠VHL基因抑制VHL表達(dá)，減少HIF的降解，增加HIF下游血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子的表達(dá)，從而在腎臟急性缺血性疾病中發(fā)揮保護(hù)作用。

4 結(jié) 語(yǔ)

近年來，由于泛素化蛋白質(zhì)檢測(cè)技術(shù)以及相應(yīng)底物受體鑒定技術(shù)的發(fā)展，減輕缺血再灌注損傷的泛素化修飾相關(guān)機(jī)制研究取得較大進(jìn)展，因E3泛素連接酶具有特異性識(shí)別靶蛋白的能力，所以針對(duì)E3泛素連接酶的靶向藥物不良反應(yīng)更少，從而具有更大的開發(fā)潛力。因此，深入研究E3泛素連接酶，并逐漸闡明細(xì)胞內(nèi)各代謝途徑及信號(hào)通路間的相互作用，將為探尋減輕缺血再灌注損傷潛在的分子治療靶點(diǎn)，為臨床更有效地干預(yù)缺血再灌注性疾病提供更好的治療策略。